青岛地区％流感的流行病学调查及
刘佳卉，马清霞，杨海燕，李军伟，单虎，张传美
(青岛农业大学动物医学院，山东青岛266109)
摘要：为了解青岛地区犬流感的流行情况以及犬流感病毒的遗传进化情况，本研究在青岛及周边地区的犬只繁育场、犬只交易市场、流浪犬基地以及动物医院采集了134份犬血清和120份犬鼻咽拭子样本。通过血凝抑制试验检测血清中流感病毒的抗体；鼻咽拭子接种SPF鸡胚分离病毒。血清H1抗体阳性率为&2%(11/134)、H3抗体阳性率为7.5%(10/ 134)、H5抗体阳性率为0.7%(1/134)、H9抗体阳性率为4.7%(6/134)%分离得到1株H3N2亚型犬流感病毒，鸡胚半数感染量(EID50)为10-475/0.2mL，对小鼠有低致病性；遗传进化分析表明，该病毒的8个基因片段均为犬流感，与美国H3N2分离株的同源关系较近，而与此前亚洲分离株同源关系较远％表明当前青岛地区的犬只有流感病毒的暴露风险,H3N2亚型犬流感的流行毒株较年了抗％ 关键词：犬流感；流行病学调查；H3N2；遗传进化分析
中图分类号：S855.3文献标志码：A文章编号：0529—6005(2020)10—0001—05
Epidemiological Investigation of Canine Influenza in Tsingtao and Isolation and
Identification of H3N2Subtype Influenza Virus
LIU Jic-hui,MA Qing-xic,YANG Hai-yan,LI Jun-wei,SHAN Hu,ZHANG Chuan-mei (College of Veterinary Medicine,Qingdao Agricultural University,Qingdao266109,China) Abstract:In order te understand the prevalence of canine influenza and the genetic evolution of canine influenza virus in Tsing-tao,134canine serum samples and120canine nasophayngeal swabs were ccllected from dog breeding farms,dog trading markets, stray canine shelters and animat hospitals in Tsingtao and its surrounding areas.Antibody of influenza virus in serum was detected by hemagglutination inhibition(HI)test,and virus isolation was performed using SPF chicken embryo by nasopharyngeal swab inoculu-tion.The positive rate of H1antibody in serum was8.2%(11/134),H3antibody was7.5%( 10/134),H5antibody was0.7% (1/134)and H9antibody was4.7%(6/134).A H3N2subtype canine influenza virus was isolated,and EID50was10_4'75/ 0.2mL,suggesting low pathogenicim te mice.Phylogenetic analysis showed that eight gene fraaments of the virus were alt canine infeuenaa,whiah had high simieaeieywieh eheAmeeiaan seeain.Theeesueesindiaaeeehaeehedogsin Tsingeaoaeeaeeisk ofeiposueeeo infeuenaavieus,and eheH3N2subeypeaanineinfeuenaavieushasaneigeniavaeiaeion aompaeed wieh peeviousyeaes.
Key words:canine influenza；epidemiologicat investication；H3N2；phylogenetic analysis
Corresponding auttor:ZHANG Chuan-mei,E-mait:
犬流感病毒(Canine influenza virus,CID)属于病毒科流感病毒属A型流感病毒，犬的系病，为发烧、流鼻液、、%近年了多种亚型的流感病毒感染犬的：2004年，美国H3N8马流
收稿日期：2019—09—08
基金项目：国家重点研发计划子课题(2016YFD0501004)&青岛农业大学研基金；山东学校优势学科创
培养计划项目
：刘佳卉(1992-)，女，硕士生，主要从事动物传染病的诊断与防治研究,E-mait:
通讯作者：张传美，E-mait: 感病毒跨种族传播感染赛犬，的症状并导犬死亡［1］；2007年，韩国犬感染禽源H3N2流感病毒⑵；我国于2006—2010年分离了多株H3N2亚型犬流感；2009年，我国发犬感染H1N1亚型流感病毒，时流行的人甲型H1N1流感病毒高度同源［5］；2015年，H3N2亚型犬流感病毒从亚洲传播到了美国［6］，随后在多个地区报道；我国自2016年以来H3N2亚型犬流感流行毒株的抗原性了很大变化，取代了之前的流行毒株［7］；2017—2
018年，在加拿大H3N2亚型犬流感疫情，出现104例确诊病例，认为从亚洲进口的犬只是感染源［8］%
犬作为重要的伴侣动物，与人类接触密切，并且可以感染多种流感病毒⑼，其在流感病毒跨物种传播过程中有重要的公共卫生学意义。为了解当前青岛地区CIV的流行情况，本研究对青岛及周边地区犬进行血清学调查，分离得到1株H3N2亚型流感病毒，对其遗传进化特性进行了分析，为青岛地区犬流感的疫情监控和病毒进化情况提供了参考依据。
1材料与方法
1.1样品和SPF鸡胚、小鼠2017年11月—2018年4月采集了青岛地区犬只繁育场、流浪犬基地以及动物医院的134份犬血清、120份犬的鼻咽拭子样品。9日龄SPF鸡胚，购自济南斯派福瑞禽业科技有限公司;8周龄雌性BALB/c小鼠，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。
1-
2主要试剂受体破坏酶(RDE)，购自日本Denka Seiken公司；H5、H7、H9亚型血凝抑制抗原与阳性血清，均购自哈尔滨维科生物技术开发公司；H1、H3亚型血凝抑制抗原与阳性血清为本实验室保存。aiv荧光rt-pcr检测试剂盒，购自qia-gen公司；高保真酶、T载体试剂盒，均购自北京擎科新业生物技术有限公司；核酸提取试剂盒、反转录酶、胶回收试剂盒和E.co#DH5a，均购自TaKaRa 公司。
1.3血清抗体的检测为调查青岛地区犬只中各种亚型流感病毒的感染情况，参照国标方法(GB/T 18936-2003)进行血凝抑制(HI)试验，检测采集血清中H1、H3、H5、H7和H9亚型流感病毒的抗体。按照说明书操作处理血清：将1体积犬血清加3体积受体破坏酶(RDE)37°C处理过夜(18~20h)后，56b水浴灭活1h，加6体积生理盐水，即为10%待测血清样品。HI滴度大于20即为抗体阳性。
1.4引物合成比较GenBank中多个H3N2亚型CIV基因序列，由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成8对基因片段的引物(如表1)%
表1试验所用引物
Table1Primers used in this study
基因片段Gene fragmene 上游引物(5‘！3d
Ups/eam primer
下游引物(5「！3d
Downstream primer
HA GGGAGCAAAAGCAGGGG GGAGTAGAAACAAGGGTGTTTT
NA GGGAGCAAAAGCAGGAGT
)*1TATTCACCTGCAAAAGGGAGCGAAAGCAGGCA
GGAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT ATATCACCTGCGGGGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT
)*2TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTC )A TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTAC ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT
N)TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTA +TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTAG ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT
NS TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT
1.5病毒的分离鉴定采集犬鼻咽拭子，接种于9日龄SPF鸡胚，收取接种鸡胚的尿囊液进行血凝试验(HA)测其血凝价,HA阳性的尿囊液提取核酸，参照试剂盒说明书进行荧光RT-PCR检测AIV病毒％
1.6全基因组序列测定及分析病毒尿囊液提取核酸反制iDNA，采流感病毒特
异性引物分别扩增8个片段,PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段产物，克隆于T载体，青岛擎物技术限公司进行测定％分别将测序结果导入NCBI网站，在线BLAST 比对各基因片段的同源序列。从GenBank中下载犬H3N2流感病毒参考序列，应用MEGA7软件进行遗传进化分析，使用Neighbor-Joining方法基于遗传距离构建系统发育进化树,Bootstrap值为1000%1-
7鸡胚半数感染量(EIV50)测定将病毒尿囊液用进行10倍系列稀释，每个稀释度接种5枚9~ 10日龄的SPF鸡胚,0.2mL/胚,37C孵化，每12h 观察鸡胚的死亡情况，记录鸡胚的死亡时间％连续观察至120h，将存活的鸡胚在4C冷冻致死后，收集所 鸡胚的，血凝试验测鸡胚的感染情况，参照Reed and Muench的方法(10)计算病毒的EIV50% 1.8小鼠致病性试验将24只6周龄雌性BALB/c 小鼠随机分为试验组和对照组，其中试验组18只，对照组为6只，隔离饲养％将小鼠用乙瞇轻微麻醉，试验鼻接种病毒的鸡胚50"L，对照组按相同方法和剂量接种无毒SPF鸡胚%毒后的
现，固定时间测量体温与体重，记录其采食量与饮
水量。持续观察14d。第3、5、7、9、11天和第14天分3只，病化；采集，病毒的荧光PCR测定。
3结果
2.1血清流行病学调查@试验结果显示，所有被检血清样品中8.2%(11/134"对H1亚型流感抗阳性反应,7.5%(10/134)H3亚型流感抗原阳性反应,0.7%(1/134)H5亚型流感抗
阳性反，样品HE亚型流感抗阳性反,4.7%(6/134)H9亚型流感抗阳性反应。如表2%
表2犬血清中抗体检出情况
Table2Detectio/of antibodies in canine serum
亚型
Subtype
H1H3H5H7H9
检出率/%
Detection rate
8.2(11/134)7.5(10/134)0.7(1/134)0(0/134) 4.7(6/134)
2.2病毒的分离鉴定从1例有呼吸道症状的患犬鼻咽拭子中分离得到1株流感病毒，为A/ Caine/Qingda/0309/201A/H3N2%荧光定量RT-PCR:，有特性，-值为21.668%测得该病毒的鸡胚半数感染量(EID50)为10-475/ 0.2mL%
2.3全基因序列分析对病毒的8个基因片段分
，检测可得到了期大符的目的，1%BLAST及遗传进化分保，毒株并未，8的核"酸序列
2017年国外流行毒株的同源性较高，同源性最高的序列均为A/Caine/Geoyia/89750.1/2017 (H3N2)%
bp
2000
1000
750
500
250
100
M123456789
图！病毒8个基因片段的RT-PCR扩增产物
Fig.1RT-PCR amplification pruducts of8
gene frugments of virus
M：DL-2000DNA marker；1'基因；2：朋基因；3:PB2基因；
4:NS基因；5：)'基因；6：()基因；7:PB1基因；
8:+基因；9：阴性对照
M:DL-2000DNA marker；1:HA gene；2:N4gene；3:PB2gene；
4:NS gene；5:PA gene；6:NP gene；7:PB1gene；
8:M gene；9:Negative control
2.3.1HA基因序列分析该株病毒HA基因由1701个核"酸，编码566氨基酸％HA基因裂解位点(340348)氨基酸序列为PERQTRGLF，仅含有2个碱性氨基酸，病性禽流感的特征％共有6个潜在糖基化位点，分别为38NGT、54 NAT、61NSS、97NET、181NVT、499NGT%该分离株受体结合位点226位氨基
酸是Q，具!，2-3和a，2-6唾酸受体的特性。由绘制的系统进化树(如图2)可以看出，该毒株与近年在美国等地流行的H3N2亚型CID的亲缘关系较近，中国、韩国等地的流行毒株较远，这近几年在中国H3N2亚型CID在流行过程中HA基了很大的%
2.3.2NA基因序列分析该株病毒的NA基因有7个潜在的糖基化位点：61NIT、70NTT、86NWS、146NST、200NAT、234NGT、402NWS，NA基因上与氨酸酶抑制剂耐药性相关的位
突变，因此推测这株病毒氨酸酶抑制剂敏感％遗传进化分，该毒株与2016*2017年美国各州分离株的同源关系较近(3)%
2.4病性试验攻毒第2天即开始出现采降，体降低，，聚堆现象，体降％到第5天体、体开始回升，至第10基本恢复正常。攻毒期病未「死亡，未任何症状，体体常。攻毒体体重的化情况4%
检攻毒小鼠见肺部水肿、淤血和出血，体积增大；支气管内有血泡沫状液体％心、肝、脾、脑和肾脏未的眼观变化％脏器未常%
中病毒含量的荧光RT-PCR检测结，毒后第3脏可以检测到病毒，持到第7天，第9天未检测到病毒
％
98
36
60
39 0.0020
80
77
A/canine/SouthCarolina/132956/2017(H3N2)
-----------A/canine/Ohio/A97/2017(H3N2)
A/canine/Georgia/89750.1/2017(H3N2)
A/canine/Florida/88807.2/2017(H3N2)
------------------------------------------▲A/canine/Qingdao/2018(H3N2)
A/canine/Beijing/20170712-18/2017(H3N2)
A/canine/South Korea/0173915/2015(H3N2)
--------------------A/feline/Korea/FY057/2014(H3N2)
--------------------------------A/canine/Guangdong/01/2014(H3N2)
--------A/canine/Beijing/253/2009(H3N2)
-------------------------------A/canine/Korea/GCVP01/2007(H3N2)
--------------------A/canine/Heilongjiang/Ll/2013(H3N2)
------------------------A/canine/Jiangsu/05/2010(H3N2)
A/canine/Guangdong/2/2006(H3N2) 39
54
57
图2基因的遗传进化树
Fig.2Phylogenetic analysis of the HA gene
▲：本分离株
▲:The isolated strain
100
58
63
10019
16
A/canine/Georgia/89750.1/2017(H3N2)
A/canine/Florida/88807.2/2017(H3N2)
A/canine/South Carolina/132956/2017(H3N2)
A/canine/Beijing/20170712-18/2017(H3N2)
I-▲A/canine/Qingdao/2018(H3N2)
-------------A/canine/Indiana/17031-16-2/2016(H3N2)
lOOl A/canine/Illinois/20170110-1A4/2016(H3N2)
----A/canine/Guangdong/2/2007(H3N2)
-----------A/canine/Korea/CY009/2010(H3N2)
——A/canine/Korea/CY053/2014(H3N2)
A/canine/Heilongjiang/Ll/2013(H3N2)
100
右p A/canine/Beijing/418/2010(H3N2)
3ic
A/canine/Jiangsu/04/2010(H3N2)
--------------A/canine/Liaoning/1585/2010(H3N2)
0.0020
图3#A基因的遗传进化树
Fig.3Phylogenetic analysis ot the NA gene
▲：本分离株
▲:The isolated strain
3讨论
报道犬感染H1N1(5)、H3N8(口、H3N2(2w#6w)、H5N2(11】、H9N2(12)等多种亚型流感病毒(9何。研究发现(14-5]，禽型和人型流感病毒受体Sic a2-3Gat和Sic a2-6Gat广泛分布于犬的「组器官，犬具备同时感染禽型和人型流感病毒的分子基础，这提示我们犬可能成为不同流感病毒的潜在靶细胞，使得流感病毒在其体内
的病毒。通过对青岛地区犬流感的流行病学：，青岛地区部分犬只的血清中含有H1、H3、H5、H9亚型流感病毒抗体，述病毒的：风险。H1和H3亚型流感病毒在犬中的感染和传播情况大量报道(4w，16w7)，但H5和H9亚型的报道较少。在134份犬血清中仅检测到1份H5阳性和6份H9阳性的血清，冋顾这些血清检测
42-|
40-
A 感染组 Infection group * 对照组 Control group
3836
34-32 I I i i i 012345678 91011121314
感染后天数/d
Days post infection
Days post infection
图4感染后小鼠体温、体重变化
Fig. 4 The changes of body tumperature and body weight of infectud mice
A ：小鼠体温变化；
B ：小鼠体重变化
A : Changes of body temperature in mice ；
B : Changes of body weighs in mice
阳性的犬均采集自青岛市的宠物市场。在 过
程中
，宠物市场的犬只来源 同的犬舍，市
场上还 种鸟兽
在一
售，这些犬只可
能在犬舍中感染，也可能在市场
其他鸟兽混养
导致感染流感病毒，
进一步 。不同亚型
的流感病毒在犬只之间流行，增加了流感病毒发生
的
，因此进一步加强犬流感病毒的监测对
犬类健康和人类公共卫生具 意义％
H3N2亚型犬流感最初源自水禽中的禽流感病
毒，近年来，H3N2亚型犬流感病毒在中国、韩国、加
拿大和美国等地犬中广泛流行，且
(4,6
创。吕艳丽等研究 ，自2016年以来，具
型遗传进化和抗原性的H3N2亚型犬流感病毒已
在中国某些地区的犬中流行，已经取代了之前的流 行毒株(7打遗传进化分
，本研究中分离得到
的这株H3N2亚型流感病毒与2017年北京和美国分
离株的亲缘关系较近，这 之前的研究一致，而与
2015年以前我国和韩国的分离株的亲缘关系则较
远， 2016年以后国内流行的H3N2的 型毒株。
病性试验 ，该分离株可以感染
BALB/c 小鼠，体温、体
降，但 死，属
病力的毒株。流感病毒感染
后会导
体
降，
炎的症状。该分离株的8个基
未
，但
病毒长期在犬
流行的过程中可能 类 性流感病毒 .
， 得感染人的能力，可能会
类健康
产生较大的潜在
， 们的广泛关注％
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