作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-miR-184-3p及其应用

作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p及其应用
技术领域
1.本发明属于多房棘球蚴病诊断领域，具体涉及作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p及其应用。

背景技术：

2.多房棘球蚴病是由多房棘球绦虫感染引起的一种寄生虫病，主要诊断方法为影像学检查和包虫抗体检测，确诊依赖术中和术后的病理学检查。
3.影像学检查有时并不能看到清楚的病灶，抗体检测有时也呈假阳性或假阴性，这两种方法都不能在术前明确诊断该疾病。

技术实现要素：

4.本发明提供了作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p及其应用，用以解决影像学检查有时并不能看到清楚的病灶，抗体检测有时也呈假阳性或假阴性，这两种方法都不能在术前明确诊断该疾病的技术问题。
5.为解决上述技术问题，本发明提供的作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p，包括以下制备步骤：
6.s01：提取感染多房棘球蚴病小鼠腹腔中的包囊，剪碎过滤，提取出包囊中的头节；
7.s02：培养3天后，头节已分泌一定量的外泌体；
8.s03：观察头节活力良好、无污染，提取的上清液进行超速离心，分离得到外泌体；
9.s04：高通量测序检测外泌体中的mirnas，将得到的mirnas与多房棘球蚴基因库做对比，保留多房棘球蚴的mirnas；
10.s05：将上述得到的mirnas筛选出表达量最高的10个mirna；
11.s06：以10名多房棘球蚴病患者，10名健康人的血浆外泌体，分别提取外泌体总rna，用qpcr的方法分别检测10个mirna差异变化；
12.s07：最终发现到1个mirna在两组中具有显著表达差异，差异具有统计学意义。
13.优选的，所述步骤s05中，10个mirna分别为emu-let-7-5p、emu-mir-1-3p、emu-mir-9-5p、emu-mir-61-3p、emu-mir-71-5p、emu-mir-184-3p、emu-mir-190-5p、emu-mir-277a-3p、emu-mir-745-3p、emu-mir-4989-3p。
14.优选的，所述步骤s07中，相对表达量p《0.05。
15.作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p应用，包括以下应用步骤：
16.t01：首先抽取待检查病患者外周血，并进行高速离心，获得血浆外泌体；
17.t02：验证血浆外泌体相对表达量；
18.t03：对比相对表达量；
19.t04：出具检测结果。
20.优选的，所述总部后t01中，外周血的抽取量为15ml，血浆外泌体的量至少为5ml。
21.优选的，所述步骤t02中，利用qpcr的方法验证外泌体中emu-mir-184-3p的相对表达量。
22.优选的，所述步骤t03中，患病患者emu-mir-184-3p的相对表达量在1.6左右上下波动，未患病患者emu-mir-184-3p的相对表达量在8.6左右上下波动
23.本发明相比现有技术具有以下优点：
24.本发明的作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p及其应用，在多房棘球蚴病患者和健康人的血浆外泌体中验证到mu-mir-184-3p的基因序列，这段序列可作为早期多房棘球蚴病患者的候选诊断指标，为多房棘球蚴病的诊断提供一种新的方法。
附图说明
25.图1为本发明作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p及其应用的结构图；
26.图2为本发明作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p及其应用中患病组和对照组emu-mir-184-3p相对表达的散点图；
具体实施方式
27.请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p，包括以下制备步骤：
28.s01：提取感染多房棘球蚴病小鼠腹腔中的包囊，剪碎过滤，提取出包囊中的头节；
29.s02：培养3天后，头节已分泌一定量的外泌体；
30.s03：观察头节活力良好、无污染，提取的上清液进行超速离心，分离得到外泌体；
31.s04：高通量测序检测外泌体中的mirnas，将得到的mirnas与多房棘球蚴基因库做对比，保留多房棘球蚴的mirnas；
32.s05：将上述得到的mirnas筛选出表达量最高的10个mirna；
33.s06：以10名多房棘球蚴病患者，10名健康人的血浆外泌体，分别提取外泌体总rna，用qpcr的方法分别检测10个mirna差异变化；
34.s07：最终发现到1个mirna在两组中具有显著表达差异，差异具有统计学意义。
35.进一步的，步骤s05中，10个mirna分别为emu-let-7-5p、emu-mir-1-3p、emu-mir-9-5p、emu-mir-61-3p、emu-mir-71-5p、emu-mir-184-3p、emu-mir-190-5p、emu-mir-277a-3p、emu-mir-745-3p、emu-mir-4989-3p。
36.进一步的，步骤s07中，相对表达量p《0.05。
37.在本实施方式中，如图二所示，患病组和对照组emu-mir-184-3p相对表达的散点图，图中每个点代表一个样本，横坐标中control表示健康对照组，treated表示患病组，纵坐标表示每个mirna的相对表达量，星号表示p《0.05，如图所示，两组间存在统计学差异。
38.作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p应用，包括以下应用步骤：
39.t01：首先抽取待检查病患者外周血，并进行高速离心，获得血浆外泌体；
40.t02：验证血浆外泌体相对表达量；
41.t03：对比相对表达量；
42.t04：出具检测结果。
43.进一步的，所述总部后t01中，外周血的抽取量为15ml，血浆外泌体的量至少为5ml。
44.进一步的，所述步骤t02中，利用qpcr的方法验证外泌体中emu-mir-184-3p的相对表达量。
45.进一步的，所述步骤t03中，患病患者emu-mir-184-3p的相对表达量在1.6左右上下波动，未患病患者emu-mir-184-3p的相对表达量在8.6左右上下波动。
46.在本实施方式中，为疑有多房棘球蚴病的患者抽取外周血15ml，高速离心提取出至少5ml血浆外泌体，利用qpcr的方法验证外泌体中emu-mir-184-3p，若发现该mirna相对表达量很低，在1.6左右上下波动，那么该患者则患有多房棘球蚴病，相反的，若结果显示该mirna相对表达较高，在8.6左右上下波动，那么表示该患者则未患有多房棘球蚴病，该分子作为诊断标志物，有助于达到术前确诊目的，
47.在本实施方式中，请参阅附图2和表1，结果显示，健康人血浆外泌体中emu-mir-184-3p，其基因序列gggacggaagcgaaagg相对表达较高，均值约8.6，ct值一般《30，而患者血浆外泌体中此分子的相对表达很低，均值约1.6,ct值一般》30甚至大于33。
48.工作原理：在多房棘球蚴病患者和健康人的血浆外泌体中验证到emu-mir-184-3p的基因序列，这段序列可作为早期多房棘球蚴病患者的候选诊断指标，为多房棘球蚴病的诊断提供一种新的方法。
49.表1 emu-mir-184-3p验证分析表
50.51.52.53.54.55.

技术特征：

1.作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p，其特征在于：包括以下样本制备步骤：s01：提取感染多房棘球蚴病小鼠腹腔中的包囊，剪碎过滤，提取出包囊中的头节；s02：培养3天后，头节已分泌一定量的外泌体；s03：观察头节活力良好、无污染，提取的上清液进行超速离心，分离得到外泌体；s04：高通量测序检测外泌体中的mirnas，将得到的mirnas与多房棘球蚴基因库做对比，保留多房棘球蚴的mirnas；s05：将上述得到的mirnas筛选出表达量最高的10个mirna；s06：以10名多房棘球蚴病患者，10名健康人的血浆外泌体，分别提取外泌体总rna，用qpcr的方法分别检测10个mirna差异变化；s07：最终发现到1个mirna在两组中具有显著表达差异，差异具有统计学意义。2.根据权利要求1所述的作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p，其特征在于，所述步骤s05中，10个mirna分别为emu-let-7-5p、emu-mir-1-3p、emu-mir-9-5p、emu-mir-61-3p、emu-mir-71-5p、emu-mir-184-3p、emu-mir-190-5p、emu-mir-277a-3p、emu-mir-745-3p、emu-mir-4989-3p。3.根据权利要求1所述的作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p，其特征在于，所述步骤s07中，相对表达量p<0.05。4.作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p应用，其特征在于，包括以下应用步骤：t01：首先抽取待检查病患者外周血，并进行高速离心，获得血浆外泌体；t02：验证血浆外泌体相对表达量；t03：对比相对表达量；t04：出具检测结果。5.根据权利要求4所述的作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p应用，其特征在于，所述总部后t01中，外周血的抽取量为15ml，血浆外泌体的量至少为5ml。6.根据权利要求4所述的作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p应用，其特征在于，所述步骤t02中，利用qpcr的方法验证外泌体中emu-mir-184-3p的相对表达量。7.根据权利要求4所述的作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-mir-184-3p应用，其特征在于，所述步骤t03中，患病患者emu-mir-184-3p的相对表达量在1.6左右上下波动，未患病患者emu-mir-184-3p的相对表达量在8.6左右上下波动。

技术总结

本发明公开了作为多房棘球蚴病诊断标志物的血浆外泌体emu-miR-184-3p及其应用，涉及多房棘球蚴病诊断技术领域，提取感染多房棘球蚴病小鼠包囊，剪碎过滤，提取出包囊中的头节；培养3天后，头节分泌外泌体；提取的上清液进行超速离心，高通量测序检测外泌体中的miRNAs，将得到的miRNAs与多房棘球蚴基因库做对比，将得到的miRNAs筛选出表达量最高的10个miRNA；以10名多房棘球蚴病患者，10名健康人的血浆外泌体，分别提取外泌体总RNA，用qPCR的方法分别检测10个miRNA差异变化；最终发现到1个miRNA在两组中具有显著表达差异，差异具有统计学意义，本发明提供了一种有效的多房棘球蚴病分子诊断标志物，标志物检测灵敏度高，特异性强，本发明可作为多房棘球蚴病的候选诊断指标。发明可作为多房棘球蚴病的候选诊断指标。发明可作为多房棘球蚴病的候选诊断指标。