一种番茄青枯病拮抗细菌WJB0802及其应用

一种番茄青枯病拮抗细菌wjb0802及其应用
技术领域
1.本发明涉及番茄青枯病防治领域，更具体地涉及一种番茄青枯病拮抗细菌wjb0802及其应用。

背景技术：

2.番茄原产于美洲大陆，大约十六、十七世纪作为观赏性植物传入我国。上世纪50年代我国的种植规模迅速发展，随着多年连作病原菌和番茄中可能带有的毒素在土壤中积累，导致了青枯病等土传病害的严重发生。番茄青枯病(bacterial wilt disease)是由ralstonia solanacearum引起的番茄细菌性枯萎病，在全球严重威胁着热带和温带番茄作物的生长。近些年，随着设施番茄大棚的种植面积的扩大以及高温高湿的土壤环境，给青枯病发展提供了有利条件。青枯病是世界上最具破坏性的植物细菌性土传病害之一，分布于全球各大洲；其致病菌茄科劳尔氏菌具有多样性高、寄主范围广等特点(可侵染50多科200多种植物)，据不完全统计，青枯病引起的经济损失高达30万/公顷，尤其我国山东、新疆、内蒙古、河北、河南、云南、江苏等地番茄青枯病发生严重，常常造成毁灭性灾害。目前还没有有效措施管理这种土传病害。此外，若大量使用化学杀菌剂会导致农药残留而造成土壤和水污染，从而影响到人类的健康和发展。同时会引起病原菌产生抗性。因此，非化学方法包括培养方法、抗性品种和拮抗细菌剂的生物防治对管理番茄青枯病具有重要的意义。然而，由于抗病品种缺乏稳定性和耐久性，因此并不完全有效。采用生防策略控制该病害，以番茄为模式植物开展青枯菌相关研究。
3.青枯菌主要从番茄的根际部分侵入，也能从植物的茎部伤口进入导管内，吸收植物内的营养物质从而大量繁殖并产生代谢物质，阻碍植物体内的水分运输，继而使植株发病。番茄青枯菌可随病残植物体在土壤中存活大约1～6年。在田间能通过雨水和灌溉水传播，也能通过人畜、农具、带菌土壤和昆虫等传播。生物防治剂(bcas)是一种自然生长的土壤微生物，它可以积极地攻击植物病原体，抑制疾病的发生，并帮助控制害虫和杂草的生长。已有研究利用木霉、芽孢杆菌和假单胞菌等防治方法对番茄青枯病进行了控制。
4.环境友好型生物杀虫剂和有益微生物是化学杀虫剂的替代品。利用芽孢杆菌属对植物病害进行生物防治，其防治机制主要通过其代谢产物及其产生的抗菌活性物质对病菌起到抑制作用，并诱导植物的系统抗性。据报道，对植物有益的芽孢杆菌属还能有效的在根际定植，并显示出促进植物生长和/或疾病抑制活性。研究发现，解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巴氏芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和球形芽孢杆菌重的某些特定菌株可显著降低多种宿主上各种疾病的发病率或严重程度。这些菌株能诱导番茄植株产生的系统抗性(isr)已在温室或田间试验中得到证明。植物病害的生物防治方法研究已被证明是环保的，对许多植物病原体有效，并被认为是植物病害管理的长期解决方案。
5.董等从青枯病发病田间的健康番茄根际土壤中分离出了对青枯菌具有显著的抑制作用的黏菌r31，黏菌r31对青枯病的生物防治效果为81.09％；同样，manigundan等从尼尔吉里斯番茄根际土中分离的链霉菌ut4a49对番茄青枯病具有较好的抑菌能力，在盆栽试
验中，通过生物有机肥修正后其对番茄青枯病的生物防治活性为78.5％；而hardiyanti等从香草根际中分离出13株香草枯萎病有效拮抗菌，其中7菌株均能达到60％以上的抑制率；abraha等从南非多个果园木瓜和柑橘品种果实表面分离得到了10株对柑橘指状青霉病具有拮抗作用的酵母菌，其中分离株b13对在接种后能显著降低发病率(低于5％)阻止脐橙和柠檬的腐烂，防控效果最佳。
6.由此可见，微生物制剂的使用已被广泛地研究和应用于各种作物，而从作物的根际进行拮抗微生物的分离筛选可以作为一种环境友好的方式来管理作物疾病，因此根际细菌作为生防菌剂的选择对象具有不可忽视的重要作用。

技术实现要素：

7.本发明的目的是提供一种番茄青枯病拮抗细菌wjb0802及其应用，从而解决现有技术中番茄青枯病造成经济损失严重，但又缺乏有效的番茄青枯病的生物防治手段的问题。
8.为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
9.根据本发明的第一方面，提供一种番茄青枯病拮抗细菌wjb0802，所述番茄青枯病拮抗细菌wjb0802分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，于2022年8月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为gdmcc62697。
10.根据本发明的第二方面，提供一种番茄青枯病拮抗细菌wjb0802在防治番茄青枯病中的应用。
11.根据本发明的一个优选方案，所述应用包括以下步骤：s1：将所述番茄青枯病拮抗细菌wjb0802接种于tsb液体培养基中，32
±
2℃、180～200r/min振摇培养至对数期，在4000～6000rpm条件下离心8～12min，用无菌水重悬，调整od
600
为0.8～1.0，备用；s2：番茄种子播种于育苗盆中，待幼苗长至15～20cm高时，移栽至盆中；s3：采用步骤s1备好的菌液对植株进行灌根处理，用量为30～50ml/株，即可实现对番茄青枯病的防治。
12.优选地，步骤s3包括：幼苗移栽3天后采用菌液进行灌根处理，每隔5天施加一次菌液，共计3～5次。
13.根据本发明的第三方面，提供一种番茄青枯病拮抗细菌wjb0802在制备防治番茄青枯病的生防菌剂中的应用。
14.根据本发明的第四方面，提供一种番茄青枯病拮抗细菌wjb0802在制备促进植物生长制剂中的应用。
15.优选地，所述促进植物生长制剂为微生物菌剂或微生物肥料。
16.众所周知的是，由青枯雷尔氏菌侵染引起的番茄青枯病是一种波及范围广、危害严重的土传病害，番茄受到感染后商品价值大大降低。若长期使用化学杀菌剂不仅会造成农药残留污染，危害人类健康，不符合食品质量安全的标准，甚至会诱导致病菌产生抗药性，使防效大大降低。因此，通过生物防治控制植物病害是有效的途径，并且具有深远的意义。
17.快速、高效、精准的筛菌体系不仅对高效拮抗菌株的选定具有重要的意义，同时是推进青枯菌生防研究的关键要求。常规的筛选方法如种子细菌化、土壤淋洗和根系细菌化
(在生长植株中)来评估生防菌在不同寄主植物条件下拮抗青枯病的能力，比较费时费力。本发明通过agarwal等建立的根浸水培法复筛，将拮抗功能菌株接种于番茄幼苗根部，在水培条件下快速筛选对青枯菌具有拮抗作用的细菌菌株，通过复筛试验筛选出5株具有高效防治番茄青枯病的功能菌株。通过温室实验最终验证本发明所采用的筛选体系在防治番茄青枯病方面具有精准、高效和经济上的可行性，避免了资源和时间的大量消耗。
18.由于芽孢杆菌属中的许多种都具有合成抗菌活性物质的能力，且绝大多数对人畜无毒无害，同时具有较强的抗逆性和良好的环境适应性，因此现阶段被认为是生防效率非常高的物种。而枯草芽孢杆菌能产生24种以上结构多样的抗菌化合物，已有研究报道其对植物病原体的抑制活性具有挖掘的潜力。
19.本发明通过温室试验证明了通过生防菌剂能有效的抑制番茄青枯病，显著延缓番茄的发病时间，降低番茄青枯病的发病程度。经wjb0802、fq2-5和xw-6-3处理后的病情指数值分别为26.93％、30.9％和32.77％，远低于对照组处理94.83％。其中菌株wjb0802、fq2-5、xw-6-3、fq2-8和xw-6-4的抑菌圈直径大于22.00mm，使番茄防效分别达到了71.57％、67.38％、65.40％、55.52％和54.38％。经形态学特征及16s rrna基因序列的比对分析，以上5株有效拮抗菌初步鉴定均为芽孢杆菌属(bacillus)，其中wjb0802和fq2-8为枯草芽孢杆菌，fq2-5和xw-6-3为贝莱斯芽孢杆菌，菌株xw-6-4为地衣芽孢杆菌。这些数据与前人的研究结果相一致，说明芽孢杆菌能合成并分泌一些抗菌活性产物如脂肽类物质、蛋白类抗菌物质和酚类物质等，以此有效抑制番茄青枯病。
20.综上所述，为了挖掘能够对番茄青枯病进行生物防治的拮抗菌株和有效方法，本发明采用平板共培养法和最新根际快速筛选法，从发病田中健康番茄的根际进行分离筛选对致病性青枯菌具有体外抑菌活性的有效拮抗细菌16株，通过16s rrna基因测序分析其分类地位；后以盆栽试验进行防控效果的统计。最终筛选出一株防治效果最高的番茄青枯病拮抗细菌wjb0802，其抑菌圈直径达37.73mm；通过比对分析鉴定为枯草芽孢杆菌。经盆栽试验结果表明：与对照组以及其他拮抗菌株处理相比，wjb0802显著降低了番茄青枯病的病情指数67.9％，同时还延缓了番茄青枯病的发生。wjb0802对番茄青枯病的防控效果高达71.57％，显著优于其他拮抗菌株处理。本发明为防控番茄青枯病建立模式生物菌株提供了新策略。
附图说明
21.图1示出了部分拮抗菌株对番茄青枯病原菌的抑制作用；其中，第一排从左至右依次为菌株fq2-5、xj-1、fq2-2，第二排从左至右依次为菌株xw-6-3、fq2-8、wjb0802；
22.图2示出了基于16株拮抗菌株16s rrna序列的系统发育分析；
23.图3分别示出了16株拮抗菌株对番茄青枯菌根际浸染抗菌活性的防控效果(a)及数据分析(b)；
24.图4分别示出了5株拮抗菌株处理下番茄的病情指数(a)、生物防治效果数据分析(b)、以及番茄的室内抗病效果(c)第一排从左至右依次为菌株fq2-5、xj-1、fq2-2；第二排从左至右依次为菌株xw-6-3、fq2-8、wjb0802。
具体实施方式
25.以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
26.材料与方法
27.1.供试样品
28.取样地：从上海缘菊、青岛番茄等种植基地连年持续发病的番茄植株附近采集健康番茄根际土壤。去除表面土，采集5～10cm深处的根际土样300g，分别装入无菌采样袋，标记后转移至实验室，置于4℃冰箱保存。
29.2.供试菌株及培养基
30.供试病原菌：青枯菌(ralstonia solanacearum)，由上海市农业科学院园艺所实验室提供。
31.牛肉膏蛋白胨培养基na：蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、nacl 5g、琼脂粉10g、ph 7.0，定容至1000ml，培养温度为30℃。
32.实施例1健康番茄根际细菌的分离纯化
33.从上海缘菊、青岛番茄等种植基地连年持续发病的番茄植株附近采集健康番茄根际，采用梯度稀释法分离拮抗细菌。称取番茄根际样本5g，溶于45ml无菌水中，37℃恒温摇床振荡培养30min，使其充分混匀，按照10-2
～10-5
进行梯度稀释，分别吸取100μl涂布于tsb(tryptone 10g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂粉12g，ph 7.2，定容至1000ml)平板上，每个梯度重复3次，37℃恒温培养箱中培养24h。挑取形态不同的细菌经平板划线纯化，后将纯化菌株斜面置于4℃冰箱中保存，同时用40％(体积分数)的甘油作为保护剂于-20℃长期保藏。
34.实施例2拮抗菌株初筛
35.采用平板对峙法筛选r.solanacearum的拮抗细菌，以r.solanacearum作为靶标菌，将其活化后接种于na培养基，置于30℃、180r/min摇床振荡培养至od
600
为1.0(约108cfu/ml)的菌悬液，吸取100μl菌悬液加入15ml冷却至50℃的na培养基中，制成含致病菌平板，待培养基完全凝固后将7mm无菌滤纸按照“十”字形放置于na固体菌液混合平板中，每个滤纸片加5μl待筛选细菌悬液滴加至滤纸上。每个平板点接1个待测菌液，吹干后倒置于30℃恒温培养箱中培养48h，以中间滤纸添加无菌水作为对照，测量抑菌圈直径并记录试验结果，重复三组。
36.从2份不同取样点的样品中分离和纯化共获得细菌分离物121株(表1)。经平板对峙实验，初步筛选出对番茄青枯病菌有拮抗作用的菌株共有16株，16株番茄青枯病拮抗细菌的分离来源与抑菌圈直径统计结果如表2，其中来自上海地区番茄根际样品的细菌分离物共13株，青岛番茄根际样品的细菌分离物3株。对番茄青枯病菌有较强拮抗作用的菌株共4株，其中来自上海番茄基地3株，青岛番茄基地1株。因此对发病田中的健康番茄根际土壤进行微生物分离筛选有望获得具有较强拮抗作用的菌株。
37.表1不同地区根际土壤细菌分离物对番茄青枯菌拮抗能力的测定
38.注：
“‑”
无拮抗作用；“+”抑菌圈直径0.00～21.00mm；“++”抑菌圈直径21.00～25.00mm；“+++”抑菌圈直径》25.00mm。
39.16株拮抗菌的分离来源和抑菌圈直径统计结果见下表2，菌株wjb0802、fq2-5和xw-6-3平均抑菌圈直径为30.00-38.00mm，菌株fq2-8、xj-1、no.4b、xw-6-3、zt、fq2-2的平均抑菌圈直径为22.00-30.00mm，其他7株平均抑菌圈直径小于22.00mm。初步认为菌株wjb0802、fq2-5、xw-6-3、fq2-8、xj-1、no.4b、xw-6-3、zt和fq2-2的拮抗效果较好。其中部分拮抗菌对番茄青枯病原菌的抑制作用如图1所示。
40.表2 16种细菌对番茄青枯病菌拮抗能力的复筛菌株编号菌株来源抑菌圈直径(mm)xw-6-4bacillus licheniformis22.13
±
0.64exw-6-3bacillus velezensis30.77
±
0.25bno.4bbacillus subtilis23.75
±
0.25gxj-1bacillus subtilis25.03
±
0.25dztbacillus paralicheniformis22.57
±
0.31fxh2-1serratia marcescens10.10
±
0.10jzx-8bacillus subtilis18.43
±
0.21hfq3-2bacillus subtilis15.13
±
0.15ifq2-8bacillus subtilis27.63
±
0.23cfq2-2bacillus velezensis22.63
±
0.42fwjb0802bacillus subtilis37.73
±
0.32afq2-7bacillus velezensis10.13
±
0.15jxw-4-2bacillus flexus22.65
±
0.30ffq2-5bacillus velezensis31.58
±
0.38bsc-3bacillus subtilis20.17
±
0.21gxh2-4bacillus licheniformis15.07
±
0.31i
41.注：表中数据为平均数
±
标准误。不同小写字母表示差异显著(p《0.05)。
42.实施例3拮抗菌种属鉴定
43.本实施例以初筛所得16株拮抗菌株为模板，基因组dna提取采用试剂盒提取。以l％琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度，菌株的16s rrna分子鉴定：采用细菌基因组dna提取试剂盒提取菌株的总dna，以菌株总dna为模板，采用细菌通用引物27f：5
’‑
agagtttgatcctggctcag-3’，1492r：5
’‑
taccttgttacgactt-3’，pcr扩增后每株菌得到两条dna片段，将每株菌的两个片段经测序合并共得到16个菌株的16s rdna全序列。将测得的16s rrna序列提交到ncbi核酸数据库中，进行blast在线分析，根据序列相似性确定细菌种属。对16个测序结果采用neighbor-joining法bootstrap1000次，构建系统发育树，如图2所
示。
44.结果发现，其中15株拮抗菌均为芽孢杆菌属(表2)。将这些菌株序列进行聚集分组，发现菌株no.4b、xj-1、zx-8、fq3-2、wjb0802和sc-3亲缘关系非常接近为枯草芽孢杆菌种，菌株xw-6-3、fq2-2、fq2-7和fq2-5为贝莱斯芽孢杆菌种，xw-6-4和xh2-4则为地衣芽孢杆菌种。剩下的zt和xw-4-2分别为副地衣芽孢杆菌种和弯曲芽孢杆菌种。然而，剩下xh2-1分离株为粘质沙雷氏菌(表2)。由此说明芽孢杆菌具有遗传多样性。
45.实施例4拮抗细菌复筛
46.将番茄种子消毒洗净处理后放入装有无菌水的玻璃烧杯中，置于28℃的黑暗环境中24小时，后将种子均匀地撒于苗床上，置于28℃、75％相对湿度、光周期(光照强度450μmol m-2
s-1
)12h的生长室中。定期喷洒无菌水，以维持幼苗生长。5天后挑选生长状况一致的180株幼苗，置于直径60mm，高度10mm的培养皿中，加入10ml拮抗细菌细胞悬液，确保根与菌悬液接触。拮抗细菌接种物用tsb液体培养基，在32
±
2℃，180rpm振荡培养24h后室温下培养液4000xg离心10分钟，弃上清。在无菌水中重悬菌体，不产生涡流。重复上述步骤2次，调整终悬液的细胞密度至108cfu ml-1
(od＝0.8)。将育苗培养皿置于光照生长室中，培养16h。用无菌水处理10株幼苗作为阴性对照组，随后接种青枯菌(ck+r)。模拟苗再用无菌水接种10株作为对照组，在不接触任何细菌的情况下，消除水培条件下幼苗的自然死亡(ck+w)。拮抗菌处理16h后，将拮抗菌诱导幼苗从培养皿中取出，保存在另一个无菌、干燥的培养皿中，然后接种青枯菌。采用singh(singh,n.,kumar,r.and ray,s.k.(2018).an innovative approach to study ralstonia solanacearum pathogenicity in 6to 7days old tomato seedlings by root dip inoculation.bioprotocol 8(21):e3065.)描述的根浸接种法，用青枯菌接种幼苗。将接种好的幼苗置于1.5ml的离心管中，再加入1ml无菌水。每个离心管施加一株幼苗。将离心管置于放置架中，于光照生长室中培养。定期向试管中加入等量的无菌水，以维持幼苗的生存能力。接种青枯菌后第10天记录萎蔫/死苗数。根据每个试验菌株的记录计算生防效果。
47.经根际浸染复筛，16株拮抗菌对番茄青枯菌根际浸染抗菌活性结果如图3中的a所示，其中经wjb0802处理后，能显著提高番茄幼苗的抗菌活性并降低发病程度。经统计学分析16株拮抗细菌处理番茄幼苗的防控效果如图3中的b所示，通过显著性差异分析，wjb0802、fq2-5、xw-6-3、fq2-8和xw-6-4是最有效的分离株，其防控效果分别为86.67％、76.67％、76.67％、73.33％和63.33％。其他拮抗菌株对番茄青枯病的防控效果并不显著，经根际浸染处理后番茄幼苗病情指数较高，且防控效果不稳定。
48.实施例5番茄青枯病盆栽防效试验
49.番茄种子播种于育苗盆中，待幼苗长至20cm高时，移栽至花盆中，每花盆种1株幼苗，每个处理10个重复，幼苗移栽成活后，使用实施例4筛选得到的wjb0802、fq2-5、xw-6-3、fq2-8和xw-6-4作为功能菌株，分别取每种发酵液50ml灌根处理，菌液浓度约为1
×
108cfu/m l，每隔5d灌根处理1次，对照组(ck+rs)施以等量清水，共3次。待第3次灌根处理3d后，利用伤根灌根法接种青枯病原菌(每盆接种量为50ml，菌液浓度约为1
×
108cfu/ml)，自接种青枯病原菌1d起至14d进行病害严重度统计分析。
50.按照分级标准将番茄青枯病的发病情况进行分级：
51.0级：没有出现青枯症状；1级：有1％-25％的叶片出现青枯症状；2级：有26％-50％
的叶片出现青枯症状；3级：有51％-75％的叶片出现青枯症状；4级：76％-100％的叶片出现青枯症状。
52.发病率＝发病番茄植株数/各生防菌灌根株数
×
100％；
53.病情指数＝∑(病级数x该病级数株数)/(最高病级数x植株总株数)x100％；
54.防治效果(be)＝[(ck的病情指数-试验处理的病情指数)/ck病情指数]
×
100％。
[0055]
结果如图4所示，接种后对照组第3d开始发病，番茄植株出现萎蔫症状，并随着时间的推移日益严重。经拮抗菌处理后，5株拮抗菌株对番茄青枯病均有一定的防治效果，与ck+rs处理相比，先经wjb0802、fq2-5和xw-6-3处理后再接种病原，均延缓了番茄青枯病的发生，对青枯病的发生起到了预防的效果。经wjb0802、fq2-5和xw-6-3处理后的病情指数值分别为26.93％、30.9％和32.77％，远低于对照组处理94.83％。其中菌株wjb0802、fq2-5、xw-6-3防控指数分别为71.57％、67.38％和65.40％，而fq2-8和xw-6-4处理的防控指数分别为55.52％和54.38％，防控效果一般。
[0056]
综上所述，wjb0802对番茄青枯病的防控效果高达71.57％，显著优于其他拮抗菌株处理，将其作为生防菌剂能有效的抑制番茄青枯病，显著延缓番茄的发病时间，降低番茄青枯病的发病程度。
[0057]
以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

技术特征：

1.一种番茄青枯病拮抗细菌wjb0802，其特征在于，所述番茄青枯病拮抗细菌wjb0802分类命名为枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，于2022年8月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏号为gdmcc62697。2.一种根据权利要求1所述的番茄青枯病拮抗细菌wjb0802在防治番茄青枯病中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：s1：将根据权利要求1所述的番茄青枯病拮抗细菌wjb0802接种于tsb液体培养基中，32
±
2℃、180～200r/min振摇培养至对数期，在4000～6000rpm条件下离心8～12min，用无菌水重悬，调整od
600
为0.8～1.0，备用；s2：番茄种子播种于育苗盆中，待幼苗长至15～20cm高时，移栽至盆中；s3：采用步骤s1备好的菌液对植株进行灌根处理，用量为30～50ml/株，即可实现对番茄青枯病的防治。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤s3包括：幼苗移栽3天后采用菌液进行灌根处理，每隔5天施加一次菌液，共计3～5次。5.一种根据权利要求1所述的番茄青枯病拮抗细菌wjb0802在制备防治番茄青枯病的生防菌剂中的应用。6.一种根据权利要求1所述的番茄青枯病拮抗细菌wjb0802在制备促进植物生长制剂中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述促进植物生长制剂为微生物菌剂或微生物肥料。

技术总结

本发明提供一种番茄青枯病拮抗细菌WJB0802及其应用。所述番茄青枯病拮抗细菌WJB0802分类命名为枯草芽孢杆菌，保藏号为GDMCC62697。根据本发明，还提供一种番茄青枯病拮抗细菌WJB0802在制备防治番茄青枯病的生防菌剂中的应用，以及制备促进植物生长制剂中的应用。本发明从不同地域青枯病发病田间的健康番茄根际进行功能细菌的定向筛选，通过根际浸染复筛法最终筛选出这样一种防治效果最好的番茄青枯病拮抗细菌WJB0802，其抑菌圈直径达37.73mm，盆栽试验结果表明WJB0802显著降低了番茄青枯病的病情指数67.9％，本发明为防控番茄青枯病建立模式生物菌株提供了新策略。番茄青枯病建立模式生物菌株提供了新策略。番茄青枯病建立模式生物菌株提供了新策略。