一种用于实现多细胞球形成和传代的水凝胶纤维及制备方法

1.本发明涉及细胞三维培养技术领域，具体地，涉及一种用于实现多细胞球形成和传代的水凝胶纤维及制备方法。

背景技术：

2.目前，大部分的细胞培养研究都在二维表面进行，如微孔板、组织培养瓶、培养皿等，使用二维培养的特点是简单、高效、快捷、细胞存活率高。在二维培养体系中，贴壁细胞在固体培养板表面贴壁呈单层生长，以低于50％的表面积与培养板底面接触，而其余的表面积与液态培养基接触，仅有很少部分与其他细胞或基质接触；缺乏体内微环境下细胞-细胞间、细胞-细胞外基质间的动态相互作用，不能准确反映体内细胞真实的生长情况。
3.在体内，几乎所有的组织细胞都生活在细胞外基质(extracellular matrix,ecm)中，这些ecm包括了许多复杂的三维纤维网络，可以提供复杂的生物及物理信号。但传统的二维细胞培养所提供的环境不同于体内细胞生长的环境，难以用其去模拟真实体内生理组织中细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用。细胞三维培养技术很好地弥补了这些缺点，三维培养条件下的细胞几乎100％的表面积都与其他细胞或基质接触，所培养的细胞具有特征性的生物信号转导，可以影响细胞增殖、黏附、迁移和基因表达等功能。
4.根据最新研究，在二维培养和三维培养的不同条件下，许多细胞生物学行为将产生重大的变化，包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、基因表达和药物代谢方面。三维细胞培养所使用的基质，克服了传统二维培养的限制，这些基质往往都是多孔结构，可以支持细胞在体外以更接近体内真实环境下进行生长、繁殖和分化。
5.近年来，作为药物研究和生物学研究的有效手段，三维细胞培养系统因而备受关注，相比于传统的贴壁细胞培养(二维细胞培养)，离体细胞在三维立体培养的状态中，其形态和功能更加近似于动物体内活细胞的真实生长状况。
6.肿瘤多细胞球(multicellular tumor spheroids，mctss)是一种经典的体外三维肿瘤细胞培养模型，通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细胞之间的相互作用，从而能模拟人类肿瘤组织中相应的病理生理学特性，该模型已被应用于抗肿瘤药物研究中，依据其形态和生长动力学特性，mctss近似于肿瘤发生早期的无血管瘤或实体瘤组织中远离血管的区域。
7.而在众多用于细胞三维培养的材料中，水凝胶材料，因其具有保水性高的优势，是模拟ecm的理想材料。水凝胶纤维拥有纤维或纤维状的外形，相比于块状凝胶，其比表面积、长径比均得到显著的增大，在促进营养物质、代谢物质输送方面具有巨大优势，客观上为细胞的生长提供了有利的环境。
8.水凝胶是一类具有特定三维微观结构的高含水率材料，在生物医学工程领域以及得到了广泛的应用。然而，基于传统水凝胶材料的细胞三维培养方法仍具有一定的局限性：(1)成型后的水凝胶的微观形貌和力学性能很大程度上受材料含水率影响，而水凝胶的含水率受外界环境影响较大，这种不稳定性导致细胞在水凝胶中存活、表面和功能发挥的不
确定性；(2)负载细胞的水凝胶中往往需要加入一些生物因子和/或药物，为细胞生存或特定功能的发挥提供化学微环境；(3)大多数水凝胶无抗菌性、容易滋生细菌，而水凝胶灭菌较为复杂，水凝胶体内应用存在的感染风险也极大地限制了其应用。

技术实现要素：

9.本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于实现多细胞球形成和传代的水凝胶纤维及其制备方法。
10.本发明的第一目的是提供一种用于实现多细胞球形成和传代的水凝胶纤维的制备方法。
11.本发明的第二目的是提供上述制备方法制备得到的水凝胶纤维。
12.本发明的第三目的是提供上述水凝胶纤维在细胞三维培养中的应用。
13.为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
14.一种用于实现多细胞球形成和传代的水凝胶纤维的制备方法，包括以下步骤：
15.s1.将异丙基丙烯酰胺、n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺和引发剂混合，得到混合溶液；所述异丙基丙烯酰胺、n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺和引发剂的摩尔比为100：2～4：1；
16.s2.将海藻酸钠溶液、十二烷基硫酸钠溶液和步骤s1得到的混合溶液混合，除氧，调节温度至70～75℃充分反应，降温至20～25℃终止反应，充分纯化，冷冻干燥得到纳米凝胶粉末；
17.s3.利用步骤s2得到的纳米凝胶粉末制备纳米凝胶悬浮液，将纳米凝胶悬浮液注入11～50mg/ml的氯化钙溶液中，得到水凝胶纤维。
18.优选地，步骤s1中所述异丙基丙烯酰胺、n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺和引发剂的摩尔比为100：4：1。
19.优选地，步骤s1中所述引发剂为过硫酸钾或过硫酸铵。
20.更优选地，步骤s1中所述引发剂为过硫酸钾(kps)。
21.优选地，步骤s2中所述海藻酸钠与混合溶液中的异丙基丙烯酰胺的质量比为1：5～11.3。
22.更优选地，所述海藻酸钠与混合溶液中的异丙基丙烯酰胺的质量比为1：5。
23.优选地，步骤s2中所述充分反应为调节温度至75℃充分反应。
24.优选地，步骤s2中所述降温至20～25℃终止反应为降温至25℃终止反应。
25.优选地，步骤s2中所述充分反应的时间为1h。
26.优选地，步骤s3中所述氯化钙溶液为11mg/ml的氯化钙溶液。
27.本发明还请求保护上述任一制备方法制备得到的水凝胶纤维。
28.本发明还请求保护上述水凝胶纤维在细胞三维培养中的应用。
29.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
30.本发明提供了一种用于实现多细胞球形成和传代的水凝胶纤维及其制备方法，所述制备方法采用挤出成丝法，并利用海藻酸钠分子之间在二价阳离子的作用下可迅速交联这一机制，将纳米凝胶悬浮液注入氯化钙溶液中获得水凝胶纤维。所述制备方法制备得到的水凝胶纤维的比表面积和长径比相较于二维细胞培养技术和三维块状水凝胶培养技术得到了显著的增大，在促进营养物质和代谢物质输送方面具有巨大优势，为细胞的生长提
供了有利的环境。该水凝胶纤维具有较好的生物相容性，且该水凝胶纤维用于细胞培养时可以有效避免消化细胞所用的胰酶对细胞活性的损害，从而实现细胞的无酶传代和收集。运用本发明所述制备方法制备得到的水凝胶纤维培养细胞，相较于二维细胞培养技术和普通的三维块状水凝胶培养细胞，细胞的活性更好，细胞增殖情况显著提升。
附图说明
31.图1为p-s 10：2水凝胶纤维的温敏性示意图；a：p-s 10：2水凝胶纤维在常温(25℃)下的形貌图；b：p-s 10：2水凝胶纤维在37℃下的形貌图；
32.图2为p-s 10：2水凝胶纤维的解聚示意图；a：p-s 10：2水凝胶纤维在常温(25℃)下的形貌图；b：p-s 10：2水凝胶纤维在常温(25℃)下添加柠檬酸钠后的形貌图；
33.图3为p-s 10：2水凝胶纤维的微观形貌图；
34.图4为hela细胞从p-s 10：2水凝胶纤维中释放后的calcein-am染图；
35.图5为hela细胞的生长趋势图。
具体实施方式
36.下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
37.实施例1p-s 10：2水凝胶纤维的制备及鉴定
38.1、p-s 10：2纳米凝胶的制备
39.向0.0335g的十二烷基硫酸钠(sds)颗粒中加入5ml去离子水，常温(25℃)下静置待其充分溶解得到sds溶液。
40.向0.226g的海藻酸钠粉末中加入23ml去离子水，常温(25℃)下磁力搅拌充分溶解得到海藻酸钠溶液。
41.在单口圆底烧瓶中，将1.13g的异丙基丙烯酰胺(nipam)、0.0616g的n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺(bis)和0.027g的过硫酸钾(kps)溶于22ml的去离子水中，得到混合溶液1。
42.将海藻酸钠溶液和sds溶液加入混合溶液1中，得到混合溶液2，在常温(25℃)下向混合溶液2中通入氮气40min，磁力搅拌至溶质完全溶解。
43.将带有混合溶液2的圆底烧瓶浸入75℃水浴中，反应1h后，将圆底烧瓶浸没至冰水中使其降温至25℃以终止反应，得到反应液。
44.向反应液中加入等体积的去离子水后，将所有液体倒入至截留量为3500的透析袋中并在常温(25℃)下透析7天，每天换水2次。
45.反应液透析结束后经过冷冻干燥得到纳米凝胶粉末，并将其命名为p-s 10：2纳米凝胶粉末。
46.2、p-s 10：2水凝胶纤维的制备与性能表征测定
47.(1)p-s 10：2水凝胶纤维的制备及温敏性表征
48.步骤1得到的p-s 10：2纳米凝胶粉末溶解于生理盐水中得到浓度为25mg/ml的p-s10：2纳米凝胶悬浮液。在常温(25℃)下用1ml注射器将p-s 10：2纳米凝胶悬浮液注入
11mg/ml的氯化钙溶液中即得p-s 10：2水凝胶纤维。
49.p-s 10：2水凝胶纤维即为用于实现多细胞球形成和传代的水凝胶纤维。
50.将p-s 10：2水凝胶纤维在室温下进行观察，接着将p-s 10：2水凝胶纤维置于37℃恒温水浴箱中孵育5min，然后进行观察。
51.(2)p-s 10：2水凝胶纤维的解聚观察
52.常温(25℃)下向步骤(1)得到的p-s 10：2水凝胶纤维中加入55mm的柠檬酸钠溶液，静置10min，观察p-s 10：2水凝胶纤维的形态。
53.(3)p-s 10：2水凝胶纤维的微观形貌观察
54.将步骤(1)得到的p-s 10：2水凝胶纤维置于37℃恒温水浴箱中孵育24h，孵育结束后去除，将其置于液氮中使水凝胶纤维迅速冷冻，冻干机冷冻干燥，用铂金溅射涂层，使用扫描电子显微镜观察p-s 10：2水凝胶纤维的截面微观形貌。
55.3、实验结果
56.p-s 10：2水凝胶纤维在常温(25℃)下和37℃下的观察结果如图1所示；图1a为常温(25℃)下p-s 10：2水凝胶纤维的观察结果；图1b为37℃下p-s 10：2水凝胶纤维的观察结果；结果显示：p-s 10：2水凝胶纤维在常温(25℃)下呈半透明状，在37℃下呈乳白不透明状，说明p-s 10：2水凝胶纤维具有温度敏感性。
57.p-s 10：2水凝胶纤维的解聚结果如图2所示；图2a为常温(25℃)下的p-s 10：2水凝胶纤维形貌图；图2b为加入柠檬酸钠溶液后的p-s 10：2水凝胶纤维形貌图；结果显示：p-s 10：2水凝胶纤维能够在柠檬酸钠溶液中溶解，可以应用于细胞无酶传代培养。
58.p-s 10：2水凝胶纤维的微观形貌观察如图3所示，结果显示：p-s 10：2水凝胶纤维内部具有相互连通的孔洞结构，孔洞多呈圆型，适合培养细胞。
59.实施例2p-s 10：1水凝胶纤维的制备
60.1、p-s 10：1纳米凝胶的制备
61.p-s 10：1纳米凝胶的制备方法同实施例步骤1中p-s 10：2纳米凝胶的制备方法相比，区别在于：本实施例所用的海藻酸钠溶液为：将0.1g的海藻酸钠在10ml的去离子水中充分溶解得到；本实施例中的混合溶液1为：将1.13g的异丙基丙烯酰胺(nipam)、0.0616g的n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺(bis)和0.027g的过硫酸钾(kps)溶于35ml的去离子水中，得到混合溶液1。
62.其余步骤同实施例1步骤1方法一致，制备得到p-s 10：1纳米凝胶粉末。
63.2、p-s 10：1水凝胶纤维的制备
64.将步骤1得到的p-s 10：1纳米凝胶粉末溶解于生理盐水中得到浓度为25mg/ml的p-s 10：1纳米凝胶悬浮液。在常温(25℃)下用1ml注射器将p-s 10：1纳米凝胶悬浮液注入11mg/ml的氯化钙溶液中即得p-s 10：1水凝胶纤维。
65.实施例3水凝胶纤维用于细胞三维培养
66.1、实验方法
67.用胰酶消化hela细胞后，离心去除上清，得到hela细胞沉淀。
68.以实施例1步骤1得到的p-s 10：2纳米凝胶粉末为例：
69.将实施例1步骤1得到的p-s 10：2纳米凝胶粉末溶解于生理盐水中配制得到浓度为25mg/ml的p-s 10：2纳米凝胶悬浮液，用p-s 10：2纳米凝胶悬浮液重悬hela细胞沉淀，得
到细胞-纳米凝胶混合液，细胞-纳米凝胶混合液中的细胞密度为3
×
105个/ml。
70.用1ml注射器将细胞-纳米凝胶混合液注入至11mg/ml的氯化钙溶液中，在室温下交联5min，接着吸出氯化钙溶液，得到细胞-水凝胶纤维复合物，将其加入新鲜培养基中。
71.将细胞-水凝胶纤维复合物转移至37℃、5％co2的细胞培养箱中，并记为第0天。并在随后5天分别测定hela细胞的增殖情况。
72.在第5天测定hela细胞的增殖情况后，向细胞-水凝胶纤维复合物中添加55mm的柠檬酸钠溶液，待水凝胶纤维溶解后，hela细胞得以释放出来，使用calcein-am对hela细胞进行染观察。
73.对实施例2步骤1得到的p-s 10：1纳米凝胶粉末进行同等处理测定hela细胞在细胞-水凝胶纤维复合物中的增殖情况。
74.对照组设置为二维培养技术(tcp)培养hela细胞。
75.2、实验结果
76.hela细胞的染观察结果如图4所示，结果表明：hela细胞活性良好，且形成了多细胞球体。
77.实施例4块状水凝胶用于细胞三维培养
78.1、实验方法
79.在24孔板底部预先加入200μl的2％(w/v)琼脂糖(溶于11mg/ml的氯化钙)，冷却至成胶。
80.用胰酶消化hela细胞，离心去除上清，收集hela细胞沉淀。
81.实施例2步骤2中的p-s 10：1纳米凝胶悬浮液重悬hela细胞沉淀，得到细胞/纳米凝胶混合液，其中hela细胞密度为3
×
105个/ml，纳米凝胶浓度为50mg/ml。
82.将细胞/纳米凝胶混合液转移至37℃、5％co2的细胞培养箱中使其发生原位凝胶化从而实现细胞接种，并记为第0天，并在随后5天分别测定hela细胞的增殖情况，与实施例3中测定的hela细胞增殖情况汇总。
83.2、实验结果
84.hela细胞在p-s 10：2水凝胶纤维、p-s 10：1水凝胶纤维和p-s 10：1块状水凝胶中的增殖情况以及tcp培养的增殖情况如图5所示。结果显示：hela细胞在水凝胶纤维中的增殖情况显著优于hela细胞的tcp培养，且水凝胶纤维中hela细胞的增殖情况也显著优于块状水凝胶中hela细胞的增殖情况。
85.最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：

1.一种用于实现多细胞球形成和传代的水凝胶纤维的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.将异丙基丙烯酰胺、n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺和引发剂混合，得到混合溶液；所述异丙基丙烯酰胺、n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺和引发剂的摩尔比为100：2～4：1；s2.将海藻酸钠溶液、十二烷基硫酸钠溶液和步骤s1得到的混合溶液混合，除氧，调节温度至70～75℃充分反应，降温至20～25℃终止反应，充分纯化，冷冻干燥得到纳米凝胶粉末；s3.利用步骤s2得到的纳米凝胶粉末制备纳米凝胶悬浮液，将纳米凝胶悬浮液注入11～50mg/ml的氯化钙溶液中，得到水凝胶纤维。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述异丙基丙烯酰胺、n，n
’‑
亚甲基双丙烯酰胺和引发剂的摩尔比为100：4：1。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述引发剂为过硫酸钾或过硫酸铵。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤s1中所述引发剂为过硫酸钾。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中所述海藻酸钠与混合溶液中的异丙基丙烯酰胺的质量比为1：5～11.3。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠与混合溶液中的异丙基丙烯酰胺的质量比为1：5。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中所述充分反应为调节温度至75℃充分反应。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤s2中所述充分反应的时间为1h。9.权利要求1～8任一所述制备方法制备得到的水凝胶纤维。10.权利要求9所述的水凝胶纤维在细胞三维培养中的应用。

技术总结

本发明公开了一种用于实现多细胞球形成和传代的水凝胶纤维及其制备方法，所述制备方法采用挤出成丝法，并利用海藻酸钠分子之间在二价阳离子的作用下可迅速交联这一机制，将纳米凝胶悬浮液注入氯化钙溶液中获得水凝胶纤维。所述制备方法制备得到的水凝胶纤维的比表面积和长径比相较于二维细胞培养技术和三维块状水凝胶培养技术得到了显著的增大，在促进营养物质和代谢物质输送方面具有巨大优势；其具有较好的生物相容性，且其用于细胞培养时可以有效避免消化细胞所用的胰酶对细胞活性的损害，从而实现细胞的无酶传代和收集；相较于二维细胞培养技术和普通的三维块状水凝胶培养细胞，细胞的活性更好，细胞增殖情况显著提升。升。升。