江西农业学报㊀２０２１，３３（０５）：３８ ４１
ＡｃｔａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅＪｉａｎｇｘｉ
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ＤＯＩ：１０．１９３８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｘｎｙｘｂ．２０２１．０５．００６
李蒙，刘璞，张芝星
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㊀收稿日期：２０２０－０８－２５
基金项目：西安市科技计划创新基金文理专项项目（２０１７ＣＧＷＬ１２）㊂
作者简介：李蒙（１９８８─），男，实验师，硕士，研究方向：生物化学与分子生物学㊂
（西安文理学院生物与环境工程学院，陕西西安７１００６５）
摘㊀要：为研究抗菌肽Ｆａ－ＡＭＰ的高效制备方法㊂采用大肠杆菌偏嗜性密码子设计编码该抗菌肽的核苷酸
序列，通过重叠区扩增基因拼接法合成目的基因，并将其连接到表达载体ｐＥＴ－４７ｂ上，转化获得其ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ工程菌，经ＰＣＲ和测序鉴定，表明重组表达载体构建成功，这为体外生物活性检测与开发提供了参考㊂ 关键词：抗菌肽；原核表达；Ｆａ－ＡＭＰ；基因；载体
中图分类号：Ｓ８１６．７㊀文献标志码：Ａ㊀文章编号：１００１－８５８１（２０２１）０５－００３８－０４
ＣｌｏｎｉｎｇｏｆＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＰｅｐｔｉｄｅＦａ－ＡＭＰａｎｄＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＩｔｓＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒ
ＬＩＭｅｎｇ，ＬＩＵＰｕ，ＺＨＡＮＧＺｈｉ－ｘｉｎｇ
（ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｘｉ ａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ ａｎ７１００６５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｔｅｓｔｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｏｆａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｅｐｔｉｄｅＦａ－ＡＭＰａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｔｓｂｉｏｌｏｇｙａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｖｉｔｒｏ．ＴｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｐｅｐｔｉｄｅＦａ－ＡＭＰｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄｂｙＥ．ｃｏｌｉｐａｒｔｉａｌｃｏｄｏｎ．Ｆａ－ＡＭＰＧｅｎｅｗａｓｓｐｌｉｃｅｄｂｙｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，ｔｈｅｎｔｈｅｇｅｎｅｗａｓｌｉｎｋｅｄｔｏｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ－４７ｂａｎｄｗａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ．ＴｈｅＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ．ＢｙＰＣＲａｎｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．Ｔｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｌａｉｄｔｈｅｂａｓｉｓｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｓｐｅｃｔａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｎｇｉｔｓｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｖｉｔｒｏ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅ；Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｆａ－ＡＭＰ；Ｇｅｎｅ；Ｖｅｃｔｏｒ
㊀㊀抗菌肽（ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＰｅｐｔｉｄｅ）是一类具有抗菌活性的小分子多肽的总 称，是由宿主产生的能够抵抗外界病原体感染，抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是其对某些耐药性病原菌的杀灭作用更引起了人们的重视［１］㊂广泛存在于各种生物体内，在微生物㊁植物和动物体中均有发现并成功分离获得㊂直接从生物体内提取抗菌肽产量低㊁费时长㊁工艺复杂［２－６］㊂因此，
通过分子生物学技术合成人工抗菌肽是高效制备的理想选择㊂
荞麦（ＦａｇｏｐｙｒｕｍｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＭｏｅｎｃｈ．）是一种药食兼用的经济作物，具有较高的营养价值和保健功能，如防癌㊁降血糖㊁降血脂㊁抗衰老等多种生理功能㊂其中，蛋白质作为荞麦中重要的生物活性物质，具有抗菌等不同生理活性［７］㊂Ｚｈａｎｇ等［８］将荞麦抗菌肽编码基因在原核系统重组表达，表达产物ｒＢＴ对ＩＭ－９细胞系等具有生长抑制活性㊂
赵红倩等［９］通过Ｐｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ和Ｂｏｘ－ｈｎｋｅｎ试验并联优化苦荞蛋白酶解制备抗菌肽，发现对大肠杆菌和金黄葡萄球菌有较强的抑制作用㊂并且发现其不但可以抑制肝癌细胞ＨｅｐＧ２㊁肺癌ＷＲＬ６８㊁白血病Ｌ１２１０等细胞的生长，甚至可以抑制艾滋病病毒ＨＩＶ－１的逆转录酶活性［１０］㊂因此，荞麦抗菌肽是多功能活性肽，在抵抗微生物感染㊁提高机体免疫力等研究领域有着很好的应用前景㊂
目前，已在多种植物中发现了抗菌肽，
Ｆｕｊｉｍｕｒａ等［１１］首次从甜荞中分离得到了Ｆａ－ＡＭＰ１
和Ｆａ－ＡＭＰ２抗菌肽，两者在结构中十分相似，仅在Ｃ端有一个氨基酸差异，具体的分子结构有待进一步阐明㊂本研究拟通过基因工程手段获得荞麦Ｆａ－ＡＭＰ１和Ｆａ－ＡＭＰ２抗菌肽的原核表达菌株，为高效制备具有生物活性荞麦抗菌肽的开发利用提供重要的研究手段㊂
１㊀材料与方法
１．１㊀材料
原核表达载体ｐＥＴ－４７ｂ（＋）㊁大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ和ＤＨ５α均由西安文理学院生物与环境工程学院实验室保存㊂
１．２㊀试剂
ＢａｍＨⅠ㊁ＸｈｏⅠ核酸限制性内切酶，ＤＮＡ分子量Ｍａｒｋｅｒ；ｐＧＭ－ＴＶｅｃｔｏｒ载体；ＴａｑＰＣＲＭａｓｔｅｒ⁃ｍｉｘ；ＤＮＡ纯化试剂盒；质粒提取试剂盒㊂１．３㊀抗菌肽基因设计及引物合成
根据ＮＣＢＩ数据库中抗菌肽Ｆａ－ＡＭＰ１（ａｃｃｅｓｓｉｏｎＰ０ＤＫＨ７．１）和Ｆａ－Ａ
ＭＰ２（ａｃｃｅｓｓｉｏｎＰ０ＤＫＨ８．１）蛋白质序列分析，采用大肠杆菌中密码子偏嗜性设计抗菌肽的核苷酸，Ｆａ－ＡＭＰ１氨基酸序列（ＡＱＣＧＡＱＧＧＧＡＴＣＰＧＧＬＣＣＳＱＷＧＷＣＧＳＴＰ⁃ＫＹＣＧＡＧＣＱＳＮＣＫ），Ｆａ－ＡＭＰ２氨基酸序列（ＡＱＣ⁃ＧＡＱＧＧＧＡＴＣＰＧＧＬＣＣＳＱＷＧＷＣＧＳＴＰＫＹＣＧＡＧＣ⁃ＱＳＮＣＲ），Ｆａ－ＡＭＰ１核苷酸序列（５ᶄ－ＧＣＴＣＡＡＴＧＴ⁃ＧＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＡＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡＧＴＡＣＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＣＡＡＴＣＴＡＡＣＴＧＴＡＡＡ－３ᶄ）；Ｆａ－ＡＭＰ２核苷酸序列（５ᶄ－ＧＣＴＣＡＡＴＧＴＧＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＧＴＧＧＴＴＴ⁃ＧＴＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＡＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡＧＴＡＣＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＴＣＡＡＴＣＴＡＡＣＴＧＴＡＧＡ－３ᶄ）㊂
１．４㊀抗菌肽基因的合成和原核表达载体构建根据Ｆａ－ＡＭＰ１和Ｆａ－ＡＭＰ２优化后的核苷酸序列，设计具有互补重叠区的引物，利用ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ软件设计的５条互补引物（表１），分别为Ｆａ１㊁Ｆａ２㊁Ｆａ３㊁Ｆａ４㊁Ｆａ５引物，采用重叠区扩增基因拼接法，多步ＰＣＲ获得目的基因㊂
Ｆａ－ＡＭＰ１抗菌肽基因获得的ＰＣＲ反应体系（２５μＬ）：Ｆａ１㊁Ｆａ２㊁Ｆａ３㊁Ｆａ４
这４种引物各１μＬ，１０ˑＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５μＬ，ｄＮＴＰ（ｅａｃｈ１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，ＰｆｕＤＮＡ酶０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１７．５μＬ㊂Ｆａ－ＡＭＰ２抗菌肽基因获得的反应体系（２５μＬ）：Ｆａ１㊁Ｆａ２㊁Ｆａ３㊁Ｆａ５这４种引物各１μＬ，１０ˑＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．５μＬ，ｄＮＴＰ（ｅａｃｈ１０ｍｍｏｌ／Ｌ）０．５μＬ，ＰｆｕＤＮＡ酶０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ１７．５μＬ㊂
ＰＣＲ程序：９４ħ预变性１ｍｉｎ；９４ħ变性３０ｓ，５８ħ退火３０ｓ，７２ħ延伸２０ｓ，循环３０次；７２ħ终延伸１０ｍｉｎ㊂反应结束后使用１．０％琼脂糖凝胶进行ＤＮＡ电泳分析，产物置于－２０ħ保存㊂经Ｔａｐ酶扩增连接到ｐＧＭ－ＴＶｅｃｔｏｒ载体，转化到大肠杆菌ＤＨ５α，阳性克隆经ＰＣＲ和测序（上海生物工程公司）鉴定㊂
表１㊀合成Ｆａ－ＡＭＰ基因的引物
引物名称引物序列（５ᶄ－３ᶄ）
Ｆａ１ＧＣＴＣＡＡＴＧＴＧＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＦａ２ＴＴＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＧＣＡＣ
Ｆａ３ＧＴＴＧＴＴＣＴＣＡＡＴＧＧＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡＧＴＡＣ
Ｆａ４ＴＴＴＡＣＡＧＴＴＡＧＡＴＴＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＧＧＧＧＦａ５ＴＣＴＡＣＡＧＴＴＡＧＡＴＴＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＡＧＴＡＣＴＴＴＧＧＧＧ
㊀㊀Ｆａ－ＡＭＰ１和Ｆａ－ＡＭＰ２经测序鉴定正确后，重新设计带有ＢａｍＨⅠ和ＸｈｏⅠ核酸限制性内切酶的上下游引物，Ｆａ－ＡＭＰ１和Ｆａ－ＡＭＰ２的上游引物（５ᶄ－ＡＣＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＣＡＡＴＧＴＧＧＴＧＣＴＣＡＡＧ⁃ＧＴＧＧＴＧ－３ᶄ，下划线为ＢａｍＨⅠ酶切位点），Ｆａ－ＡＭＰ１的下游引物（５ᶄ－ＡＣＡＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡ⁃ＣＡＧＴＴＡＧＡＴＴＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣ－３ᶄ，下划线为ＸｈｏⅠ酶切位点），Ｆａ－ＡＭＰ２的下游引物（５ᶄ－ＡＣＡＣ⁃ＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＴＡＣＡＧＴＴＡＧＡＴＴＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣ－３ᶄ，下划线为ＸｈｏⅠ酶切位点）；以测序正确的基因为模板进行ＰＣＲ扩增，扩增条件：９４ħ预变性１ｍｉｎ；９４ħ变性３０ｓ，６５ħ退火３０ｓ（Ｆａ－ＡＭＰ１为６５ħ，Ｆａ－ＡＭＰ２为６４ħ），７２ħ延伸２０ｓ，循环３０次；７２ħ终延伸１０ｍｉｎ㊂使用核酸限制性内切酶对纯化的ＰＣＲ产物和原核表达质粒ｐＥＴ－４７ｂ（＋）进行双酶切，酶切后构建重组真核表达载体，转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ，对再次重组的表达载体进行测序㊂
１．５㊀序列比对与分析
利用ＥｘＰＡＳｙ在线进行氨基酸序列分析（ｈｔ⁃ｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔ
ｒａｎｓｌａｔｅ／），等电点及分子量预测（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）；在ＮＣＢＩ数据库中进行氨基酸序列比对；二级结构预测采用ＳＯＰＭＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｎｐｓａ－ｐｒａｂｉ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｎｐｓａ
９３
㊀５期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀李蒙等：抗菌肽Ｆａ－ＡＭＰ基因的克隆及其原核表达载体的构建
＿ａｕｔｏｍａｔ．ｐｌ？ｐａｇｅ＝ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ．ｈｔｍｌ）；空间结构预测采用ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ）㊂
２㊀结果与分析
２．１㊀目的基因的鉴定
Ｆａ－ＡＭＰ１和Ｆａ－ＡＭＰ２抗菌肽基因的多步ＰＣＲ扩增产物，使用１．０％琼脂糖凝胶进行ＤＮＡ电泳分析，由图１和图２可知，１００ ２５０ｂｐ间有特异性条带，符合预期结果，连接到ｐＧＭ－ＴＶｅｃｔｏｒ载体测序结果也表明与实验前期设计的Ｆａ－ＡＭＰ１和Ｆａ－ＡＭＰ２抗菌肽基因一致，在线软件预测Ｆａ－ＡＭＰ１和Ｆａ－ＡＭＰ２的重组蛋白分子量分别为６．４９和６
．５２ｋＤａ，等电点为６．９７㊂
Ｍ：ＤＬ２０００；１ ４：Ｆａ－ＡＭＰ１基因的ＰＣＲ扩增结果㊂
图１㊀Ｆａ－ＡＭＰ１基因的ＰＣＲ扩增结果
Ｍ：ＤＬ２０００．１ ３：Ｆａ－ＡＭＰ２基因的ＰＣＲ扩增结果㊂
图２㊀Ｆａ－ＡＭＰ２基因的ＰＣＲ扩增结果２．２㊀基因与载体的酶切
使用核酸限制性内切酶对纯化的Ｆａ－ＡＭＰ１和Ｆａ－ＡＭＰ２基因和原核表达载体ｐＥＴ－４７ｂ进行双酶切及检测（图３和图４），酶切成功后进行连接㊂２．３㊀构建重组表达载体
连接转化后，构建的重组表达载体ｐＥＴ－４７ｂ＋Ｆａ－ＡＭＰ１和ｐＥＴ－４７ｂ＋Ｆａ－ＡＭＰ２进行ＰＣＲ鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示（图５），１００ ２５０ｂｐ间有特异性条带，符合预期结果，重组表达载体测序结果显示构建成功㊂
Ｍ：ＤＬ２０００；１㊁２：Ｆａ－ＡＭＰ１基因双酶切结果㊂图３㊀Ｆａ－ＡＭＰ１和Ｆａ－ＡＭＰ２基因的双酶切结果
Ｍ：ＤＬ２０００；１：ｐＥＴ－４７ｂ的双酶切结果㊂
图４㊀质粒ｐＥＴ－４７ｂ的双酶切结果
㊀㊀Ｍ：ＤＬ２０００；１：Ｆａ－ＡＭＰ１重组质粒ＰＣＲ扩增结果；２：Ｆａ－ＡＭＰ２重组质粒ＰＣＲ扩增结果；３：ｐＥＴ－４７ｂ＋Ｆａ－ＡＭＰ１重组质粒；４：ｐＥＴ－４７ｂ＋Ｆａ－ＡＭＰ２重组质粒㊂
图５㊀Ｆａ－ＡＭＰ１和Ｆａ－ＡＭＰ２的重组质粒
和质粒ＰＣＲ扩增结果
２．４㊀生物信息学分析
获得基因通过ＮＣＢＩ数据库中比对，结果显示氨基酸序列一致，通过ＳＯＰＭＡ对Ｆａ－ＡＭＰ１和Ｆａ－ＡＭＰ２进行二级结构预测，结果发现在它们的二级结构中α螺旋所占比例为５％和２．５％，β折叠所占比例为１５％，无规则卷曲所占比例为８０％和８２．５％，
０４江㊀西㊀农㊀业㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀３３卷
说明其蛋白的二级结构以β折叠和无规则卷曲为主㊂利用在线ＥｘｐＡＳｙ的ＳＷＩＳＳ－ＭＯＤＥＬ对其进行三级结构预测显示是多肽的无规则卷曲（图６）㊂
图６㊀抗菌肽Ｆａ－ＡＭＰ的三级空间结构预测
３㊀讨论
抗菌肽是生物天然免疫防御系统的重要组成部分，由特定基因编码，具有广谱抗菌活性，除了具有抗细菌作用外，还具有抗真菌㊁抗肿瘤活性㊁抗病毒㊁降血压㊁免疫调节等功效［１２］，它是具有生物学活性的多个氨基酸组成的多肽［１３］，深入研究
荞麦小分子活性肽，对于荞麦蛋白资源的开发利用具有重要的意义㊂
植物抗菌肽在一级结构方面相当保守序列，即分子内都含丰富的分子内二硫桥，二硫桥是体外合成多肽技术面临的重要难题［１４］㊂人工合成虽可获得与天然抗菌肽一致的氨基酸序列，但是常常不能形成正确的空间结构，且成本昂贵，使其仅停留在实验室试验阶段，同样，体外分离天然抗菌肽或抗菌蛋白也是费时费力㊂因此，本次实验通过基因工程的方法成功构建荞麦抗菌肽的原核表达载体ｐＥＴ－４７ｂ＋Ｆａ－ＡＭＰ１和ｐＥＴ－４７ｂ＋Ｆａ－ＡＭＰ２，下一步进行体外表达是短时间得到大量抗菌肽产物的好方法；为获得具有生物活性的抗菌肽，后续实验可通过优化诱导表达条件，选择合适的融合蛋白标签进行体外表达，是短时间获得具有生物活性且规模化生产制备抗菌肽的理想选择㊂
参考文献：
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ｎｏｖｅｌｔｙｐｅｏｆａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｆａ－ＡＭＰ１ａｎｄＦａ
－ＡＭＰ２，ｆｒｏｍｓｅｅｄｓｏｆｂｕｃｋｗｈｅａｔ［Ｊ］．ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＢｉｏ⁃
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（责任编辑：曾小军）
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