用于提取核酸的细胞裂解液及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种用于提取核酸的细胞裂解液及其应用。

背景技术：

2.基因编辑后获得的细胞需要快速抽提dna用于基因型鉴定以确定基因打靶成功的细胞株。获取dna的传统方法是以新鲜、-70℃或液氮保存的标本为材料，通过蛋白酶k消化，酚、氯仿抽提，结合离心柱法或磁珠法进行核酸提取。1987年，fey等首先用np40成功地从骨髓涂片中提取到较高分子量的dna，用于southern印迹分析，但这种方法均需蛋白酶k消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀等步骤，操作复杂，费时且需要的样品量较多。同时，需要在多个离心管之间转移，易造成核酸的损失及标本间的交叉污染。由于pcr技术对dna样品的纯度和分子量的要求相对较低，对微量的dna即可扩增，部分降解的dna也可作pcr检测。因此，用np40和蛋白酶k消化的粗提产物也可用于pcr。后来人们发现用hotshot dna消化法用于小鼠尾巴或耳样的dna抽提可以更简洁有效的进行pcr鉴定。近年来，chelex-100被广泛用于检材较少或只需少量dna的检测。chelex-100是一种化学整合树脂，有苯乙烯，二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合二价金属离子，抑制dna酶而达到减少dna降解的目的。chelex-100结合蛋白酶k消化法被广泛用于法医学，肿瘤学鉴定及分子生物学实验。对基因编辑胚胎干细胞进行鉴定有时只能获得数10个细胞用于鉴定，而且蛋白酶k消化要花费较长的时间，需要更快更灵敏的从基因编辑胚胎干细胞进行dna抽提。

技术实现要素：

3.为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明开发了chelex-100与hotshot结合的核酸提取法，提供了一种细胞裂解液，以及基于该裂解液的核酸提取方法和采用基于该裂解液的细胞裂解物直接进行pcr的方法。本发明提供的细胞裂解液中，通过化学原理可迅速破坏细胞膜结构，达到裂解细胞释放核酸的目的，同时通过抑制dna酶活性，减少dna降解，而减少中转管的使用，避免液体在离心管间移动和移液器吸头移液导致的微量核酸损失，进一步提高核酸提取效率。
4.为此，在第一方面，本发明一种用于提取核酸的细胞裂解液，包括：
[0005][0006]
在一些实施方式中，所述细胞裂解液中，naoh的浓度可以为5mm、7.5mm、10mm、12.5mm、15mm、17.5mm、20mm或它们之间的任意值。
[0007]
在一些实施方式中，所述细胞裂解液中，chelex-100的浓度为1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)、9％(w/v)、10％(w/v)或
它们之间的任意值。
[0008]
在一些实施方式中，所述细胞裂解液中，np40的浓度为0.05％(v/v)、0.1％(v/v)、0.15％(v/v)、0.2％(v/v)、0.25％(v/v)、0.3％(v/v)、0.35％(v/v)、0.4％(v/v)、0.45％(v/v)、0.5％(v/v)或它们之间的任意值。
[0009]
在一些实施方式中，所述细胞裂解液中，edta的浓度为0.05mm、0.1mm、0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm或它们之间的任意值。
[0010]
在一些实施方式中，所述细胞裂解液包括：
[0011][0012]
在一些实施方式中，包括10mm naoh、5％(w/v)chelex-100、0.1％(v/v)np40和0.1mm edta。
[0013]
在一些实施方式中，所述细胞裂解液中不包括triton x-100。发明人发现，本发明的细胞裂解液中不包括triton x-100，可以显著提高细胞鉴定的效率。推测是由于triton x-100和np-40共同使用会降低dna二级结构，增加模板基因的扩增，triton x-100和np-40的双重使用会显著增加非特异性扩增，进而影响对细胞的鉴定。
[0014]
在第二方面，本发明提供了一种提取核酸的方法，包括将细胞与第一方面所述的细胞裂解液混合的步骤。
[0015]
在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
[0016]
将培养在96孔板中的细胞与所述细胞裂解液混合，并进行孵育；
[0017]
将含细胞裂解液的96孔板进行离心，去除沉淀物。
[0018]
在一些实施方式中，所述方法还包括在pcr反应前获得的提取液保存在4℃并再次离心。
[0019]
在一些实施方式中，所述细胞裂解液的加入量为15-25μl。在一些实施方式中，所述细胞裂解液的加入量可以为15μl、16μl、17μl、18μl、19μl、20μl、21μl、22μl、23μl、24μl、25μl以及它们之间的任意值。
[0020]
在一些实施方式中，所述孵育的温度为92-98℃，时间为15-40分钟。在一些实施方式中，所述孵育的温度为92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃或它们之间的任意值。在一些实施方式中，所述孵育的时间为15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟或它们之间的任意值。
[0021]
在一些实施方式中，所述离心的速度为13000-16000r/min，例如为13000r/min、14000r/min、15000r/min、16000r/min或它们之间的任意值。
[0022]
在一些实施方式中，所述离心的时间为2-3分钟。
[0023]
在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
[0024]
(1)将培养的细胞在96孔板中与所述细胞裂解液混合；
[0025]
(2)将步骤(1)得到的混合液进行孵育，使得细胞破裂以及蛋白质变性；
[0026]
(3)将步骤(2)得到的孵育后的96孔板进行离心，去除沉淀物；
[0027]
(4)在pcr反应前将步骤(3)获得的提取液保存在4℃并再次离心。
[0028]
本发明的核酸提取方法中，将培养在96孔板中的细胞去掉培养液后，直接加入裂解液进行混合孵育。本发明将hotshot核酸提取法结合chelex-100，所得核酸粗提物可以直接进行pcr，与现有的pcr方法相比，绕开了dna提纯步骤，省时省力，能够简单、快速、高效处理微量的各种动物细胞以直接进行pcr扩增鉴定；该方法特别适用于微量基因编辑动物细胞高通量细胞鉴定。
[0029]
本发明还提供了一种pcr方法，其采用根据本发明第二方面所述的方法获得的细胞裂解物直接进行pcr。
[0030]
在第三方面，本发明提供了一种根据第一方面所述的细胞裂解液或根据第二方面所述的方法在基因编辑细胞的鉴定中的应用。
[0031]
在一些实施方式中，所述基因编辑细胞为基因编辑胚胎干细胞。
[0032]
相比于现有技术，本发明提供的细胞裂解液用于核酸提取具有如下的优点：快速，耗时约0.5-1小时；简单，省却了蛋白酶k的使用及其孵育的步骤；不涉及液体在试管之间的移动，减少了核酸损失以及减少样品交叉污染的可能性；成本很低；避免使用有害化学物质；重要的是，它适用于微量细胞样品的dna制备。
[0033]
下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
附图说明
[0034]
图1示出了根据本技术实施例1中采用不同细胞裂解液的琼脂糖凝胶电泳结果图。
[0035]
图2示出了根据本技术对比例1中采用不同细胞裂解液的琼脂糖凝胶电泳结果图。
具体实施方式
[0036]
定义
[0037]
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
[0038]
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
[0039]
术语“chelex-100”是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，可螯合多价离子，特别是对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用。在低离子强度、碱性及煮沸的条件下，可以使细胞膜破裂，并使蛋白质变性，通过离心除去chelex颗粒，使其结合的物质与dna分离。
[0040]
术语“np 40”指的是乙基苯基聚乙二醇，是一种用于裂解、融化、稳定蛋白质和电泳等的非离子去垢剂和表面活性剂。
[0041]
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混
淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
[0042]
实施例1
[0043]
s1：从96孔板中培养小鼠wwc2floxed杂合子基因编辑细胞，弃去细胞培养液，每组分别取2孔加入下列细胞裂解液20μl：
[0044]
#1：naoh为10mm，np40为0.1％(v/v)，edta为0.1mm；
[0045]
#2：蛋白酶k为100g/ml，chelex-100为5％(w/v)，np40为0.1％(v/v)，edta为0.1mm；
[0046]
#3：naoh为10mm，chelex-100为5％(w/v)，np40为0.1％(v/v)，edta为0.1mm；
[0047]
#4：蛋白酶k为100g/ml，np40为0.1％(v/v)，edta为0.1mm。
[0048]
s2：#2和#4在56℃下孵育60分钟，再95℃下孵育15分钟；#1和#3在98℃下孵育40分钟。
[0049]
s3：将试管高速离心2-3分钟以沉淀杂质。
[0050]
s4：在pcr反应之前将样品管保存在4℃，并再次离心以沉淀chelex颗粒。
[0051]
s5：取离心后的上清液0.5μl作为dna模板。取0.2μl greentaq酶，0.3μmol引物，用ddh2o补足至9.5μl，加入dna模板。
[0052]
pcr扩增条件：95℃，120s；(94℃，15s，60℃，30s，72℃，60s)，35个循环；72℃，
[0053]
10min；4℃，保持。
[0054]
本实验所用ε)物序列如下(wt条带为257bp；floxed条带为405bp)：
[0055]
wwc2ff88 cagtggggctgtgtctatgg
[0056]
wwc2r1074 atcctcaggcagacctaaacc
[0057]
s6：扩增结束后，取5μl扩增产物进行1.5％浓度的琼脂糖凝胶分析，结果如图1所示。
[0058]
结果显示，细胞裂解液#1至#3有明显的floxed和wt条带，而细胞裂解液#4检测不到floxed基因型产物，说明传统的蛋白酶k裂解液不适宜于微量细胞样品。细胞裂解液#1-3显现条带强弱的不同，以细胞裂解液#3最强，说明采用本发明的细胞裂解液能够高效获取微量细胞样品的核酸。
[0059]
对比例1
[0060]
采用与实施例1中细胞裂解液#3相同的方法进行，不同之处仅在于，细胞裂解液(细胞裂解液#5)为：naoh为10mm,chelex-100为5％(w/v)，np40为0.1％(v/v)，edta为0.1mm；triton x-100为1％(v/v)。扩增结束后，取5μl扩增产物进行1.5％浓度的琼脂糖凝胶分析，结果如图2所示。
[0061]
结果显示，细胞裂解液#5(triton x-100+)具有比细胞裂解液#3(triton x-100-)更强的非特异性扩增条带(如图2箭头所示)。这是由于，triton x-100和np-40同属非离子性洗涤剂，可以降低dna二级结构，增加模板基因的扩增，但triton x-100和np-40的双重使用会显著增加非特异性扩增，np-40的作用更为缓和，所以为了减少非特异性扩增，本发明的细胞裂解液中仅使用np-40，而不使用triton x-100。
[0062]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种用于提取核酸的细胞裂解液，包括：2.根据权利要求1所述的细胞裂解液，其特征在于，所述细胞裂解液包括：3.根据权利要求1或2所述的细胞裂解液，其特征在于，所述细胞裂解液包括10mm naoh、5％(w/v)chelex-100、0.1％(v/v)np40和0.1mm edta。4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞裂解液，其特征在于，所述细胞裂解液中不包括triton x-100。5.一种提取核酸的方法，包括将细胞与权利要求1-4中任一项所述的细胞裂解液混合的步骤。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将培养在96孔板中的细胞与所述细胞裂解液混合，并进行孵育；将含细胞裂解液的96孔板进行离心，去除沉淀物。7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在pcr反应前获得的提取液保存在4℃并再次离心。8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞裂解液的加入量为15-25μl；和/或所述孵育的温度为92-98℃，时间为15-40分钟；和/或所述离心的速度为13000-16000r/min；时间为2-3分钟。9.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞裂解液或根据权利要求5-8中任一项所述的方法在基因编辑细胞的鉴定中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述基因编辑细胞为基因编辑的胚胎干细胞。

技术总结

本发明涉及用于提取核酸的细胞裂解液及其应用。本发明的细胞裂解液包括：5-20mM NaOH；1-10％(w/v)Chelex-100；0.05-0.5％(v/v)NP40；和0.05-5mM EDTA。本发明的细胞裂解液用于提取核酸快速简单，减少了核酸损失以及减少样品交叉污染的可能性，成本低且适用于微量细胞样品的DNA制备。细胞样品的DNA制备。