doi：10.3969/j.issn.2095-1736.2021.01.046
林晓霞1，鹿炎1，李会丽1，周苹1，郭新红1，印丽萍$
(1.湖南大学生物学院植物功能基因组学与发育调控湖南省重点实验室，长沙410082；
2.上海市出入境检验检疫局，上海200135)
摘要采集了中国6个省份的铁皮石斛种质资源共22份，通过叶绿体基因皿冰和旳c厶进行克隆测序，同时结合已报道的近缘物种matK序列33个和rbcL序列30个进行系统进化分析及分子鉴定。序列结果显示：ma/K基因序列平均长度为1708bp,GC含量32%，保守位点768个，简约信息位点871个；旳c厶基因序列平均长度1332bp,GC 含量42.9%，保守位点802个，简约信息位点24个。遗传多样性分析表明：肌atK序列单倍型数量(H)32个，单倍型多态性水平(加)0.842，核昔酸多态性(77)0.27016；rbcL序列H为10个，Hd为0.664,〃为0.02611；序列分析及遗传多样性显示序列的分析结果具有更大的遗传多样性。遗传聚类结果显示不同产地的铁皮石斛与已有报道的石斛属各聚一支，相同产地铁皮石斛的聚类结果也与其地理分布基本一致。m/K序列作为石斛属系统进化关系及亲缘关系分析具有更高的遗传多样性；中国6个省份铁皮石斛种质资源在进化上也具有一定的地域性特征。
关键词石斛属；铁皮石斛；叶绿体基因；系统进化树
中图分类号Q943.2文献标识码A文章编号2095-1736(2021)01-0046-05
Genetic relationship analysis of Dendrobium plants
based on chloroplast matK and rbcL gene
LIN Xiaoxia1,LU Yan1,LI Huili1,ZHOU Ping1,GUO Xinhong1,YIN Liping2
(1.School of Biology,Hunan Province Key Laboratory of Plant Functional Genomics and Developmental Regulation,
Hunan University,Changsha410082,China；2.Shanghai Entry-Exit Inspection and
Quarantine Bureau,Shanghai200135,China)
Abstract Dendrobium officinale is a Chinese herbal medicine and mainly cultivated artificially with multiple botanical origins.A total of22D.officinale samples were collected from six different localities of China.The chloroplast genes matK and rbcL form22samples were amplified using PCR,and the pu
rified PCR products were sequenced.These samples sequences with33matK and30rbcL sequences of different Dendrobium species were analyzed on sequence features,genetic variation and phylogenetic relationships.The average length of matK sequences were1708bp,and average GC content was32%with768conserved(polymorphic)sites and871 parsimony informative sites；the average length of matK sequences were1332bp,and average GC content was42.9%,802conserved (polymorphic)sites and24parsimony informative sites.In genetic diversity,the haplotypes(H)of matK sequence was32,values of haplotype polymorphism(Hd)was0.842,and nucleotide diversity(77)was0.27016.For rbcL sequence,H was10,Hd was0.664, and77was0.02611.The genetic diversity of the populations of D.officinale was very high.In the phylogenetic trees,both gene matK and rbcL presented almost in all samples as a group with the D.officinale and consistent with their geographical distributions.In conclusion,the matK sequence had higher genetic diversity for phylogenetic analysis of Dendrobium.There was obvious regional characteristics in evolution for germplasm resources of D.officinale in six different provinces of China.
Key words Dendrobium spp.；Dendrobium officinale；chloroplast gene；phylogenetic analysis
铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo属于兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)多年生草本植物，是中国古代典籍中记载最早的兰科植物之一⑴。石斛属是兰科中最具药用价值的种属，
其茎富含的氨基酸、石斛碱等成分，有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力、降血糖等作用曲］。该属约1000种，中国有74种和2变种，其中细茎石斛D.moniliform^(L.)Sw.、铁皮石斛D.officinale Kimura et Migo、梳唇石斛D.
收稿日期：2019-12-16；最后修回日期=2020-02-04
基金项目：国家重点研发计划项目(2017YFF0210303)；国家自然科学基金项目(31872866,31540064)；湖南省重点研发计划项目(2019NK2081,2017SK2182)
作者简介：林晓霞，硕士研究生，研究方向为植物学,E-mail：lxx2017@
通信作者：郭新红，教授，主要从事生物资源学研究,E-mail:gxh@；印丽萍，研究员，主要从事植物检疫研究,E-mail:yinliping@
strongylanthum Rchb. f.、美花石斛D.loddigesii Rolfe、钩状石斛D.aduncum Lindl.等是中药“石斛”的原植物⑴。野生的铁皮石斛生长于海拔达1600m的山地半阴湿的岩石上，主要分布在中国安徽西南部、浙江东部、福建西部、广西西北部、四川、云南东南部等地⑹。铁皮石斛对于其生长环境要求比较严格，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，且不耐寒⑺。由于其生长缓慢、繁殖率低，以及人工过度开采，已被列为国家重点二级保护的珍稀濒危植物。铁皮石斛现已进入大规模人工栽培，但石斛属
植物种间形态相似，种类多，其杂交种属也较多⑻。目前市场上铁皮石斛的栽培品种多，种质混杂，石斛属药材的质量也参差不齐。故对铁皮石斛的种质资源进行分析鉴定，对维护铁皮石斛的种质资源具有重要意义，也为市场上铁皮石斛的药材质量提供一定保障。
通过基因组特定区域有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA序列作为分子标记⑨⑴，可以在物种水平上快速准确地鉴定物种3］。该技术目前被广泛地应用于传统中药材的分子鉴定中卫切。相比于药材性状鉴定、药材理化鉴定等方法，通过DNA序列标记技术在鉴定药材上不依赖于药材性状，重复性好且准确度高。植物叶绿体基因组通过母系遗传给后代，结构简单，分子量小，序列保守，并且在不同的物种中扩增叶绿体片段的引物是通用的了⑷，使得叶绿体基因被广泛地用作分子标记应用于物种鉴定及系统进化分析中［⑻。基于叶绿体和祐也基因评价药用植物物种鉴定现已被应用于许多药用植物中：19-21］o有科学家基于基因尬皿K或祐也对兰科许多科或亚科的系统发育关系进行了研究22如，结果显示matK和rbcL序列能很好地对兰科植物进行鉴定。本研究采用叶绿体基因皿圧和兀也序列对不同地区铁皮石斛及已报道的属内近缘物种进行分析，探索石斛属进化亲缘关系，为石斛属种质资源鉴别、遗传多样性保护和遗传育种提供重要的分子依据。
1材料与方法
1.1材料
搜集中国6个省份的22份铁皮石斛种质资源，其中湖南省新宁县所采集的样品为野生品种，其余产地均为栽培品种，种质编号及来源地如表1所示。样品采自中国铁皮石斛主要分布地，取样时，对不同产地的植物随机取2〜3个植株新鲜叶片，用酒精清洗叶片表面，再用蒸懈水洗去酒精，标记好后迅速用液氮低温冷冻，然后置于-80兀冰箱中保存备用。 1.2方法
1.2.1样品DNA的提取与扩增
将收集的材料先用CTAB-free缓冲液处理，再按照植物基因组DNA提取试剂盒步骤进行DNA的提取。植物DNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。将提取的DNA进行浓度和纯度测定，调整最终质量浓度为50〜100pig/piL o matK和rbcL基因扩增引物如表2凶。其PCR扩增反应体系为20piL,2x Taq buffer Mix10piL,ddH2O8pX,10nmol/L引物F 0.5piL,10nmol/L引物R0.5pX,DNA模板1piL o扩增程序：95兀预变性5min；95兀变性30s,50兀退火60s,72兀延伸90s,35个循环；最后72兀再延伸10 min o
表1铁皮石斛采样地基本信息
Table1Basic information of sampling site of Dendrobium officinale 种质编号
Germplasm No.
来源地
Origin
经度
Longitude
纬度
Latitude AHLA1
AHLA2
AHLA3
AHLA4
ZJLQ1
ZJLQ2
ZJLQ3
安徽省六安市116.3331.40
ZJLQ4浙江省乐清市120.952&13
ZJLQ5
ZJLQ6
ZJLQ7
FJZZ1
FJZZ2
JXYT1
福建省漳州市117.6524.52
JXYT2江西省鹰潭市117.022&23
JXYT3
YNKM1
YMKM2
YNKM3
YNKM4
云南省昆明市102.7225.05
HNSY1
HNSY2
湖南省新宁县110.8526.43
表2PCR扩增引物
Table2Primers for each barcoding
序列名称引物位置序列（5-3，）
Sequence name Primer position Sequence
matK-19F CGTTCTGACCATATTGCACTATG
1326R TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT rbcL IF ATGTCACCACAAACAGAAAC
724R TGCCATGTACCYGCAGTTGC 1.2.2叶绿体基因matK和rbcL序列测定
叶绿体基因mutK和rbcL序列的PCR扩增产物经质量分数为1.0%琼脂糖电泳和紫外分光光度法检测质量和浓度后，由湖南擎科生物技术服务有限公司进行双向测序C)
1.2.3数据处理
将获得的测序拼接结果，通过blastn进行序列比对。运用NCBI的Taxonomy查铁皮石斛近缘物种的叶绿体基因matK和rbcL序列，选取了已报道的铁皮石斛近缘物种的基因序列，将其与样品测序的序列进行比对，利用MEGA7.0软件计算序列长度、GC含量、变异位点等参数。根据Kimura2-Parameter（K2P）模型，采用最大似然法（Maximum likelihood,ML）构建系统发育树，利用bootstrap（1000次重复）检验各分支的支持率。在DnaSP v5中进行多态性位点、遗传多样性指数和中性检测（F7s Fs和Tajima^D）o
Marker：DNA分子量标准；1~22：样品叶绿体基因皿区的目的片段，约为1300bp
图1采集样品叶绿体基因肌a冰序列的凝胶电泳图
Figure1Gel electrophoresis image of the chloroplast matK
gene from22Dendrobium(yfficinale
,Marker I234567S9W115213141516.1718202122 tbp)^gugggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggn
i sou-
Marker：DNA分子量标准；1~22：样品叶绿体基因加厶的目的片段，约为700bp
图2采集样品叶绿体基因Me厶序列的凝胶电泳图
Figure2Gel electrophoresis image of the chloroplast rbcL
gene from22Dendrobium officinale
2结果与分析
2.1基因扩增
成功提取了22份铁皮石斛基因组DNA,PCR扩增基因皿圧和兀也后将样品进行琼脂糖凝胶电泳检测(图1和图2)。22条序列和说厶序列的扩增信息如表3所示。皿圧和兀也序列均扩增成功，将检测成功的样品送测序公司进行双向测序，校对拼接后，得到44条DNA序列。测序得到的序列长度与琼脂糖凝胶电泳检测的序列长度均一致。
表3matK和rbcL扩增序列信息
Table3The information of the matK and rbcL sequences
序列信息
Sequence information
matK rbcL
样品数2222扩增成功率/%100100
测序成功率/%100100
序列长度/bp1302~1338656-737
2.2采集样品结合已报道的叶绿体基因matK和rbcL 序列特征分析
序列核昔酸构成中，AT含量为66.8%〜69.2%,GC含量为30.8%〜33.2%，平均GC含量为32%，远低于AT含量；当空位(沪p)作为缺失处理时，序列检测到变异位点数共929个，保守位点数768个，其中简约信息位点871个说也序列核昔酸构成中AT 碱基含量为55.6%〜59.1%,GC含量为40.9%〜44.4%,GC平均含量为42.9%，比AT含量略低；当空位(駅p)作为缺失处理时，说厶序列检测到变异位点数共506个，保守位点802个，其中简约信息位点24个(表4)。
2.3采集样品结合已报道的叶绿体基因matK和rbcL 序列的倍型多态性分析和中性检测
采用DnaSP5.10［⑸对matK及rbcL序列进行倍型多态性分析和中性检测沏。倍型多态性分析包括单倍型数量(number of haplotypes,H)、单倍型多样性(haplotype diversity，加)、核昔酸多样性(nucleotide diversity,77)、单倍型多样性方差(variance of haplotype diversity,Wi)单倍型多样性标准差(standard deviation of haplotype diversity,Sh)等。结果表明：石斛属matK序 列共有H32个，Hd值0.842,〃值0.27016,Vh值0.00256,Sh值0.051；祐c厶序列共有H17个，加值0.664,77值0.02611，函值0.00556,Sh值0.075。可 见，石斛属物种具有较高的遗传多样性。通过DimSP 5.10对matK及rbcL序列进行中性检验分析，结果表明：ma£K序列的Tajima's D值、Fu and Li's D*值、Fu and Lil F*值检验均
为正值，在P>0.10水平上不具有显著性；祐"序列的Tajima's D值、Fu and Lil D*值、Fu and Lil F*值检验均为负值，且在P>0.10水平上具有显著性，符合中性进化模式。结果表明从物种水平上石斛属的rbcL序列进化模式符合中性进化的假设。
表4matK和rbcL序列特征
Table4matK and rbcL sequence features
序列信息
Sequence information
matK rbcL 序列长度/bp17081332
GC含量/%3242.9
总变异位点数929506
保守位点数768802
简约信息位点数87124
2.4不同产地石斛属叶绿体基因皿圧和兀c厶进化分析
铁皮石斛常用的拉丁学名有3个，分别为D.can-didum^D.officinale和D.catenatum，中国植物志所用学名为D.officinale和D.candidum⑴，研究的两个学名均有被采用；国外The Plant List网站(http：//www. /tpll.l/record/kew-57343)铁皮石斛的拉丁学名为D.catenatum^o获取已报道的铁皮石斛近缘物种序列包括黄石斛(D・tosaense)，始兴石斛(D. shixingense)、矮石斛(D.bellatulum)和玫瑰石斛(D. crepidatum)等。采用最大似然法(ML)对所有石斛属的matK和rbcL序列进行聚类分析并构建遗传关系树，如图3和图4，图中红线为样品所在支，蓝线为与样品同一分支的已报道物种所在支。由图3分析可知，序列构建的ML进化树分为两大支，样品序列为主要一支，已报道石斛属物种为一支。样品序列与已报道的D.officinale(铁皮石斛)、D.tosaense(黄石斛)和D.acinaciforme(剑叶石斛)的matK序列为同一支，证明样品为铁皮石斛；除样品编号为AHLA3和AHLA4的序列和已报道的D.officinale、D.tosaense与其他的石斛种属处于同一支外，不同产地的铁皮石斛聚为一类且来自同一产地的居都聚集到一起。
对祐c/z序列构建的ML进化树分析表明，同样地，不同产地的铁皮石斛聚为一类且来自同一产地的居都聚集到一起。样品序列与几个近缘物种主要分为一
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红线代表采集样品所在分支；蓝线代表与采集样品近缘的已报 道物种的分支
图3基于肌皿K 序列构建铁皮石斛种质资源的ML 系统发育树
Figure 3 The ML phylogenetic tree of germplasm resources of
D. officinale based on matK sequence
红线代表采集样品所在分支；蓝线代表与采集样品近缘的已报 道物种的分支
图4基于Me 厶序列构建铁皮石斛种质资源的系统发育树
Figure 4 The ML phylogenetic tree of germplasm resources of
D. officinale based on rbcL sequence
大支，样品序列可以很清楚地与其他石斛属序列分开。 这一大支又再分为两支，其中来源为江西、云南及湖南
的样品与已报道的D. officinale 、D. tosaense 、杓唇石斛 (D. nwschatum )的序列处于同一支，而来源为福建、浙 江、安徽的样品与重唇石斛(D. hercoglossum)、流苏石斛 (D. fimbriatum )、玫瑰石斛(D. crepidatum )、黄花石斛 (D. catenatum )和线叶石斛(D. aurantiacum )处于一支 ° 3讨论
石斛属的下级分类有13组，其中石斛组的类茎 细而花小，具有重要的药用价值剧。野生石斛的生长 环境要求较高，且由于人工采摘过多，目前野生石斛的 数量很少，基本都是通过无性繁殖方式进行人工栽 培⑵列，品种较杂。本研究样品的采集点是目前铁皮
石斛主要栽培的地方，有浙江、安徽、云南、福建、江西 及湖南等6省。Asahina 等切通过叶绿体基因matK 和 祐也序列对石斛属的5个种进行鉴定，结果显示matK 基因能很好地对其5个种进行分类，而祐"由于其序 列差异性小，所表现的物种鉴别能力不如皿圧序列。
许多研究表明,rbcL 具有很高的通用性，但其序列相比 于其他序列保守性高，种间差异不大，用于某些物种分 类鉴定的识别度不高，特别是区分中间关系密切的物 种综合其他对兰科植物研究所采用的基因， 选择叶绿体基因matK 和rbcL 序列进行鉴定。
从遗传多样性分析以及倍型多态性分析中，matK 基因表现出更高的遗传多样性(77二0. 270 16,P< 0. 01)，同样在Fu ，s Fs 和Tajima's D 检验下，基因 表现出更高的多样性(77 =0. 026 ll,P<0. 001)；matK 和说厶序列Tajima^s D 均显著背离0，说明石斛属的进 化过程为自然选择的过程。同时，在序
列分析中,
的简约信息位点有871个，祐也的简约信息位点有24 个，序列的变异远远大于rbcL 。综合序列分析及 遗传多样性结果，可以得出matK 序列相比rbcL 序列具 有更丰富的遗传多样性。
从利用皿圧所构建的分子进化树分析可知，所有 样品主要聚类为一大支，且与已报道的铁皮石斛序列 聚为一支，而rbcL 序列所构建的进化树，除了已报道的 铁皮石斛还与其他的石斛属聚为一支外，其中有杓唇 石斛、重唇石斛、流苏石斛、玫瑰石斛、黄花石斛和线叶 石斛。从遗传变异性、序列分析和系统进化树三者的 结果分析可以得出：皿圧序列的变异性相对于rbcL 大，但结合两个基因的分析可确定22个样品属于铁皮 石斛。两个序列所构建的进化树：相同采集地的序列 基本能很好地进行聚类，说明同个采集地点的铁皮石 斛种质资源一致，样品来源较均一；序列的聚类
分析：安徽省的物种属于大别山脉，其3个样品，估计 受环境影响较大，存在较大的变异;rbcL 序列的聚类分 析：样品序列的一支又可分为福建、浙江、安徽一大支
和江西、云南、湖南另一大支，表明福建、浙江和安徽3 个省份的铁皮石斛和江西、云南和湖南的铁皮石斛种 质来源都较均一。其中浙江来源样品ZJLQ6与福建的 居聚类结果更近,ZJLQ7与江西的居更近，且都与 浙江其他居样品距离较远，福建、江西、浙江属于3 个毗邻省份，说明浙江省份的部分铁皮石斛居可能
来源于福建和江西。从祐也序列结果可以得出，除浙江、江西外，其他省份的铁皮石斛种质资源首先聚在一起，表明是一自然物种。但是，来源于浙江的ZJLQ6和ZJLQ7与来源于江西的JXYT1在matK和rbcL序列的进化分析中均聚集一起，说明这3个品种的铁皮石斛亲缘关系较近，该结果与原产地结果划分不完全相符；从matK序列结果可知，相同省份的铁皮石斛居存在一定的变异及进化，这可能与不同地区的地理环境因素或者品种来源存在一定关系。
本研究通过matK和rbcL序列，结合石斛属序列数据，鉴定了中国6个不同铁皮石斛居。该研究也为石斛属种质资源鉴别、进化及分类研究提供了参考依据。
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