第 38 卷第 3 期草 业 科 学523-530 Vol.38, No.3PRATACULTURAL SCIENCE3/2021
DOI: 10.11829/j.issn.1001-0629.2020-0559
苟艳丽，高丽莉，吴欣欣，郭欢，包爱科. 四翅滨藜AcDREB2转录因子编码基因的克隆及其表达. 草业科学, 2021, 38(3): 523-530. GOU Y L, GAO L L, WU X X, GUO H, BAO A K. Cloning and expression of the AcDREB2 transcription-factor gene in Atriplex canescens. Pratacultural Science, 2021, 38(3): 523-530. 四翅滨藜AcDREB2转录因子编码
基因的克隆及其表达
苟艳丽1，高丽莉2，吴欣欣1，郭 欢1，包爱科1
（1. 兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020；2. 甘肃农业职业技术学院园林工程系，甘肃 兰州 730020）
摘要：脱水应答元件结合蛋白(DREB)在植物响应盐和干旱胁迫中发挥重要作用。为研究DREB在耐盐碱耐干旱的先锋植物四翅滨藜(Atriplex canescens)中的功能及其应用前景，本研究设计了一对简并引物， 通过PCR扩增和RACE法克隆得到四翅滨藜DREB转录因子编码基因AcDREB2。该基因cDNA全长为867 bp，共编码242个氨基酸。序列BLAST比对与同源性分析结果表明，该基因与其他植物的DREB具有较高的同源性。利用RT-PCR方法进行表达模式分析发现，AcDREB2在四翅滨藜叶中高丰度表达，且其表达受NaCl和渗透胁迫处理的快速诱导，表明AcDREB2参与了四翅滨藜的抗逆响应。 关键词：四翅滨藜；DREB；转录因子；基因克隆；表达模式
文献标志码：A 文章编号：1001-0629(2021)03-0523-08
Cloning and expression of the AcDREB2 transcription-factor gene in Atriplex canescens
GOU Yanli1, GAO Lili2, WU Xinxin1, GUO Huan1, BAO Aike1
(1. College of Pastoral Agriculture Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, Gansu, China;
2. Landscape Engineering Department of Gansu Agricultural Vocational and Technical College, Lanzhou 730020, Gansu, China) Abstract: Dehydration-responsive element-binding proteins (DREB) play an important role in plant responses to salt and drought stress. To investigate the function of DREB in Atriplex canescens and their application prospects, a pair of degenerate primers was desig
ned, and the DREB transcription-factor coding-gene AcDREB2 was cloned via PCR (polymerase chain reaction) amplification and the RACE (Remote Analysis Computation for gene Expression data) method. The full-length cDNA of AcDREB2 was 867 bp, encoding 242 amino acids. The BLAST and homology matrix results showed that AcDREB2 was highly homologous with the DREBs of other plants. The expression patterns of AcDREB2 were analyzed via RT-PCR. AcDREB2 was highly expressed in the leaves of A. canescens, and its expression was rapidly induced by NaCl and osmotic stress, indicating that AcDREB is involved in the A. canescens stress response.
Keywords: Atriplex canescens; dehydration-responsive element-binding protein; transcription factor; gene cloning; gene expression
Corresponding author: BAO Aike E-mail: **************
收稿日期：2020-10-22 接受日期：2020-12-24
基金项目：甘肃省高等学校创新能力提升项目(2019A-218)；国家自然科学基金 (31971761)；甘肃省自然科学基金(20JR5RA241)
第一作者：苟艳丽(1992-)，女，甘肃通渭人，硕士，主要从事植物逆境生理与分子生物学研究。E-mail: ***************
共同第一作者：高丽莉(1978-)，女，甘肃白银人，讲师，硕士，主要从事园林植物生理及栽培研究。E-mail: *****************
通信作者：包爱科(1980-)，男，甘肃岷县人，教授，博士，主要从事植物逆境生理与分子生物学研究。E-mail: **************
盐和干旱是范围最大、影响最广的非生物逆境胁迫，也是限制全球农业生产的两大主要因素。盐和干旱胁迫都会引起细胞失水，破坏细胞内稳态平衡，致使细胞内生理生化代谢紊乱，严重影响植物的正常生长发育。为了在日趋恶劣的环境中生存和繁殖，陆地植物进化出复杂的调控系统来响应胁迫信号以提高植物的适应能力。在盐和干旱胁迫下，很多抗逆相关基因被大量诱导表达，其中脱水应答元件结合蛋白(DREB)就在这个过程中发挥重要作用。1997年，Stockinger等[1]通过酵母单杂交方法首次从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆出能够与DRE顺式作用元件结合的蛋白编码基因CBF1 (C-repeat/DRE Binding Factor 1)。Liu等[2]从拟南芥中分离出DREB1A和DREB2A两个基因，通过凝胶移位分析与反式激活实验证明，DREB1A与DREB2A均能与DRE顺式作用元件高度特异性结合，DREB1A 能够被冷胁迫快速诱导表达，DREB2A能够被干旱和高盐快速诱导表达。
目前对于 DREB 功能的研究大多集中在模式植物拟南芥与抗逆能力有限的作物中，大量研究已证实将 DREB 基因在拟南芥或作物中超表达，能够显著提高转基因植物对干旱、盐碱、低温等各种非生物胁
迫的抗性。但是关于 DREB 在旱生、盐生植物中的功能研究目前尚少。四翅滨藜(Atriplex canescens)是一种多年生 C4半常绿灌木，具有速生、耐干旱、耐贫瘠、抗盐碱等优良特性，由于其粗蛋白含量高，适口性好，是改良牧场和水土保持的优良树种[3]。Pan 等[4]研究表明，100 mmol·L−1 NaCl 可以促进四翅滨藜的生长，且当 NaCl 浓度达到 400 mmol·L−1时，四翅滨藜的生长并没有受到显著抑制。四翅滨藜也具有一定的抗旱能力，在重度干旱胁迫下，四翅滨藜合成的干物质的量是花棒(Hedysarum scoparium)、柠条(Caragana korshinskii)、杨柴(Hedysarum mongolicum)等6种旱生灌木中最大的[5]。前期关于四翅滨藜抗逆机理的研究主要集中在生态恢复、种子萌发、生理适应和离子转运等方面[4, 6-8]，转录因子在其抗逆过程中的功能尚鲜见报道。
鉴于此，本研究克隆了四翅滨藜脱水响应元件结合蛋白编码基因AcDREB2全长cDNA，并对其序列进行分析，有望揭示AcDREB2在四翅滨藜抗逆过程中的作用，从而为挖掘四翅滨藜中蕴含的抗逆基因资源、并将其应用于作物和牧草抗逆性的遗传改良奠定重要基础[9]。
1 材料与方法
1.1 植物材料
本研究所用四翅滨藜种子采自宁夏回族自治区灵武县。根据Pan等[4]的种子处理和发芽方法将四翅滨藜发芽苗移栽至含有蛭石的穴盘中，用1/2 Hoagland营养液培养4周。培养室温度为25～28 ℃，光照
条件为800 μmol·(m2·s)−1、16 h (昼)/8 h (夜)。
1.2 总RNA提取及其反转录
剪取4周龄四翅滨藜的叶片，放入液氮迅速冷冻后，参照北京天根RNA prep Pure Plant Kit操作说明书提取总RNA，通过NanoDrop1000核酸蛋白检测仪检测RNA质量及浓度，利用凝胶电泳检测其完整性。随后用TAKARA PrimeScript Ⅱ 1st strand cDNA合成试剂盒将RNA反转录得到cDNA第一链。
1.3 AcDREB基因全长克隆
利用DNAMAN 6.0软件，根据NCBI上其他植物AcDREB同源基因的保守氨基酸序列设计一对简并引物(上游引物：TGGGGKAARTGGGTYGCHGARATYCG；下游引物：ACDGADGARTGNAGWGGYTTRTA)，预测其核心片段长度为215 bp。用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase试剂盒(Thermo，北京)进行PCR扩增，反应体系为20 μL，反应条件：95 ℃预变性30 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，按照StarPrep Gel Extraction Kit (GenStar)说明书回收和纯化目的片断，送苏州金唯智(GENEWIZ)测序。
根据已获得的四翅滨藜AcDREB2基因核心片段序列，采用RACE法分别克隆该基因的5′-和3′-序列。最
后用MEGA5软件将核心片段、3′-及5′-序列进行拼接后获得全长cDNA序列。5′-克隆步骤如下：根据得到的核心片段序列，用DNAMAN 6.0和Primer 5.0软件设计5′-特异性巢式引物外侧P1和内侧P2 (表1)，RACE试剂盒自带巢式引物分别为外侧P3和内侧P4 (表1)。扩增时首先以5′-RACE cDNA为模板，用引物P1与P3进行扩增得到外侧PCR产物，然后以此为模板，再用引物P2与P4进行扩增得到内侧PCR产物。外侧PCR扩
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增反应程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃20 s，30个循环，最后72 ℃延伸10 min。内侧PCR扩增反应程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。3′-克隆步骤如下：同样根据核心片段设计3′-特异性巢式引物外侧P5和内侧P6。扩增时首先以3′-RACE cDNA 为模板，用引物P5与P3扩增得到外侧PCR产物，然后以此为模板，再用引物P6与P4扩增得到内侧PCR产物。外侧PCR扩增反应程序：98 ℃ 30 s；98 ℃10 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 23 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。内侧PCR扩增反应程序：98 ℃ 30 s；98 ℃10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。
1.4 序列分析
在GenBank中进行序列BLAST比对，用DNAMAN 6.0进行序列同源性分析、翻译、氨基酸序列比对以
及系统进化树制作，在NCBI SMART中进行蛋白质结构预测。1.5 基因表达模式分析
依据AcDREB2全长CDS序列，设计一对引物(上游引物：TCACTGGGGTAAATGGGTCG；下游引物：TGTAAGCCGCCTTGTCGTAA)，通过Real-time PCR对1/2 Hoagland营养液培养4周的四翅滨藜幼苗根、茎、叶中AcDREB2表达量进行分析。随后，将4周的四翅滨藜幼苗分别用100和300 mmol·L−1 NaCl处理以及−0.27和−0.54 MPa的渗透胁迫(渗透胁迫试剂为山梨醇)处理0、0.5、1、3、6、12、24 h 后取叶样，进行AcDREB2的表达模式分析。各样品重复3次，以四翅滨藜AcActin基因为内参(上游引物：AAGAACTACGAGCTACCTGACGG；下游引物：GATACCAGAAGATTCCATTCCAAC)，Real-time PCR 参照SYBR Premix Ex TaqTM II (TAKARA)试剂盒说明进行，以反转录好并用ddH2O稀释10倍后的cDNA 为模板，进行Real-time PCR反应。按照2−∆∆Ct相对定量法计算表达量，采用独立样本T检验分析对照和处理条件下表达量的差异显著性。
2 结果与分析
2.1 四翅滨藜AcDREB2基因全长cDNA克隆及序列分析
通过简并引物扩增得到核心序列长度为215的条带(图1a)，与预测长度一致。以此序列为基础利用RACE法获得5′-和3′-序列，分别为234和509 bp的cDNA (图1b, c)。
将以上3段序列进行拼接后得到总长度为867 bp，
表 1 5′ -和3′ -RACE所用引物
Table 1 Primers for the 5′ - and 3′ - RACE analysis
引物 Primer序列 Sequence (5′ – 3′)
P1CAACCTCGCAAAGTCACCTC
P2CAAAGGTACCCAACCAAAGCCG
P3CTAATACGACTCACTATAGGGC
P4AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
P5GCTTACGACAAGGCGGCTTAC
P6GGTGACTTTGCGAGGTTGAAC
a b c
M1M1M1
图 1 AcDREB2基因核心片段(a)、5′-RACE (b)和3′-RACE (c)克隆
Figure 1 The core fragment, 5′- and 3′- end fragments of AcDREB2
M: 2 000 DNA marker；1: 目的基因片段。
M: 2 000 DNA marker; 1: Target gene fragments.
第 3 期苟艳丽 等：四翅滨藜AcDREB2转录因子编码基因的克隆及其表达525
且3′-具有完整的Poly (A)尾巴的cDNA 序列(图2)。将此全长序列在NCBI 中BLAST 比对发现，该基因与其他植物DREB2基因具有较高的同源性，故命名为AcDREB2。将全长序列进行氨基酸翻译后，发现
该基因包含19 bp 的5′-非翻译区(untranslated region:UTR)，119 bp 的3′-非翻译区及729 bp 的开放阅读框(open reading frame: ORF)，共编码242个氨基酸(图2)。
1191311816127191361121451151541181631211721241811
图 2 AcDREB2基因的核苷酸序列及其编码氨基酸序列
Figure 2 Nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of AcDREB2
图中黑和灰方框分别代表起始密码子和终止密码子。
The black and gray boxes represent the initiation and termination codons, respectively.
2.2 AcDREB2氨基酸序列的同源性比较与结构域分析
将AcDREB2与其他植物DREB 氨基酸序列进行多重比较分析，发现该蛋白具有高度保守的典型AP2/EREBP 结构域，该结构域中包含3个β折叠和1个α螺旋，其中第14位是保守的缬氨酸残基(V)，19位为亮氨酸残基(L)，与其他植物DREB 的保守氨基酸位点相一致(图3)。利用在线软件NCBI SMART 预测AcDREB2蛋白结构域，显示起始密码子之后第41–104区域中含有一个典型的AP2保守结构域，并存在两个低复杂区(low-complexity region)(图4)。
2.3 系统进化树分析
利用DNAMAN 软件进行系统进化树分析，发现AcDREB2与同科植物地中海滨藜AhDREB2和榆钱菠菜AhoDREB2同源性最高，分别高达96%和93%；与同为盐生植物的盐地碱蓬SsDREB2的相似度也较高，达到72%；与其他荒漠植物如野菊CiDREB1-2和柠条CkDREB2等的相似度再38%以上；此外，与大豆GmDREB2、小麦TaDREB2和玉米
ZmDREB2b 等作物和模式植物拟南芥AtDREB2A 的同源性都较低(图5)。
2.4 AcDREB2表达的组织特异性分析
用Real-time PCR 的方法分析AcDREB2基因在4周龄四翅滨藜幼苗根、茎、叶各组织中的表达情况。结果表明，AcDREB2在四翅滨藜各组织中均有表达，其中在叶中的表达量最高，茎中最低(图6)。因此，后续选取表达丰度最高的叶组织样进行各胁迫处理下AcDREB2的表达模式分析。
2.5 NaCl 和渗透胁迫处理下AcDREB2在四翅滨藜叶中的表达模式
100和300 mmol·L −1
NaCl 处理不同时间(0、0.5、1、3、6、12和24 h)后，AcDREB2在四翅滨藜叶中的表达模式如图7所示。低盐(100 mmol·L −1
NaCl)和高盐(300 mmol·L −1
NaCl)处理后，AcDREB2的表达模式类似，表达量均随处理时间的延长逐渐增高，直至处理3 h 时达到峰值，为处理前表达量的2倍以上(图8)。由此可见，叶中AcDREB2的表达受NaCl 处理的显著诱导。
渗透胁迫处理下，随着处理时间的延长，AcDREB2
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在四翅滨藜叶中的相对表达量总体上呈先上升后下降的趋势，但其表达量峰值因渗透胁迫程度不同而有所差异；−0.27 MPa 轻度渗透胁迫下，AcDREB2的表达量在处理3和6 h 时均大幅增加，其中处理6 h
时达到峰值且比处理前高出2.8倍；而−0.54 MPa 重度渗透胁迫下，AcDREB2表达量在处理3 h 时达到最高(图8)。由此可见，AcDREB2的表达受渗透胁迫处理(尤其是轻度渗透胁迫)的强烈诱导。
3 讨论与结论
已有研究表明，植物在遭遇干旱、低温、高盐等逆境胁迫时会产生一系列应答反应，这些反应受植物体内多种因素的调节，其中转录因子可以激活很多靶基因的转录和表达，进而使下游靶基因发挥作用
[10-12]
。目前从各种植物中已克隆出许多抗逆基
因，这些抗逆基因可以一定程度的提高植物的某些抗性，但是对其上游转录激活区的研究较少，从而不能全面的分析植物的抗逆机制。植物中DREB 转录因子(dehydration reesponsive element binding protein)在调控功能基因表达与非生物胁迫信号转导中具有非常重要的作用，当其受到逆境胁迫时，该蛋白编码基因会与DRE/CRT 顺式作用元件结合，并激
β-sheet1β-sheet1α-helix
AP2/EREBP
AP2/EREBP
β-sheet2
241243323363284312193
00719541570636516518712314246
158160257281216235132
图 3 AcDREB2与其他植物DREB 氨基酸序列多重比较
Figure 3 Amino acid sequence alignment of AcDREB2 with DREBs from other plants
空心三角表示第14位与第19位氨基酸；直线表示AP2/EREBP 结合域；箭头为β折叠区；双实线为α螺旋区。各植物DREB 简称来源，地中海滨藜(A. halimus ) AhDREB2、柠条(Caragana korshinskii ) CkDREB2、盐地碱蓬(Suaeda salsa ) SsDREB2、毕氏海篷子(Salicornia bigelovii ) SbDREB 、大豆(
Glycine max ) GmDREB2、小麦(Triticum aestivum ) TaDREB2。
The 14th and 19th
amino acids are indicated with a hollow triangle; the line indicates the AP2/EREBP domain; the arrow indicates the β fold zone; and the double solid line indicates the α helix area. DREB gene sources: AhDREB2 (Atriplex halimus ), CkDREB2 (Caragana korshinskii ), SsDREB2 (Suaeda salsa ), SbDREB (Salicornia bigelovii ), GmDREB2 (Glycine max ), and TaDREB2 (Triticum aestivum ).
0100200
AP2
SMART domain: AP2E-value: 3.29e−38Start: 41End: 104
Low-complexity region Start: 134End: 149
Low-complexity region Start: 154End: 170
图 4 AcDREB2功能域分析
Figure 4 Functional domain analysis of AcDREB2
SMART domain 表示预测AcDREB2蛋白结构域；刻度表示从起始密码子开始的密码子顺序。
SMART domain represents the predicted structural domain of AcDREB2. The scale indicates the order of the codon starting from the start codon.
第 3 期
苟艳丽 等：四翅滨藜AcDREB2转录因子编码基因的克隆及其表达
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