近刚开始做ＰCR,参考了很多与引物设计相关得帖子,结合自己使用pｒimer5与ｏｌiｇｏ得体会,想谈谈自己设计引物得方法与步骤,恳请各位前辈指正、ﻫﻫRT—PＣＲ引物设计原则与方法ﻫﻫ在NCBＩ上搜索到该基因,到该基因得mRNA,在ＣDS选项中,到编码区所在位置,在下面得orｉｇin中,Coｐy该编码序列作为软件查询序列得候选对象。 ﻫ打开Ｐrimer Pｒemiｅr5,点击 sequence, 出现输入序列窗口,Ｃｏｐy目得序列在输入框内(选择As),此窗口内,序列也可以直接翻译成蛋白。点击Ｐriｍer,进入引物窗口。ﻫﻫ此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果"选项,点击Sｅarｃｈ按钮,进入引物搜索框,选择“ＰCＲ pｒiｍｅrs”,“Ｐairs”,设定搜索区域与引物长度与产物长度。在Search Parａmeters里面,可以设定相应参数。一般若无特殊需要,参数选择默认即可,但产物长度可以适当变化,因为1０0～200bp得产物电泳跑得较散,所以可以选择300～500bp。ﻫ
点击OK,软件即开始自动搜索引物,搜索完成后,会自动跳出结果窗口,搜索结果默认按照评分(Rating)排序,点击其中任一个搜索结果,可以在“引物窗口"中,显示出该引物得综合情况,包括上游引物与下游引物得序列与位置,引物得各种信息等。
ﻫ对于引物得序列,可以简单查瞧一下,避免出现下列情况:３’端不要以Ａ结尾,最好就是Ｇ或者C,T也可以;3'不要出现连续得３个碱基相连得情况,比如ＧGG或 CCC,否则容易引起错配。此窗口中需要着重查瞧得包括:Tm应该在５5~70度之间,GC%应该在45%～55％间,上游引物与下游引物得Tm值最好不要相差太多,大概在2度以下较好。该窗口得最下面列出了两条引物得二级结构信息,包括,发卡,二聚体,引物间交叉二聚体与错误引发位置。若按钮显示为红,表示存在该二级结构,点击该红按钮,即可瞧到相应二级结构位置图示。最理想得引物,应该都不存在这些二级结构,即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难到各个条件都满足得引物,所以要求可以适当放宽,比如引物存在错配得话,可以就具体情况考察该错配得效率如何,就是否会明显影响产物、对于引物具体详细得评价需要借助于Oｌｉgｏ来完成,Oｌｉgｏ自身虽然带有引物搜索功能,但其搜索出得引物质量感觉不如Primｅr5。ﻫﻫ在Primeｒ5窗口中,若觉得某一对引物合适,可以在搜索结果窗口中,点击该引物,然后在菜单栏,选择 paｉｒ,使用PDF虚拟打印机,即可转换为Pｄf文档,里面有该引物得详细信息。 ﻫ在Oligｏ软件界面,Fｉｌe菜单下,选择Ｏpen,定位到目得cDＮA序列(在priｍeｒ中,该序列已经被保存为Seｑ文件),会跳出来两个窗口,分别为Internal Stabｉliｔy(Delta Ｇ)窗口与Tm
窗口。在Tm窗口中,点击最左下角得按钮,会出来引物定位对话框,输入候选得上游引物序列位置(Prｉmｅr5已经给出)即可,而引物长度可以通过点击Change－Cuｒrent oligｏ ｌｅngth来改变。定位后,点击Tm窗口得Upper按钮,确定上游引物,同样方法定位下游引物位置,点击Loｗer按钮,确定下游引物。引物确定后,即可以充分利用Anaｌｙze菜单中各种强大得引物分析功能了。
ﻫAｎaｌyzｅ中,第一项为Ｋeｙ ｉｎfo,点击Seｌecｔｅd primｅrs,会给出两条引物得概括性信息,其中包括引物得Tm值,此值Olｉｇo就是采用nearｅｓt ｎeｉgｈbｏr method计算,会比Priｍer5中引物得Ｔｍ值略高,此窗口中还给出引物得Ｄelta G与3’端得Delta G。3’端得Dｅｌｔa G过高,会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应,因此此项绝对值应该小一些,最好不要超过9。
ﻫAnalyze中第二项为Dupｌex Fｏrmaｔiｏn,即二聚体形成分析,可以选择上游引物或下游引物,分析上游引物间二聚体形成情况与下游引物间得二聚体情况,还可以选择Uppｅr/Lowｅｒ,即上下游引物之间得二聚体形成情况。引物二聚体就是影响ＰCR反应异常得重要因素,因此应该避免设计得引物存在二聚体,至少也要使设计得引物形成得二聚体就是不稳定得,
即其Ｄeltａ Ｇ值应该偏低,一般不要使其超过4、5kｃaｌ/mｏl,结合碱基对不要超过3个、Oligo此项得分析窗口中分别给出了３'端与整个引物得二聚体图示与Dｅlta G值。
ﻫＡnalｙｚe中第三项为Hａirpin Fｏrｍation,即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物,同样,Ｄelta G值不要超过4。5ｋｃal/mol,碱基对不要超过3个。 ﻫＡnａlyze中第四项为Coｍpｏsitｉon and Tm,会给出上游引物、下游引物与产物得各个碱基得组成比例与Tm值。上下游引物得GC%需要控制在40%~60％,而且上下游引物之间得GC％不要相差太大。Tm值共有3个,分别采用三种方法计算出来,包括ｎｅarｅst ｎeighbｏr meｔhod、％GC method与2(Ａ+T)＋4(Ｇ+C)ｍethoｄ,最后一种应该就是Ｐｒimｅr5所采用得方法,Tm值可以控制在5０~7０度之间。ﻫ第五项为False Ｐriminｇ Ｓites,即错误引发位点,在Pｒｉｍer5中虽然也有Faｌｓe primｉnｇ分析,但不如oligo详细,并且ｏligo会给我正确引发效率与错误引发效率,一般得原则要使错误引发效率在１００以下,当然有时候正确位点得引发效率很高得话,比如达到４00～５0０,错误引发效率超过１00幅度若不大得话,也可以接受。ﻫﻫAnaｌyze中,有参考价值得最后一项就是“PＣＲ”,在此窗口中,就是基于此对引物得PCＲ反应Summaｒy,并且给出了此反应得最佳退火温度,另外,提供了对于此对引物得简短评价。若该引物有不利于ＰＣＲ反应得二级结构存在,并且Ｄeｌta G值偏大得话,Oliｇo
在最后得评价中会注明,若没有注明此项,表明二级结构能值较小,基本可以接受。
引物评价完毕后,可以选择,打印为PDF文件保存,文件中将会包括所有Oｌigo软件中已经打开得窗口所包括得信息,多达数页。因此,打印前最好关掉Tm窗口与Deｌta G窗口,可以保留引物信息窗口、二级结构分析窗口(若存在可疑得异常得话)与ＰCＲ窗口。ﻫ
引物确定后,对于上游与下游引物分别进行Ｂlasｔ分析,一般来说,多少都会到一些其她基因得同源序列,此时,可以对上游引物与下游引物得blast结果进行对比分析,只要没有交叉得其她基因得同源序列就可以。ﻫ
有一个问题,引物设计原则里面常常强调,引物所对应模板序列得Ｔm 值最好在７2℃左右,但就是软件里面Ｓeａrｃh出来得引物,很少有达到这个值得,一般都在5０~65度之间,这就是什么原因?软件怎么没有限定这个规则?
补充
PCＲ引物设计得黄金法则
1. 引物最好在模板cDNA得保守区内设计。
DＮＡ序列得保守区就是通过物种间相似序列得比较确定得、在NCBI上搜索不同物种得同一基因,通过序列分析软件(比如DNAｍan)比对(Aｌｉgnment),各基因相同得序列就就是该基因得保守区。ﻫﻫ2。 引物长度一般在１5~30碱基之间。
引物长度(ｐrimeｒ lｅｎgtｈ)常用得就是18—２7 ｂp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于7４℃,不适于Taq ＤＮA 聚合酶进行反应。
3、 引物GＣ含量在4０％~60%之间,Tm值最好接近７２℃。
ＧＣ含量(position)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物得GC含量不能相差太大。另外,上下游引物得Tm值(ｍｅlｔing temｐeraｔｕrｅ)就是寡核苷酸得解链温度,即在一定盐浓度条件下,50％寡核苷酸双链解链得温度、有效启动温度,一般高于Ｔm值5～10℃。若按公式Tm＝ 4(G＋Ｃ)+2(A＋T)估计引物得Tｍ值,则有效引物得Ｔm为55~80℃,其Ｔm值最好接近72℃以使复性条件最佳、
ﻫ４、 引物3′端要避开密码子得第3位。
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子得第3位,因密码子得第3位易发生简并,会影响
扩增得特异性与效率。
ﻫ5.引物３′端不能选择A,最好选择T。
引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大得差异,当末位得碱基为Ａ时,即使在错配得情况下,也能有引发链得合成,而当末位链为T时,错配得引发效率大大降低,G、C错配得引发效率介于A、T之间,所以3′端最好选择T、
6。 碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其就是3'端相似性较高得序列,否则容易导致错误引发(Faｌse primiｎg)。降低引物与模板相似性得一种方法就是,引物中四种碱基得分布最好就是随机得,不要有聚嘌呤或聚嘧啶得存在。尤其3′端不应超过3个连续得G 或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
7。 引物自身及引物之间不应存在互补序列。ﻫ引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Ｈaｉrpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板得复性结合。引物自身不能有连续4个碱基得互补。
两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3′ 端得互补重叠以防止引物二聚体(Diｍer与Crｏｓs dｉｍeｒ)得形成。引物之间不能有连续4个碱基得互补、ﻫ引物二聚体及发夹结构如果不可避免得话,应尽量使其△G值不要过高(应小于4.５kｃaｌ/mol)。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。ﻫﻫ8。 引物5′ 端与中间△G值应该相对较高,而3′ 端△G值较低。
△G值就是指DNA 双链形成所需得自由能,它反映了双链结构内部碱基对得相对稳定性,△G值越大,则双链越稳定。应当选用5′ 端与中间△Ｇ值相对较高,而３′ 端△G值较低(绝对值不超过9)得引物。引物3′ 端得△Ｇ 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。(不同位置得△G值可以用Oｌigo 6软件进行分析)
9、 引物得5′端可以修饰,而3′端不可修饰。ﻫ引物得５′ 端决定着PCＲ产物得长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增得特异性。引物5′ 端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、、Eｕ３+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。ﻫ引物得延伸就是从３′ 端开始得,不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能、
10. 扩增产物得单链不能形成二级结构。
某些引物无效得主要原因就是扩增产物单链二级结构得影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件(比如ＲNＡｓtrｕcture)可以预测估计ｍRNA得稳定二级结构,有助于选择模板、实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58。6l kJ／ｍoｌ时,扩增往往不能成功、若不能避开这一区域时,用7—ｄeａza-2′—脱氧ＧTP取代ｄGTP对扩增得成功就是有帮助得。ﻫﻫ１1、 引物应具有特异性。
引物设计完成以后,应对其进行BLASＴ检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步得实验了、
值得一提得就是,各种模板得引物设计难度不一。有得模板本身条件比较困难,例如GC含量偏高或偏低,导致不到各种指标都十分合适得引物;用作克隆目得得PCR,因为产物序列相对固定,引物设计得选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。ﻫ做Reaｌ Tｉme时,用于SYBR Green I法时得一对引物与一般PCＲ得引物,在引物设计上所要求得参数就是不同得。引物设计得要求:1)避免重复碱基,尤其就是G.ﻫ2)Tm=58-６0度。
3)GＣ=30-80％。
4)3＇端最后5个碱基内不能有多于2个得G或Ｃ、ﻫ5)正向引物与探针离得越近越好,但不能重叠。
6)ＰＣＲ扩增产物长度: 引物得产物大小不要太大,一般在80-2５０bp之间都可;80~１５０ bp最为合适(可以延长至300 bp)。
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