第37卷第2期2021年1月
Vol.37N b.2
J*-.2021甘肃科技
Gansu Science and Technology
胆南星中猪、牛、羊源性成分实时荧光PCR检测田妮娜！，朱仁愿！，刘荔！，邵长春，王月玲！，宋玉霞 （1.兰州市食品药品检验所，甘肃兰州730050；2河西学院，甘肃张掖734000）
摘要：基于TaqMan探针RT-PCR技术，建立胆南星的牛、羊、猪源性成分鉴定方法。以提取的DNA为模板进行TaqMan探针RT-PCR检测样品中的牛、羊、猪源性成分。建立的方法特异性良好，牛羊猪源性成分的检出限分别为0.1、0.001和0.001ng/!l，可用于检测胆南星中的胆汁来源
关键词:TaqMan实时荧光PCR；胆南星；动物源性成分
中图分类号：S188
胆南星是一种常用的中药材，为天南星与牛、羊或猪胆汁经加工或发酵而成叫有息风定惊、清热化痰之功效，临床上多用于、、中风等疾病的疗；现行版药典中对胆南星的检测项目包括性状鉴别、显微特征鉴别和理化反应鉴别三项。近年来，关于胆南星的研究颇多，主要是以胆汁中的胆汁成分为指标性成分，用薄层
法、法等技术方法、药效学、方的。但是，胆南星中羊猪源性成分的检测&为胆南星中胆汁的来源，对胆南星的动物源性进行鉴别&是因为丨动物、来源的胆南星，药效可能存在一定差异。例如，发现胆汁的胆南星胆成分热用存在差别叫时胆南星的种来源对、羊
疾病的传播有重要作用。因此，建立鉴别胆南星动物源性的方法对胆南星的有&，关于胆南星品多有，广州市住药检所发现一种胆南星品，用鉴
别方法未检出胆酸、猪去氧胆胆酸839；浙江省长兴县中医院发现一种深灰的经压制加工而成的胆南星伪品叫江苏省泰州市药品检验所仇雅静发现人工造的假胆南星，镜下检出大量泥砂及叶、果实组织；由上述可见胆南星伪品较多，市场情况比较混乱8珥因此，为了能的鉴别胆南星的来源与混伪品，建立鉴别胆南星动物源性的方法样意义重大。
以DNA为基础的检测方法是目前动物源性检测领域的常用方法。胆南星由牛、羊或猪胆汁制成，故本文拟采用TaqMan探针法，参照牛羊猪源性成分实时PCR检测方法冋，选用实时荧光定量PCR法对胆
南星中牛羊猪源性成分进行鉴定并进行讨论&采用双标记荧光PCR技术，根据动物种间多态性的差异，对线粒体DNA基内参照同时进行扩增，通过两种不同荧光物质（FAM、VIC）的特异性探针进行鉴定。
1仪器与材料
艾本德5810R高速台式离心机，艾本德Biospectrometer Basic紫外分光光度计，赛默飞世尔科技QuantStudio7Flex实时荧光PCR扩增仪，牛、羊、猪实时荧光PCR试剂盒选用takara Real Time PCR Porcine/Ovine/Bovine DNA Detection Kit；提取试剂盒选用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒。胆南星，参考《中国药典》的方法，选用天南星加牛、羊、猪胆汁发酵制成。商品胆南星（四川百胜药业有限公司和四川千方中药有限公司），经兰州食品药品检验所中药鉴定为品&实验中以天
南星加胆汁发酵制成的样品作为DNA提取、扩增性对照&
2方法与结果
2.1DNA的提取
乐谱架将样品打碎后，用试剂盒或核酸提取仪提取
*基金项目：“甘肃省药品科研项目（编号:2019GSMPA004）”△通讯作者：宋玉霞，女，河西学院。
第2期田妮娜等：胆南星中猪、牛、羊源性成分实时荧光PCR检测61
DNA，方法如下：取预先处理好的样品约20mg，置于1.5mL离心管中，加300^1缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。加入30^1蛋白酶K溶液，混匀#置56!金属浴中过夜至完全裂解，离心，然后用试剂盒或核酸提取仪提取DNA。
2.2DNA浓度和纯度的测定
利用紫外分光光度计测量所提DNA浓度及A260nm/A280nm，经测定,A260nm/A280nm的值均＞1.7，表明可用于PCR实验等后续的操作。同时将浓度稀释至2#10ng/!1，于-20!保存备用#
2.3引物和探针
采用Premier5.0引物设计软件，经比对后选取猪、、羊的，内参基因引物探针序列选用真核生物18SrRNA基因，均由大连宝生物
2.3.1猪"蛋白基因检测用引物探针序列
5'端引物：5'—TTTGTGCATGCTGCGTCAAC—3'
3'端引物：5'—CTTGGTGGTCGTGGTCACTGT—3'
探针：5'—FAM—CACCGTCAAGCAGC—(NFQ) (MGB)-3'
2.3.2羊线粒体细胞素b基因检测用引物探针序列
5'端弓IW：5'—ACACAACTTCTACCACAACCE—3'
3'端引物：5'—AAACAATGAGGGTAACGAGGG—3'
内作探针:5'—FAM—ACACCGAAACAAAATACTCC TTGAGAAACA-(TAMRA)-3'
2.3.3牛生长激素基因检测用引物探针序列
5'：5'—CCGATGGATGTTCAGAGCT—3'
3'：5'—GCCAAATGTCTGGGTGTAGAT ACC—3'：5'—FAM—TGGGCTTTAGGGCTTCCG AATGAATGTGAA—(TAMRA)—3'
2.4反应体系与反应条件
反应体系(总体系25^1)：2XPremix12.5!1，引物、探针和模板DNA1M。
反应条件：95!预变性10s,1个循环；95!变性5s,60!退火30s,40个循环。
2.5实时荧光PCR结果判定
PCR反应完成后以Ct值判定结果。阳性对照FAM和VIC有荧光信号检出，的扩增曲线且Ct值于28.0；VIC荧光信号检出而无FAM荧光。若样品Ct值大于35.0或，表明不含所测的动物分。若样品Ct值小于等于35.0并出现典型的扩增，表明含所检测的动物源性成分叫
2.6特异性试验
分别取天南星加牛、羊、猪、鸡发酵的样品，共4份样品，进行荧光定量PCR测试验。根据典型扩增曲线和各反应体系循环阈(Ct(值的不同来验证牛、羊、于同动物的DNA的。如1所，试验表明天南星加牛、羊、样品的DNA提取液中分别仅检出相应的分，而未检出其他三种动物源性成分。说明的检测方法对胆南星牛、羊、分检测具有特异性。
牛源性成分立式干粉搅拌机
猪源性成分
FAM：基于FAM信号通道的扩增曲线,VIC：基于VIC信号通道的扩增曲线
图1牛、羊、猪源性成分特异性试验
2.7检出限试验
将10n(/!1的牛羊猪DNA提取液加灭菌双蒸
10度稀释，稀释至最低浓度为0.0001ng/!1，以不同稀释浓度的样品DNA为模板进行荧光定量PCR扩增反应程序，进行检出限检测的检测试验。结果如图2所示，分可检测到的最低样品浓度为0.1,0.001和0.001n(/!1
。
62甘肃科技第36卷
牛源性成分
实时监控系统
羊源性成分
2.8动物源性成分检测
cn-m分别用牛、羊、猪源检测试剂盒进行实时荧光PCR反应。结果显示，四川百胜药业有限公司和四川千方中药有限公司各3批胆南星样品中均不含有牛、羊源性成分，但都含有猪源性成分&结果如图3所示。
牛源性成分
羊源性成分
塑料围嘴猪源性成分3讨论
本研究采用的TaqMan探针实时荧光PCR方法能有效鉴别胆南星中的动物源性成分。且方法简便，只
需配好反应体系，设置好实时荧光PCR仪的参数即可，免去了常规PCR检测电泳和DNA测序等步骤，同时避免了PCR产物的污染和漠化乙锭带来的危害，反应只需lh[8]，适用于胆南星中的动物源性成分快速鉴别。
不同动物胆汁所含化学成分大体相同，理化鉴别方法胆南星胆的源,
分子鉴别方法在物种鉴别方面优势明显。本研究通过摸索胆南星药材的DNA提取方法、参照《SN/T 2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时PCR法》的引物和探针，并对方法的性和检限进行检，性的胆南星中动物源性成分的DNA，胆南星动物源性成分检性，胆南星中胆
的源，胆南星的鉴，胆南星药，促进与该品种相关的中药市场的健康发展有重要意义。
参考文献：
[1]国家药典委员会•中华人民共和国药典⑸•一部•北京：
中国医药科技出版社，2015：261.
[2]陈江宁，单国顺，赵启苗，等.不同胆汁制胆南星中胆酸类
成分及其解热作用比较[J].现代药物与临床,2017,32(04)：567-571.
[3]何倩京•胆南星及其伪品的鉴别[J]广东药学,1998(04):24.
[4]沈忠明.胆南星与其伪品的鉴别[J].时珍国医国药,2000
(08):712.
[5]仇雅静，易毅仁.一种胆南星伪品的鉴别[J].时珍国医国
药,2001(06):514.
[6]罗建兴，海小，刘国强，等•利用实时荧光定量PCR法检测
食品中鹤鹑源性成分[J].食品研究与开发,2019,40(03): 177-183.
[7]王自强，何素婷，邵泓，等•肝素钠中猪、牛及羊源性成分的
PCR检测[J].中国药师,2015,18(09):1506-1511.
[8]周建华，李松播，王自强.玻璃酸酶粗品中猪、牛、羊源性
成分的PCR检测[J].中国医药工业杂志,2018,49(06):
796-802.
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