中国药理学通报Chinese Pharmacological Bulletin2022Doe；33((2)：1679~83-1679•网络出版时间：2220-12-314：37网络出版地址：htt p s：//kns.cakh net/kcms/demil/22201222.1516；222.html
抑制线粒体丙酮酸载体通过激活AMPK-ACC通路
李世英2汪艳J，
(南方医科大学1.药学院、21中心实验室,3.南方医院感染內科暨肝病中心，广东广州514515)
doi：23969//Osn.1021-1978.2222.12.212
文献标志码：A文章编号：1421-1978(2222)12-1679-25中国图书分类号：R379；24；R344.0；R345.07；R475.0；R977.3；R977.0
摘要：目的探究抑制线粒体丙酮酸载体(mitochondrial pyruvate carrier,MPC)是否通过激活腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated proteio kinase,AMPK--乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase,ACC)通路，改善棕榈酸(palmitic ocid.PA)所致HepG2细胞脂肪变性情况。方法利用PA 处理HepG2细胞作为高 脂负荷模型组，实验分为正常对照组、模型组和MPC抑制组。油红O染分析细胞的油脂蓄积情况。RT-CCR检测AMPK、ACC、CPT1A、SREBP1mRNA 表达水平。全自动蛋白分析仪检测AMPK、pAMPK、ACC、p-ACC、SREBP1蛋白表达水平。结果PA可以诱导HepG2细胞胞质内聚集大量环状脂滴，降低pAMPK、pACC蛋白表达水平，提高SREBP1基因以及蛋白表达水平。MPC抑制剂UK5099可以减少PA所致HepG2细胞胞质内脂滴数量，提高pAMPK、pACC蛋白表达水平，降低SREBP1基因以及蛋白表达水平。结论体外抑制MPC可以明显改善PA所致HepG2细胞脂肪变性。激活AMPKACC信号通路，可能是MPC抑制剂防治非酒精性脂肪性肝病(nwAmodobc fatty liver disease；NAFLD-肝细胞脂肪变性的重要作用机制之一。 关键词：脂质堆积；HepG2细胞；棕榈酸；线粒体丙酮酸载体；非酒精性脂肪性肝病;AMPKACC通路 非酒精性脂肪性肝病s nou-alcoUolle fattp liver
收稿日期：2029-77-06，修回日期：2020-09-02
基金项目：国家自然科学基金资助项目(No81277522-；深圳市三名工程项目(No SZSM201911001-
作者简介：李世英(1673--，女，硕士生，研究方向：非酒精性脂肪性肝病药理学,E-mail:；
汪艳(1973-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向：
慢性肝病基础与临床转化，通讯作者，E-mSl：yanwang@
smu.eXn.ca diseasa；NAFLD-的主要特征为肝细胞脂肪变
性U-4o细胞中的脂肪积累和处置之间的失调是导致肝细胞脂肪变性的主要原因⑷。线粒体丙酮酸
载体(mitochondrial kyruvate easier,MPC)于2012年
被发现，其主要功能是将细胞质中的丙酮酸转运至
线粒体中。丙酮酸是一种重要的代谢中间体，参与糖异生、脂质新生、胆固醇合成以及维持三羧酸循环[5-4]o因此,MPC在糖、脂质代谢中起着关键作用。研究发现,MPC是NAFLD的潜在靶点U]0抑制MPC可以促进NAFLD患者肝脏的脂质代谢，显著改善患者的脂肪变性情况⑷，但是关于MPC抑制剂调控脂肪变的分子机制仍不明确。
以往文献报道，正常小鼠敲除MPC6基因，腺苷
酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinosa；
AMPK)信号通路、脂肪酸p氧化途径被激活。可
见，肉毒碱棕榈酰基转移酶lA(carnOine palmitoyi-
transferasa1A,CPT1A)表达上调。而脂质生成的相
关基因乙酰辅酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase, ACC)则显著下调^-^o这些文献报道提示，MPC 与AMPKACC通路可能存在调控作用，然而至今尚未有研究证明，这种调控作用是否与肝细胞脂肪变性有关。
棕榈酸(palmitic acid,PA)诱导HepG2细胞建
立体外高脂负荷模型常被用作模拟体外NAFLD模型[I6]o因此我们选择这一体外模型研究MPC活性的抑制对细胞脂质堆积的影响及其分子机制，旨在 探索抑制MPC对PA所致HepG2细胞脂肪变性以及AMPKACC通路进的影响，为改善NAFLD肝细胞脂肪变性提供线索。
1材料
1.1细胞来源HepG2细胞(批号:x P z-230-，购自
美国ATCC公司。
防水摄像头
1.2试剂PBS溶液(批号：C10010500BT)、
2.05%胰酶(批号：25200256-DMEM高糖培养基
(批号：C11995500BT)、胎牛血清(批号：10299C46)
购自Gibca公司；PA(批号:PP522-12)购自Sigma公
司；MPC抑制剂UK5299(批号:52399-37-1-购自
-1686•中国药理学通报Chinese Pharmacological Bulletin2420Dcc；33(12)
MCE公司；CCK5检测试剂盒（批号：C0037）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）（批号:：T O
0DS）购自碧云天公司；总RNA提取试剂盒RNAisa Plus（批号:T9109-J RT-PCR反应扩增试剂盒（批号：RR047A）购自TabaRu公司；油红0染试剂盒（批号:BB-24416-6）购自广州一科生物科技有限公司; p-AMPK（批号；2535T）抗体购自CST公司；AMPK 抗体（批号：aU32047-、p-ECC抗体（批号：aU65171）,ACC抗体（批号：aU45174）、5REBP1抗体（批号:aU193318）购自Abeam公司。
1.2仪器酶标仪（美国BID-OEK公司）；电子分析天平（BS610S型，北京赛多利斯天平有限公司）；高速台式离心机（MIKR0200,Hett/h公司）；实时荧光定量PCR仪（7700型，ABI公司）；PCR扩增仪（ETC511，苏州东盛兴业科学仪器有限公司）；Nauv-D/p2600核酸超微量测定仪（GNM17144,Genom）；全自动蛋白质定量检测仪（Was，美国Protein Sio-piv）；倒置相差显微镜（倒置TSD0,NIKON）；明场正置显微成像系统（德国Leica）o
2方法
2.1细胞培养和主要试剂配制细胞在含有D% FBS的完全培养基中进行培养。等细胞长到接近99%，用0.25%胰酶对其消化、传代。PA配制为5 mol•L-的母液，于-26C冰箱中保存备用。将MPC抑制剂UK5099配置为0.05mol•L-1的母液，于-26C冰箱中保存备用，再根据实验需要稀释为各浓度。
22CCK8测定细胞活力为了确认不同浓度PA 以及MPC抑制剂UK5099是否会对细胞活性产生显著影响，
我们在实验之前利用CCK5对HepG2细胞的活力进行检测。将HepG2细胞铺在99孔板中12将培养液改换为以下培养基：正常对照组：高糖完全培养基;PA组：0、0.1、0.55.0mmol•L-PA的完全培养基；MPC抑制组：0、10、20、50 j mol•L-UK5099的完全培养基，培养24h或者48h o然后弃去孔板中的培养液，改换为含10% CCK5的基本培养基处理细胞66miu，记录酶标仪450um波长处所测得的吸光度。细胞相对存活力为各实验组的所测得的吸光度与正常组所测的的吸光度之比。
2.2细胞的分组将HepG2细胞使用胰酶消化后，重新种植于6孔板上。次日改为无血清的培养基饥饿24h o细胞分组：换上含完全培养基为正常对照组，含0.5mmol•L-1的PA的完全培养基作为体外高脂负荷模型组，添加了D j mol•L-1 UK5099245mmol•L-的PA的完全培养基作为抑制剂组，继续培养48-收集细胞的总RNA或蛋白用于后续实验。
22Reel-time PCR检测目的基因的表达4C条件下使用TRIzol技术提取总RNA，按照说明书操作方法制备cDNA o然后在ABI P/sm7700PCR仪利用SYBR Green-BSAed Real-tiov PCR进行分析。检测以下目的基因：AMPK.ACC j SREBP1、CPT1A，以GAPDH为内参基因。以上目标基因的表达，采用2_M C T法计算相对表达量。每个基因重复测定3次。引物序列见Tab l o
2-2全自动蛋白质定量检测仪定量检测相关蛋白表达于4C条件下使用含PMSF抑制剂的RIPA 试液提取总蛋白，根据BCA试剂盒检测其浓度，并调整样品最终上样浓度为lyL"。于全自动蛋白质检测仪定量
测定AMPK j p-EMPKj ACC、p-ECC、SREBP1蛋白的表达水平，以GAPDH为内参蛋白。运用全自动蛋白质定量检测仪配套软件Compass for SW软件对靶蛋白的条带密度值进行统计分析。
22油红O染观察脂质堆积用一次性吸管去除各孔原培养液，用适量PBS清洗后加入浓度为4%的中性甲醛，暗处处置D mix；用蒸馏水洗去固定液；然后加入油红0工作液，密封处理后，在37C 避光静置34mix；弃去工作液，蒸馏水冲洗；利用显微镜进行观察，镜下显示脂滴阳性结果为胞质呈橘红。油红0染定量方法：弃去6孔板中的PBS，将6孔板置于干燥通风处，使每孔中的水分挥干。用异丙醇对溶解在脂滴中的油红0进行萃取，即每孔加入220j L异丙醇，密封，置于37C摇床22min，将提取液转移至96孔板中,O20j L异丙醇作为调零孔，于酶标仪490nm处检测各组的OD值。
Tab1Sequence primee of selectee genes
Gene Fouvard primes(5,—3，)Reverse primes(3'—>5')PCR size AMPK TCGACAGAAGATTCGGAGCC CTTGGAGTTCGAAAAGTCCGT75bp ACC ACTGATGGCCAGATTCAAGC CTCCTACCACAAGTGAGCCA143bp SREBP1ACAGCCATGAAGACAGACGG CTACGCCTCTTCGACGGATA158bp CPT1A TGCTTTACAGGCGCAAACTG GGTCGTGTACTCTCTGTCGT156bp GAPDH CCCACTCCTCCACCTTTGAC GGTCGTTCTCGTGTTCTCCT283bp
中国药理学通报 Chiase Pliarmrcdogicra Bulletin 2020 Dvc;36(12)
-1686 •
2.7统计学分析 实验数据都按照p ±e 表示，多 组间比较用单因素方差分析，各组间两两比较利用 q 检验。
3结果
3. 1 不同浓度PA 、MPC 抑制剂UK5099对
HepG2细胞活力的影响 用CCKA 法检测不同浓 度PA 、UK5099对HepG2细胞活力影响，结果如Fig 1A 所示,2、2. 6、2. 5 mmot • L - PA 处理 24、48 h 对
细胞活力均无影响；6、2 mmot • L _1 PA 抑制了 HepG2 细胞活性。女口 Fig IB 所示，14 pnot • L 6
UK5099处理49 h 对细胞活力无影响，20D pnol • L-6 UK5299处理20 I 抑制HepG2细胞活力。本
实验为了排除UK5299对PA 所致肝细胞脂肪变和 AMPKACC 通路的影响是由于抑制HepG2细胞活
力引起的，我们最终选择对HepG2细胞活性影响不 大的浓度，即2. 5 mmot • L - PA 以及14 p mh • L 6 UK5099处理49 a 为后续实验浓度以及时间点。
3.2抑制MPC 可以改善PA 所致HepG2细胞脂
质堆积的情况 结果如Fig 2显示，2. 5 mmot • L 6 PA 处理49 I , HepG2细胞胞质内油滴数量大小及
含脂滴细胞数量明显增加(P<2.46)，呈环状聚集 于胞质内；2.5 mmot • L"6 PA 添加 14 pmot • L"6 UK5099处理49 h，胞质内脂滴数量、大小及含脂滴
细胞数量明显减少(P<2.46)o 可见，MPC 抑制剂 UK5099可以改善PA 所致HepG2细胞胞质内脂质
150r —24h
遂48h
堆积情况。
3.3 体外抑制MPC 通过激活AMPK-ACC 通路 改善脂质堆积情况 RTACR 结果如Fig 3显示,
2.5 mmot • L"6 PA 处理HepG2细胞49 h，可以提高
ACC 、S REBP6 mRNA 的表达水平(P<2. 26)，并降 低 AMPK(P<2. 46)、CPT1A (P<2. 25 - mRNA 的表 达水平；与 2. 0 mmot • L"6 PA 组相比,2.5 mmot • L - PA 添加 14 pmol • L - UK5099 处理 49 h，可以
降低 ACC 、SREBP6 mRNA 的表达水平(P<2.46), 并提高AMPK 、CPT1A mRNA 的表达水平(P <排线焊接
2.46)o
全自动蛋白分析实验结果如Fig 4所示,2.5 mmot • L"6 PA 处理HepG2细胞49 h ，可以降低细 胞的y-CMPK 、p-ACC 蛋白表达水平(P<2. 26)，并
且提高 AMPK(P<2. 45)、ACC (P <2. 26 -、SREBP6
(P<2. 46)蛋白表达水平；与2.5 mmot • L-6 PA 组
相比，2.5 mmot • L _1 PA 添力口 14 p mot • L _1 UK5099处理49 h，细胞的y-AMPK 、p-ACC 蛋白表 达水平均明显升高(P<2.26) , ACC 、SREBP1蛋白 表达水平均降低(P<2.46), AMPK 蛋白表达水平
无显著变化。
4讨论
肝细胞脂肪变性是NAFLD 的主要特征，因此探
索肝细胞脂肪变性的分子机制对该疾病的诊治尤为 重要。在本实验，为了排除高浓度的PA 或MPC 抑
15°「|—|24h
遂48h
进言
q s A
I P O
00
1±50
Control 0.1 0.50
1
2
—
r 0011—
r 50*
*0
Control 1020
50
g = 4)
PA
PA+UK5099
Fio 1 Cel l viabinte of HepG2 cens treyten with differenS cencentrohons of (A ) PA of (B ) UK5599 ( ±e .
P < 2. 05 , * * P < 2. 06 ee coutrot grounc
Control
Fio 2 Iptrocellular lipin accumulation in HepG2 celis treyten with PA and UK5099 (scale bao 55 pm ) ( ± e P < 2. 26 , ^P < 2. 06 ee PA )1X32；
10
5 O
o l x u u q u n u ! I R W U a E A
G o )
5
11
##
Control PA PA+UK5099
,g 二4
)
-1752 •
中国药理学通报 Chieese Pharmncologicnl Bulletin 2020 Dec ；33( (6)
Fin 3 Effect of UK5599 trertmeei on relativv mRNA levvU of AMPK-ACC pChways in HepG2 cells trertee with PA (( ± s , n = 6)
* P <0. 00 , * * P <0. 01 cs control gnup ；##P <0. 01 cs PA g/up.o
2.
I I Control
u o
倉
Q J d x o 日o -s J d m &I Q u
o
o.e
.5
L
o.Control PA PA+UK5099
Fin 4 Effect of UK5599 trertmeni on pretein levvU of
AMPK , p-AMPK , ACC , p-ACC , SREBP1
in HepG2 celk trerted with PA (( ± s , n - 3 )
* P <0. 05 , * * P <0.21 as control gnup ；##P <0. 01 as PA g/up.
制剂UK5099对HepG2细胞的毒性作用，干扰 UK5099改善PA 诱导的肝细胞脂肪变性，是由于
UK5099对HepG2细胞的毒性作用，还是UK5099
通过激活AMPK-ECC 通路所导致的，因此我们首先
利用CCK-5实验，选出对HepG2细胞的毒性作用较 小的低浓度PA(0.5 mmol • L-1) j 低浓度UK5099
(17 jmol • L")进行后续分子机制相关实验。实 验结果表明，低浓度UK5099可以明显改善PA 所致
HepG2细胞脂肪变性。
AMPK-ECC 通路在体内脂质代谢中具有关键
调控作用J 4]o ACC 可以控制丙二酰辅酶A 的生
成，进而参与脂质新生，并且能下调cptir ，抑制脂
肪酸氧化J 5] o AMPK 在调控ACC 活性中具有关键
作用通过磷酸化激活后，进一步磷酸 化ACC，使后者失去活性，进而抑制脂质新生，并上 调CPT1A 的活性，从而促进肝细胞脂质分解J 4]o 我们选用PA 诱导HepG2细胞建立体外高脂负荷模
型，添加MPC 抑制剂UK5099加以干预，探究MPC 在肝细胞脂肪变性中的作用。本研究通过油红 O
染实验、RT-PCR 以及全自动蛋白质量分析实验
首次发现,0. 5 mmol • L'1 PA 诱导HepG2细胞48 h 后，胞质内油脂堆积水平明显提高,p-EMPK 、p-ECC 蛋白表达水平明显降低，SREBP1蛋白表达水平则 明显升高。进一步的抑制MPC ，则可逆转榈酸所致
HepG2细胞脂质堆积情况，同时能够提高p-EMPK j h-ACC 蛋白表达水平，降低脂质合成关键因子
SREBP1蛋白表达水平，并提高脂肪酸0氧化关键
基因CPT1A mRNA 的表达水平。说明MPC 抑制剂
可以激活AMPK-ECC 通路，改善肝细胞脂肪变性情
况。
综上可知，体外抑制MPC 可以通过激活
AMPK-ECC 通路，改善细胞脂质堆积情况。本实验
初步阐明了 MPC 与脂质代谢机制，为后续
NAFLD 肝细胞脂肪变性提供科学依据。由于时间记忆辅助
限制，抑制MPC 活性对脂质堆积的影响的功能研究 中，仅从降低其活性单方面验证了这一现象，尚未进
行增强表达MPC 对脂质代谢的影响。今后的研究 中将利用细胞转染、转基因小鼠等进一步完善这部 分内容，此外，MPC 是否可以调控其他脂质代谢相 关通路有待进一步探索。
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Ichioiting mitochondrial pyruvate carrier impruven lipin accumulation io HepG2celis10x11with palmitic acin through activating AMPK-ACC pathway
LI SSi-yUy1,WANG You1，2,5
(1.Sciool p Pharmaceutical Scieme, 2.Central Lab, 3.Dept p egectiour Diseaser anU Loes Ugg
柱层析Naghng Hospital SontUeru MePical University,Guangzhou514515,ChOa)
Abstruct:Aim Ta investigaiv tha effeci of inVibitiny mimchonU/ai pyuvala c/wivv(MPC)bp activatiny tha AMP-sc/vvteP putein kinasa(AMPK)-scetyl-CoA cyrkoxylasa(ACC)signaliny pWhwvy on impuviny tha lipik nccumulatiou in HepG2calls treated with palmitic ocik(PA)anU ils mahwism.Methods Tha HepG2 cells were treated with PA/estaVlisk v steatosis moh-2.Tha experimeni mclu/ed n coutul auup,n mohel auup anU MPC inUibitav treat/eni auup.Oil red0 staininy wvs used/examina tha lipik vcchmulatiop. Chanyas in tha mRNA axpussion of AMPK-UCC path-wvy related aena AMPK,ACC,cyuitina palmitoyl-transferasa1A(CPT1A),Steul reaulatoy a/manl-binUiny putein1(SREBP1),which were related with lipik metabolism were assessed bp RTLCR.Tha2-pussUp of AMPK,y-UMPK,ACC,P-UCC,SREBP1 putein level wvs UetecteP bp automatic putein wWy-zev Restlts PA significyn/y in/uced lipik vccumu-la/ou,rePuceP tha expression of p-UMPK,p-UCC putein level,anU incrensed tha expression of SREBP1 aena anU putein leveh MPC inUibitaf UK5097Vv-crensed tha numbav of celi-coutaininy lipik Uuplels in-Uuced bp PA,incrensed tha expression of p-UMPK anU p-ACC putein level,anU Vecrensed tha expression of SREBP1aena an/putein levah Conclusions In cohclusiou,inUibiVny MPC con prevenl tha lipik yeeu-mulatiou of PA-inUuced HepG2cellsc Ta oc/vaiv AMPK-UCC signaliny puhwoy migUl ba oxa of tha most impoUani mechanisms of MPC mUikiuV s preven-tiox anU treat/eni of nop-alcoPollc UpWic stea/sis. Key worls:lipik nccumula/ox；HepG2cell；palmitic ocik;miUchonVUm pyuvala cowivv;nop-alcoPollc fattv livvv hisensa；AMPK-UCC pWhwws
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