原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法

1.本发明涉及蛋白质改性技术领域，具体涉及一种原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法。

背景技术：

2.油脂体是油料作物种子中重要的储油细胞器。油脂体结构类似于乳液，内部为三酰甘油酯，界面层由单层磷脂和油体膜蛋白组成。油体膜蛋白主要包括油体蛋白(oleosin)和少量钙油体蛋白、油体固醇蛋白。油体蛋白分子中间为一个非常长的保守中心疏水区，由68-74个氨基酸组成，形成发夹结构并插入油相中，两端分别为两亲性的n末端和两亲性c末端。由于油体膜蛋白结构的特殊性，促使油体膜蛋白成为一类高效油水界面稳定的蛋白质，具有成为新型食品乳化剂的潜质。但其疏水片段长，导致在水相中溶解度有限，大大限制了工业化应用。此外，此方法也为疏水性蛋白质的绿亲水改造提供了通用策略。
3.目前关于油体蛋白oleosin溶解度改善的方法主要基于生物合成，例如“self-assembly of tunable protein superstructures from recombinant oleosin(proceedings of the national academy of sciences of the united states of america,2012,109(29):11657-11662.)”中记录到kevin等人对向日葵种子oleosin基因序列进行改造和修饰，敲除疏水-亲水连接处的22个氨基酸，使疏水段的长度减小25％，利用大肠杆菌表达变体蛋白，得到可溶于水的油体蛋白；“protease-triggered,integrin-targeted cellular uptake of recombinant protein micelles(macromolecular bioscience,2016,16(9):1398-1406.)”中记载到通过敲除将向日葵种子oleosin疏水核心的57个氨基酸，以甘氨酸替代疏水性较强的氨基酸，构建油体蛋白突变体使亲水臂只带负电荷，实现了oleosin的可溶性表达。此类生物合成的方法成本高、操作过程复杂、产量低，无法达到食品工业化加工需求。

技术实现要素：

4.本发明的主要目的是提出一种原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，旨在解决现有油脂体膜蛋白的改性方法成本高、操作过程复杂、产量低的问题。
5.为实现上述目的，本发明提出的一种原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，包括以下步骤：
6.提取油脂体；
7.将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体；
8.向所述上层糖基化油脂体中加入冷丙酮，离心，再加入石油醚，离心，再加入氯仿-甲醇混合液，离心获得沉淀，将所述沉淀干燥，获得糖基化修饰油体膜蛋白。
9.可选地，将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体的步骤中，
10.所述糖溶液与所述油脂体的质量比为1：(0.2～5)。
11.可选地，将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体的步骤中，
12.所述加热反应的温度为60～100℃。
13.可选地，将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体的步骤中，
14.所述加热反应的时间为30～90min。
15.可选地，将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体的步骤中，
16.所述糖溶液包括葡聚糖5k溶液、葡聚糖10k溶液和葡聚糖20k溶液中的任意一种。
17.可选地，将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体的步骤包括：
18.将所述油脂体与糖溶液混合，获得混合溶液；
19.向所述混合溶液中加入氢氧化钠溶液直至ph值不低于9.0，加热到反应结束，获得反应物；
20.在10000～12000rpm的条件下离心处理所述反应物10～15min，获得上层糖基化油脂体。
21.可选地，向所述上层糖基化油脂体内加入冷丙酮，离心，再加入石油醚，离心，再加入氯仿-甲醇混合液，离心获得沉淀，将所述沉淀干燥，获得糖基化修饰油体膜蛋白的步骤中，
22.所述上层糖基化油脂体与所述冷丙酮的体积比为1：(2.5～3)；和/或，
23.所述上层糖基化油脂体与所述石油醚的体积比为1：(2.5～3)；和/或，
24.所述上层糖基化油脂体与所述氯仿-甲醇混合液的体积比为1：(2.5～3)。
25.可选地，向所述上层糖基化油脂体中加入冷丙酮，离心，再加入石油醚，离心，再加入氯仿-甲醇混合液，离心获得沉淀，将所述沉淀干燥，获得糖基化修饰油体膜蛋白的步骤包括：
26.向所述上层糖基化油脂体中加入冷丙酮，旋涡后离心，获得第一沉淀产物；
27.向所述第一沉淀产物中加入石油醚，旋涡后离心，获得第二沉淀产物；
28.向所述第二沉淀产物中加入氯仿-甲醇混合液，旋涡离心后获得第三沉淀产物，干燥处理所述第三沉淀产物，获得糖基化修饰油体膜蛋白。
29.可选地，提取油脂体的步骤包括：
30.将样品粉碎，加入超纯水，搅拌均匀、匀浆、过滤，获得滤液；
31.向所述滤液中加入蔗糖，调节ph值至不小于9，搅拌离心获得上层膏状物；
32.用8m尿素溶液清洗所述上层膏状物后离心，重复2～3次，获得油脂体。
33.本发明提出的技术方案中，通过将油脂体和糖溶液混合进行糖基化反应，从而增加油脂体膜蛋白的亲水性，同时，增大油脂体膜蛋白分子之间的空间位阻，防止蛋白质分子聚集，从而提高油脂体的溶解度；此外，本发明提供的制备方法，操作步骤简单、成本较低、反应迅速。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
35.图1为本发明提供的原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法的一实施例的流程示意图；
36.图2为本发明实施例1至实施例12制备的糖基修饰油体膜蛋白、以及对比例提供的油体蛋白的示意图；
37.图3为本发明实施例1至实施例9制备的糖基修饰油体膜蛋白、以及对比例提供的油体蛋白的溶解度的方形图；
38.图4为本发明实施例1至实施例15制备的糖基修饰油体膜蛋白、以及对比例提供的油体蛋白的电泳图。
39.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
40.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“a和/或b”为例，包括a方案、或b方案、或a和b同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
41.油脂体是油料作物种子中重要的储油细胞器。油脂体结构类似于乳液，内部为三酰甘油酯，界面层由单层磷脂和油体膜蛋白组成。油体膜蛋白主要包括油体蛋白(oleosin)和少量钙油体蛋白、油体固醇蛋白。油体蛋白分子中间为一个非常长的保守中心疏水区，由68-74个氨基酸组成，形成发夹结构并插入油相中，两端分别为两亲性的n末端和两亲性c末端。由于油体膜蛋白结构的特殊性，促使油体膜蛋白成为一类高效油水界面稳定的蛋白质，具有成为新型食品乳化剂的潜质。但其疏水片段长，导致在水相中溶解度有限，大大限制了工业化应用；现有技术多是采用生物合成，此类方法成本高、操作过程复杂、产量低，无法达到食品工业化加工需求。
42.鉴于此，本发明提供一种原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，通过该制备方法制备出来的糖基化修饰油体膜蛋白具有亲水性，且溶解度高，制备方法简单、成本低；结合图1所示的原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法的一实施例的流程示意图，所述原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，包括以下步骤：
43.步骤s10、提取油脂体；
44.在提取油脂体之前需要先挑选样品，在挑选样品时，优选选择品相良好的、质地均
匀地样品，在本实施例中，优选选择油茶种子作为样品；具体地，在进行步骤s10时，可以按照以下步骤进行：
45.步骤s101、将样品粉碎，加入超纯水，搅拌均匀、匀浆、过滤，获得滤液；
46.步骤s102、向所述滤液中加入蔗糖，调节ph值至不小于9，搅拌离心获得上层膏状物；
47.步骤s103、用8m尿素溶液清洗所述上层膏状物后离心，重复2～3次，获得油脂体。
48.具体地，在实际操作时，可以按照以下步骤进行：称取一定量的油茶种子，将其放入匀浆机中，再按照比例往匀浆机中加入超纯水(即每1kg的油茶种子对应需要添加9～10l的超纯水)，匀浆后采用200～300目的纱布过滤，获得过滤油脂体悬浮液，向油脂体悬浮液中加入蔗糖，调节油脂体悬浮液的ph值，直至油脂体悬浮液的ph至不小于9.0，在25～30℃下搅拌30～40min，然后再在6000～6500rpm的条件下离心处理30～40min，分层后取上层膏状物，再采用8m尿素溶液清洗上层膏状物2～3次，需要说明的是，每次采用8m尿素溶液清洗完上层膏状物都需要在10000～10500rpm的条件下离心处理10～15min后再次8m尿素溶液采用进行清洗，最后获得油脂体。
49.需要说明的是，在一些实施例中，在进行步骤s10时，每1kg的油茶种子需要对应添加9～10l的超纯水；每1m3的上层膏状物需要对应添加1kg的8m尿素以及4～5l的水溶液进行清洗，即在实际清洗过程中，先往容器中加入1kg的8m尿素，再加入4～5l的超纯水，搅拌直至8m尿素全部融化，再加入1m3的上层膏状物进行清洗；8m尿素溶液按照本领域的常规配置方法进行配置即可，此处不再一一赘述。
50.具体地，作为本实施例的一个优选实施例，ph值优选为11。
51.步骤s20、将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体。
52.蛋白质改性即采用物理方法、生物方法或者化学方法对蛋白质结构进行修饰，使其氨基酸残基和多肽链发生某种变化，引起蛋白质分子空间结构和理化性质的变化，以获得更好的功能特性(例如溶解度)，糖基化改性是蛋白质化学改性中的一种，它是采用美拉德反应使食品蛋白质与糖共价交联来制备糖基化蛋白，从而提升蛋白质的溶解性，改善蛋白质的功能性质等性能；具体地，在本实施例中，通过在油脂体中加入糖溶液，使得糖溶液与油脂体界面膜蛋白质进行糖基化反应，从而实现改善油脂体膜蛋白质的性能；相较于其他的方式，采用糖基化反应的方式成本更低，效果更好，反应更加迅速。
53.具体地，在进行步骤s20时，可以通过以下步骤进行：
54.步骤s201、将所述油脂体与糖溶液混合，获得混合溶液；
55.步骤s202、向所述混合溶液中加入氢氧化钠溶液直至ph值不低于9.0，加热到反应结束，获得反应物；
56.步骤s203、在10000～12000rpm的条件下离心处理所述反应物10～15min，获得上层糖基化油脂体。
57.在一些实施例中，具体操作如下：将油脂体和糖溶液按照比例进行混合，获得混合溶液，再往混合溶液中加入氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph值，直至混合溶液的ph值不低于9.0，再将混合溶液密封，加热油浴锅，将密封的混合溶液放置在加热的油浴锅中，反应一定的时间，获得反应物，将反应物放置在冰水中，进行水浴冷却至25～30℃，再在10000～
15000rpm的条件下离心处理10～15min，获得上层糖基化油脂体。
58.需要说明的是，作为本实施例的一个优先实施例，所述混合溶液的ph值优选为11。
59.需要说明的是，在一些实施例中，氢氧化钠溶液的浓度为2～2.5mol/l，作为本实施例的一个优选实施例，氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l。
60.溶解度是油体膜蛋白可应用性的一个很重要的指标，溶解度的高低直接影响了它的乳化作用、起泡特性，决定其可应用的范围、提取及加工工艺条件等的前提和基础；经过发明人反复研究测试得出，糖溶液与油脂体的质量比、反应时间和反应温度等都会对溶解度造成影响。
61.具体地，在一些实施例中，所述糖溶液与所述油脂体的质量比为1：(0.2～5)。即每1kg的糖溶液需要对应添加0.2～5kg的油脂体，在实际应用时，糖溶液与油脂体的质量比可以是1：0.2、可以是1：1、可以是1：2、可以是1：5、可以是1：0.5。
62.进一步地，在一些实施例中，所述加热反应的温度为70～100℃。经过发明人反复测试得出，在一定的温度范围内，反应温度越高，最终制备的糖基化修饰油脂体膜蛋白的溶解度也就越高，因此，在实际应用时，反应温度可以是70℃、可以是80℃、可以是90℃、可以是100℃，作为本实施例的一个优选实施例，反应温度为80℃。
63.更近一步地，所述加热反应的时间为30～90min。在实际应用时，加热反应的时间可以是30min、可以是40min、可以是50min、可以是60min、可以是70min、可以是80min、还可以是90min；作为本实施例的一个优选实施例，加热反应的时间为60min。
64.在一些实施例中，糖溶液的具体类型不做限定，优选选择为葡聚糖溶液，具体地，可以是葡聚糖5k溶液、可以是葡聚糖10k溶液、还可以是葡聚糖20k溶液。
65.需要说明的是上述葡聚糖5k溶液、葡聚糖10k溶液和葡聚糖20k溶液按照本领域常规技术手段配制，此处不再一一赘述。
66.步骤s30、向所述上层糖基化油脂体中加入冷丙酮，离心，再加入石油醚，离心，再加入氯仿-甲醇混合液，离心获得沉淀，将所述沉淀干燥，获得糖基修饰油体膜蛋白。
67.需要说明的是，在一些实施例中，添加冷丙酮和石油醚的作用是去除油脂体的中性脂肪；添加氯仿-甲醇混合溶液的目的是去除油脂体的磷脂等。
68.进一步地，在一些实施例中，在氯仿-甲醇混合溶液中，氯仿和甲醇的体积比为2：1；所述氯仿-甲醇混合溶液参考本领域常规制备方法制备即可，此处不再一一赘述。
69.更进一步地，在一些实施例中，所述上层糖基化油脂与所述冷丙酮的体积比为1：3；即每1kg的上层糖基化油脂需要对应添加3kg的冷丙酮；所述上层糖基化油脂与所述石油醚的体积比为1：3；即每1kg的上层糖基化油脂需要对应添加3kg的石油醚；所述上层糖基化油脂与所述氯仿-甲醇混合液的体积比为1：3；即每1kg的上层糖基化油脂需要对应添加3kg的氯仿-甲醇混合液；作为本实施例的一个优选实施例，每1kg的上层糖基化油脂需要对应依次添加3kg的冷丙酮、3kg的石油醚、3kg的氯仿-甲醇混合液。
70.具体地，在进行步骤s30时，可以通过以下步骤进行：
71.步骤s301、向所述上层糖基化油脂体中加入冷丙酮，旋涡后离心，获得第一沉淀产物；
72.步骤s302、向所述第一沉淀产物中加入石油醚，旋涡后离心，获得第二沉淀产物；
73.步骤s303、向所述第二沉淀产物中加入氯仿-甲醇混合液，旋涡离心后获得第三沉
淀产物，干燥处理所述第三沉淀产物，获得糖基化修饰油体膜蛋白。
74.以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
75.实施例1
76.(1)取1kg的商品化油茶种子放入匀浆机中，加入9kg的超纯水，匀浆后用200目的纱布过滤，往滤液中加入蔗糖，再加入氢氧化钠溶液，直至滤液的ph值为11，搅拌30min，在6000rpm的条件下离心处理30min，获得上层膏状物，用8m尿素溶液洗涤2次，每次洗涤后均在10000rpm的条件下离心处理10min，获得油脂体；
77.(2)按照质量比为1：1的比例将油脂体与葡聚糖5k溶液(葡聚糖5k溶液的浓度为0.2mg/ml)混合，再加入氢氧化钠溶液(氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l)调节混合溶液的ph值至11，磁力搅拌10min，将混合溶液密封置于80℃的油浴锅中，再以300rpm的速度搅拌反应60min，随后置于冷水中水浴冷却至28℃，再在10000rpm的条件下离心处理10min，获得上层糖基化油脂体；
78.(3)取上层糖基化油脂体，加入冷丙酮，旋涡充分反应后，离心除去多余的冷丙酮，再加入石油醚，充分反应后，旋涡离心除去多余的石油醚，再加入氯仿-甲醇溶液，充分反应后，旋涡离心除去多余的氯仿-甲醇溶液，获得沉淀，将沉淀沉淀放置于通风橱中自然干燥，获得糖基化修饰的油体膜蛋白。
79.实施例2
80.(1)与实施例1的制备方法一致；
81.(2)按照质量比为1：0.2的比例将油脂体与葡聚糖5k溶液(葡聚糖5k溶液的浓度为0.2mg/ml)混合，再加入氢氧化钠溶液(氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l)调节混合溶液的ph值至11，磁力搅拌10min，将混合溶液密封置于100℃的油浴锅中，再以300rpm的速度搅拌反应30min，随后置于冷水中水浴冷却至28℃，再在10000rpm的条件下离心处理10min，获得上层糖基化油脂体；
82.(3)取上层糖基化油脂体，加入冷丙酮，旋涡充分反应后，离心除去多余的冷丙酮，再加入石油醚，充分反应后，旋涡离心除去多余的石油醚，再加入氯仿-甲醇溶液，充分反应后，旋涡离心除去多余的氯仿-甲醇溶液，获得沉淀，将沉淀沉淀放置于通风橱中自然干燥，获得糖基化修饰的油体膜蛋白。
83.实施例3
84.(1)与实施例1的制备方法一致；
85.(2)按照质量比为1：1的比例将油脂体与葡聚糖10k溶液(葡聚糖10k溶液的浓度为0.2mg/ml)混合，再加入氢氧化钠溶液(氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l)调节混合溶液的ph值至11，磁力搅拌10min，将混合溶液密封置于80℃的油锅中，再以300rpm的速度搅拌反应60min，随后置于冷水中水浴冷却至28℃，再在10000rpm的条件下离心处理10min，获得上层糖基化油脂体；
86.(3)取上层糖基化油脂体，加入冷丙酮，旋涡充分反应后，离心除去多余的冷丙酮，再加入石油醚，充分反应后，旋涡离心除去多余的石油醚，再加入氯仿-甲醇溶液，充分反应后，旋涡离心除去多余的氯仿-甲醇溶液，获得沉淀，将沉淀沉淀放置于通风橱中自然干燥，获得糖基化修饰的油体膜蛋白。
87.实施例4
88.(1)与实施例1的制备方法一致；
89.(2)按照质量比为1：0.2的比例将油脂体与葡聚糖10k溶液(葡聚糖10k溶液的浓度为0.2mg/ml)混合，再加入氢氧化钠溶液(氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l)调节混合溶液的ph值至11，磁力搅拌10min，将混合溶液密封置于100℃的油浴锅中，再以300rpm的速度搅拌反应30min，随后置于冷水中水浴冷却至28℃，再在10000rpm的条件下离心处理10min，获得上层糖基化油脂体；
90.(3)取上层糖基化油脂体，加入冷丙酮，旋涡充分反应后，离心除去多余的冷丙酮，再加入石油醚，充分反应后，旋涡离心除去多余的石油醚，再加入氯仿-甲醇溶液，充分反应后，旋涡离心除去多余的氯仿-甲醇溶液，获得沉淀，将沉淀沉淀放置于通风橱中自然干燥，获得糖基化修饰的油体膜蛋白。
91.实施例5
92.(1)与实施例1的制备方法一致；
93.(2)按照质量比为1：1的比例将油脂体与葡聚糖20k溶液(葡聚糖20k溶液的浓度为0.2mg/ml)混合，再加入氢氧化钠溶液(氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l)调节混合溶液的ph值至11，磁力搅拌10min，将混合溶液密封置于80℃的油锅中，再以300rpm的速度搅拌反应60min，随后置于冷水中水浴冷却至28℃，再在10000rpm的条件下离心处理10min，获得上层糖基化油脂体；
94.(3)取上层糖基化油脂体，加入冷丙酮，旋涡充分反应后，离心除去多余的冷丙酮，再加入石油醚，充分反应后，旋涡离心除去多余的石油醚，再加入氯仿-甲醇溶液，充分反应后，旋涡离心除去多余的氯仿-甲醇溶液，获得沉淀，将沉淀沉淀放置于通风橱中自然干燥，获得糖基化修饰的油体膜蛋白。
95.实施例6
96.(1)与实施例1的制备方法一致；
97.(2)按照质量比为1：0.2的比例将油脂体与葡聚糖20k溶液(葡聚糖20k溶液的浓度为0.2mg/ml)混合，再加入氢氧化钠溶液(氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l)调节混合溶液的ph值至11，磁力搅拌10min，将混合溶液密封置于100℃的油浴锅中，再以300rpm的速度搅拌反应30min，随后置于冷水中水浴冷却至28℃，再在10000rpm的条件下离心处理10min，获得上层糖基化油脂体；
98.(3)取上层糖基化油脂体，加入冷丙酮，旋涡充分反应后，离心除去多余的冷丙酮，再加入石油醚，充分反应后，旋涡离心除去多余的石油醚，再加入氯仿-甲醇溶液，充分反应后，旋涡离心除去多余的氯仿-甲醇溶液，获得沉淀，将沉淀沉淀放置于通风橱中自然干燥，获得糖基化修饰的油体膜蛋白。
99.实施例7
100.(1)与实施例1的制备方法一致；
101.(2)按照质量比为1：0.5的比例将油脂体与葡聚糖5k溶液(葡聚糖5k溶液的浓度为0.2mg/ml)，再加入氢氧化钠溶液(氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l)调节混合溶液的ph值至11，磁力搅拌10min，将混合溶液密封置于80℃的油锅中，再以300rpm的速度搅拌反应60min，随后置于冷水中水浴冷却至28℃，再在10000的条件下离心处理10min，获得上层糖
基化油脂体；
102.(3)取上层糖基化油脂体，加入冷丙酮，旋涡离充分反应后，心除去多余的冷丙酮，再加入石油醚，充分反应后，旋涡离心除去多余的石油醚，再加入氯仿-甲醇溶液，充分反应后，旋涡离心除去多余的氯仿-甲醇溶液，获得沉淀，将沉淀沉淀放置于通风橱中自然干燥，获得糖基修饰油体膜蛋白。
103.实施例8
104.(1)与实施例1的制备方法一致；
105.(2)按照质量比为1：2的比例将油脂体与葡聚糖5k溶液(葡聚糖5k溶液的浓度为0.2mg/ml)，再加入氢氧化钠溶液(氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l)调节混合溶液的ph值至11，磁力搅拌10min，将混合溶液密封置于80℃的油锅中，再以300rpm的速度搅拌反应60min，随后置于冷水中水浴冷却至28℃，再在10000的条件下离心处理10min，获得上层糖基化油脂体；
106.(3)取上层糖基化油脂体，加入冷丙酮，旋涡离充分反应后，心除去多余的冷丙酮，再加入石油醚，充分反应后，旋涡离心除去多余的石油醚，再加入氯仿-甲醇溶液，充分反应后，旋涡离心除去多余的氯仿-甲醇溶液，获得沉淀，将沉淀沉淀放置于通风橱中自然干燥，获得糖基修饰油体膜蛋白。
107.实施例9
108.(1)与实施例1的制备方法一致；
109.(2)按照质量比为1：0.5的比例将油脂体与葡聚糖10k溶液(葡聚糖10k溶液的浓度为0.2mg/ml)，再加入氢氧化钠溶液(氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l)调节混合溶液的ph值至11，磁力搅拌10min，将混合溶液密封置于80℃的油锅中，再以300rpm的速度搅拌反应60min，随后置于冷水中水浴冷却至28℃，再在10000的条件下离心处理10min，获得上层糖基化油脂体；
110.(3)取上层糖基化油脂体，加入冷丙酮，旋涡离充分反应后，心除去多余的冷丙酮，再加入石油醚，充分反应后，旋涡离心除去多余的石油醚，再加入氯仿-甲醇溶液，充分反应后，旋涡离心除去多余的氯仿-甲醇溶液，获得沉淀，将沉淀沉淀放置于通风橱中自然干燥，获得糖基修饰油体膜蛋白。
111.实施例10
112.(1)与实施例1的制备方法一致；
113.(2)按照质量比为1：2的比例将油脂体与葡聚糖10k溶液(葡聚糖10k溶液的浓度为0.2mg/ml)，再加入氢氧化钠溶液(氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l)调节混合溶液的ph值至11，磁力搅拌10min，将混合溶液密封置于80℃的油锅中，再以300rpm的速度搅拌反应60min，随后置于冷水中水浴冷却至28℃，再在10000的条件下离心处理10min，获得上层糖基化油脂体；
114.(3)取上层糖基化油脂体，加入冷丙酮，旋涡离充分反应后，心除去多余的冷丙酮，再加入石油醚，充分反应后，旋涡离心除去多余的石油醚，再加入氯仿-甲醇溶液，充分反应后，旋涡离心除去多余的氯仿-甲醇溶液，获得沉淀，将沉淀沉淀放置于通风橱中自然干燥，获得糖基修饰油体膜蛋白。
115.实施例11
116.(1)与实施例1的制备方法一致；
117.(2)按照质量比为1：0.5的比例将油脂体与葡聚糖20k溶液(葡聚糖20k溶液的浓度为0.2mg/ml)，再加入氢氧化钠溶液(氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l)调节混合溶液的ph值至11，磁力搅拌10min，将混合溶液密封置于80℃的油锅中，再以300rpm的速度搅拌反应60min，随后置于冷水中水浴冷却至28℃，再在10000的条件下离心处理10min，获得上层糖基化油脂体；
118.(3)取上层糖基化油脂体，加入冷丙酮，旋涡离充分反应后，心除去多余的冷丙酮，再加入石油醚，充分反应后，旋涡离心除去多余的石油醚，再加入氯仿-甲醇溶液，充分反应后，旋涡离心除去多余的氯仿-甲醇溶液，获得沉淀，将沉淀沉淀放置于通风橱中自然干燥，获得糖基修饰油体膜蛋白。
119.实施例12
120.(1)与实施例1的制备方法一致；
121.(2)按照质量比为1：2的比例将油脂体与葡聚糖20k溶液(葡聚糖20k溶液的浓度为0.2mg/ml)，再加入氢氧化钠溶液(氢氧化钠溶液的浓度为2mol/l)调节混合溶液的ph值至11，磁力搅拌10min，将混合溶液密封置于80℃的油锅中，再以300rpm的速度搅拌反应60min，随后置于冷水中水浴冷却至28℃，再在10000的条件下离心处理10min，获得上层糖基化油脂体；
122.(3)取上层糖基化油脂体，加入冷丙酮，旋涡离充分反应后，心除去多余的冷丙酮，再加入石油醚，充分反应后，旋涡离心除去多余的石油醚，再加入氯仿-甲醇溶液，充分反应后，旋涡离心除去多余的氯仿-甲醇溶液，获得沉淀，将沉淀沉淀放置于通风橱中自然干燥，获得糖基修饰油体膜蛋白。
123.需要说明的是，上述实施例1至实施例12中用到的商品化油茶种植均为浙江衢州白花油茶。
124.对比例
125.未改性油体膜蛋白(溶解度为14
±
1μg/ml)。
126.性能测试
127.(1)溶解度测试
128.取实施例1至实施例9制备的糖基修饰油体膜蛋白、以及对比例中的油体蛋白，超声波处理10min，旋涡处理30min，重复5次，再在10000rpm的条件下离心处理3min，取上层清液，使用thermo scientific pierce bca试剂盒测定蛋白质的溶解度，根据其操作方法配制不同浓度的牛血清蛋白制作标准曲线(y＝0.8333x+0.2104，r2＝0.99)，采用酶标仪，读取562nm处的吸光度；将样品稀释以获得标准曲线范围内的吸光度值，然后进行样品浓度测定测试结果如图3所示。
129.由图3可以得出：在相同的反应条件下，反应的温度越高，获得的糖基修饰油体膜蛋白的溶解度越高，当温度达到峰值时，溶解度再次下降；这是因为当反应体系中，糖含量增加时，在单位体积内每个蛋白质分子可以接触的糖分子增加，如此一来，为糖基反应创造了条件，可以提升糖蛋白的生成量和反应速率；故，不仅能够增加糖基修饰油体膜蛋白的溶解度，还提升整个反应的速率，加快制备时间。
130.(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳sds-page
131.取实施例1至实施例9制备的糖基修饰油体膜蛋白、以及对比例中的油体蛋白；将其置于10000rpm的条件下离心处理10min，再分别稀释稀释10倍，取40μl于2ml离心管中，加入上样缓冲液10μl，沸水煮10min，再在3000rpm的条件下离心处理60s，获得样品；按照制胶配方进行制备分离胶(15％)和浓缩胶(5％)，将处理好的样品和蛋白质marker取5～10μl上样，电泳在恒流模式(60v)下进行，运行90min后取出凝胶，采用考马斯亮蓝染液染30min，后脱，最后用凝胶成像仪拍照并分析，结果如图4所示。
132.由图4可以得出：油茶油体膜蛋白分子质量约在14kda和27kda，经糖基化反应后，油体膜蛋白分子质量提升，且随着加糖量的增多，反应温度升高，反应时间延长，油体膜蛋白分子质量提升幅度逐渐增大，糖基化油体膜蛋白最大分子质量可达14.7kda，证明葡聚糖-油体膜蛋白共聚物的形成。
133.(3)外观测试
134.取实施例1至实施例12制备的糖基修饰油体膜蛋白、以及对比例中的油体蛋白观察其修饰后的油体蛋白的形态，结果如图2所示。
135.由图2可以得出：随着糖溶液与油脂体的体积比减小，在单位体积内每个蛋白质分子可以接触的糖分子减小，导致改性的蛋白质逐渐减小，因此，通过增加糖溶液的含量，能够增大油脂体内蛋白质的改性效果。
136.以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：

1.一种原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：提取油脂体；将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体；向所述上层糖基化油脂体中加入冷丙酮，离心，再加入石油醚，离心，再加入氯仿-甲醇混合液，离心获得沉淀，将所述沉淀干燥，获得糖基化修饰油体膜蛋白。2.如权利要求1所述的原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，其特征在于，将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体的步骤中，所述糖溶液与所述油脂体的质量比为1：(0.2～5)。3.如权利要求1所述的原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，其特征在于，将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体的步骤中，所述加热反应的温度为60～100℃。4.如权利要求1所述的原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，其特征在于，将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体的步骤中，所述加热反应的时间为30～90min。5.如权利要求1所述的原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，其特征在于，将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体的步骤中，所述糖溶液包括葡聚糖5k溶液、葡聚糖10k溶液和葡聚糖20k溶液中的任意一种。6.如权利要求1所述的原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，其特征在于，将所述油脂体与糖溶液混合，再加入ph调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体的步骤包括：将所述油脂体与糖溶液混合，获得混合溶液；向所述混合溶液中加入氢氧化钠溶液直至ph值不低于9.0，加热到反应结束，获得反应物；在10000～12000rpm的条件下离心处理所述反应物10～15min，获得上层糖基化油脂体。7.如权利要求1所述的原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，其特征在于，向所述上层糖基化油脂体内加入冷丙酮，离心，再加入石油醚，离心，再加入氯仿-甲醇混合液，离心获得沉淀，将所述沉淀干燥，获得糖基化修饰油体膜蛋白的步骤中，所述上层糖基化油脂体与所述冷丙酮的体积比为1：(2.5～3)；和/或，所述上层糖基化油脂体与所述石油醚的体积比为1：(2.5～3)；和/或，所述上层糖基化油脂体与所述氯仿-甲醇混合液的体积比为1：(2.5～3)。8.如权利要求1所述的原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，其特征在于，向所述上层糖基化油脂体中加入冷丙酮，离心，再加入石油醚，离心，再加入氯仿-甲醇混合液，离心获得沉淀，将所述沉淀干燥，获得糖基化修饰油体膜蛋白的步骤包括：
向所述上层糖基化油脂体中加入冷丙酮，旋涡后离心，获得第一沉淀产物；向所述第一沉淀产物中加入石油醚，旋涡后离心，获得第二沉淀产物；向所述第二沉淀产物中加入氯仿-甲醇混合液，旋涡离心后获得第三沉淀产物，干燥处理所述第三沉淀产物，获得糖基化修饰油体膜蛋白。9.如权利要求1所述的原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法，其特征在于，提取油脂体的步骤包括：将样品粉碎，加入超纯水，搅拌均匀、匀浆、过滤，获得滤液；向所述滤液中加入蔗糖，调节ph值至不小于9，搅拌离心获得上层膏状物；用8m尿素溶液清洗所述上层膏状物后离心，重复2～3次，获得油脂体。

技术总结

本发明公开一种原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法；所述原位界面糖基化修饰油体膜蛋白的制备方法包括以下步骤：提取油脂体；将所述油脂体与糖溶液混合，再加入pH调节剂，加热反应，离心，获得上层糖基化油脂体；向所述上层糖基化油脂体中加入冷丙酮，离心，再加入石油醚，离心，再加入氯仿-甲醇混合液，离心获得沉淀，将所述沉淀干燥，获得糖基化修饰的油体膜蛋白。本发明旨在解决现有油脂体的改性方法成本高、操作过程复杂、产量低的问题。产量低的问题。产量低的问题。