一种杂交瘤融合筛选方法与流程

1.本发明涉及杂交瘤筛选技术领域，特别涉及一种杂交瘤融合筛选方法。

背景技术：

2.杂交瘤技术，即指两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的现象。他可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能。骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体。
3.在医学中，单克隆抗体已用于疾病的诊断，其优点是诊断准确，无交叉反应。例如，单克隆抗体诊断乙型肝炎及潜伏的乙型肝炎病毒，则很少发生假阴性的漏诊。单克隆抗体还可作为疾病的药物载体。单克隆抗体对靶组织有专一亲和性，故在体内有特异定位分布的特点。把抗肿瘤药物和抗某种肿瘤的单克隆抗体结合，则可使药物在体内有选择地集中向该肿瘤细胞攻击，只杀灭靶细胞，而不损伤正常组织，大大减轻了抗癌药物的副作用。
4.而目前，杂交瘤的融合方法，主要是采用，peg1450(聚乙二醇)进行融合，融合的效果差，且融合操作困难，不利于融合的进行。

技术实现要素：

5.(一)要解决的技术问题
6.本发明可以解决现有的peg1450(聚乙二醇)进行融合，融合的效果差，且融合操作困难，不利于融合的进行的难题。
7.(二)技术方案
8.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案，一种杂交瘤融合筛选方法，具体包括如下步骤：
9.s1、取5-7皿小鼠骨髓瘤细胞于生物安全柜台面，晃动并弃去培养基上清及漂浮细胞，每皿加入3-5ml基础培养基，并吹下细胞，将所有细胞收集于50ml离心管中，并在900-1100rpm下离心4-6分钟，获得初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞；
10.s2、用适量培养基重悬初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞并计数，控制细胞数量在10
7-108；
11.s3、获取小鼠b细胞；
12.s4、将小鼠b细胞，在900-1100rpm下离心9-11min，弃去上清，加入适量红细胞裂解液重悬，静置5-7分钟，获得初步处理后的小鼠b细胞；
13.s5、用培养基重悬初步处理后的小鼠b细胞并计数，控制细胞数量在10
7-108；
14.s6、将s5中获取的小鼠b细胞与s2中获取的小鼠骨髓瘤细胞，按照数量1:1-2:1混匀，在900-1100rpm下离心9-11min，弃去上清，获得初步混合细胞；
15.s7、用融合缓冲液重悬初步混合细胞，在900-1100rpm下离心9-11min，并重复离心一次，获得初步融合细胞；
16.s8、用融合缓冲液调整细胞密度为1*e7/ml并混匀，将细胞转入融合池中；
17.s9、设定融合参数，设备电压75v、设备电流形式ac、设备运行时间30s，融合瞬时电压1500v、融合时间40us；融合循环1次，post fusion ac 3s，按照参数进行融合；
18.s10、将融合的细胞转入hat培养基中，融合池用hat培养基清洗一次回收残留的细胞；
19.s11、按照b细胞的密度铺孔板，维持细胞数量在10
4-105/孔，并在37℃培养，筛选后即获得杂交瘤融合细胞。
20.作为本发明的一种优选技术方案，所述s2中，适量培养基的具体数值为18-22ml，此培养基的类型为1640培养基。
21.作为本发明的一种优选技术方案，所述s3中，获取小鼠b细胞的具体步骤为：
22.s31、将小鼠摘眼球采血，脫颈致死，并用75％酒精浸泡消毒；
23.s32、在生物安全柜中用无菌手术器械无菌取脾脏；
24.s33、将滤网放在离心管中；
25.s34、脾脏置于离心管的滤网中，用培养基润洗脾脏；
26.s35、用研磨棒研磨脾脏，并用培养基冲洗滤网和利用研磨棒收集b细胞。
27.作为本发明的一种优选技术方案，所述s33中和s34中，滤网的孔径在0.2-0.3μm。
28.作为本发明的一种优选技术方案，所述s34和所述s35中，培养基选用1640培养基，且s34中，润洗脾脏的培养基数量为1-3ml。
29.作为本发明的一种优选技术方案，所述s4中，红细胞裂解液的数值为4-6ml，且红细胞裂解液按滴添加的方式加入，并在加入的过程中人工搅拌。
30.作为本发明的一种优选技术方案，所述s2和所述s5中，细胞数量的控制采用刺激细胞分类或抑制细胞分裂的方式进行。
31.作为本发明的一种优选技术方案，所述s8中，单个融合池中的细胞转入量为0.8-1.2ml。
32.作为本发明的一种优选技术方案，所述s11中，孔板选用36孔板、72孔板或96孔板。
33.(三)有益效果
34.1.本发明提供的杂交瘤融合筛选方法，利用电融合的方式，获取小鼠b细胞与小鼠骨髓瘤细胞的杂交瘤细胞，融合的效果好，操作方便；
35.2.本发明提供的杂交瘤融合筛选方法，利用小鼠眼球部位获取b细胞，便于操作人员操作和获取b细胞。
附图说明
36.为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
37.图1是本发明的流程示意框图；
38.图2是本发明的获取小鼠b细胞的流程示意框图。
39.本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
40.为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
41.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
42.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
43.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“上”、“下”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
44.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
45.实施例1
46.如图1至图2所示，一种杂交瘤融合筛选方法，具体包括如下步骤：
47.s1、取5-7皿小鼠骨髓瘤细胞于生物安全柜台面，晃动并弃去培养基上清及漂浮细胞，每皿加入3-5ml基础培养基，并吹下细胞，将所有细胞收集于50ml离心管中，并在900-1100rpm下离心4-6分钟，获得初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞；
48.s2、用18-22ml 1640培养基重悬初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞并计数，采用刺激细胞分类或抑制细胞分裂的方式，控制细胞数量在10
7-108；
49.s3、获取小鼠b细胞；
50.s4、将小鼠b细胞，在900-1100rpm下离心9-11min，弃去上清，加入4-6ml红细胞裂解液重悬，红细胞裂解液按滴添加的方式加入，并在加入的过程中人工搅拌后，静置5-7分钟，获得初步处理后的小鼠b细胞；
51.s5、用培养基重悬初步处理后的小鼠b细胞并计数，采用刺激细胞分类或抑制细胞分裂的方式，控制细胞数量在10
7-108；
52.s6、将s5中获取的小鼠b细胞与s2中获取的小鼠骨髓瘤细胞，按照数量1:1-2:1混匀，在900-1100rpm下离心9-11min，弃去上清，获得初步混合细胞；
53.s7、用融合缓冲液重悬初步混合细胞，在900-1100rpm下离心9-11min，并重复离心一次，获得初步融合细胞；
54.s8、用融合缓冲液调整细胞密度为1*e7/ml并混匀，将细胞转入融合池中，转入量为每池0.8-1.2ml；
55.s9、设定融合参数，设备电压75v、设备电流形式ac、设备运行时间30s，融合瞬时电压1500v、融合时间40us；融合循环1次，post fusion ac 3s，按照参数进行融合；
56.s10、将融合的细胞转入hat培养基中，融合池用hat培养基清洗一次回收残留的细胞；
57.s11、按照b细胞的密度铺36、72或96孔板，维持细胞数量在10
4-105/孔，并在37℃培养，筛选后即获得杂交瘤融合细胞。
58.在本实施例中，获取小鼠b细胞的具体步骤为：
59.s31、将小鼠摘眼球采血，脫颈致死，并用75％酒精浸泡消毒；
60.s32、在生物安全柜中用无菌手术器械无菌取脾脏；
61.s33、将0.2-0.3μm孔径的滤网放在离心管中；
62.s34、脾脏置于离心管中0.2-0.3μm孔径的滤网中，用1-3ml1640培养基润洗脾脏；
63.s35、用研磨棒研磨脾脏，并用1640培养基冲洗滤网和利用研磨棒收集b细胞。
64.实施例2
65.s1、取5皿小鼠骨髓瘤细胞于生物安全柜台面，晃动并弃去培养基上清及漂浮细胞，每皿加入5ml基础培养基，并吹下细胞，将所有细胞收集于50ml离心管中，并在900rpm下离心6分钟，获得初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞；
66.s2、用18ml 1640培养基重悬初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞并计数，采用刺激细胞分类或抑制细胞分裂的方式，控制细胞数量在10
7-108；
67.s3、获取小鼠b细胞；
68.s4、将小鼠b细胞，在900rpm下离心11min，弃去上清，加入4ml红细胞裂解液重悬，红细胞裂解液按滴添加的方式加入，并在加入的过程中人工搅拌后，静置5分钟，获得初步处理后的小鼠b细胞；
69.s5、用培养基重悬初步处理后的小鼠b细胞并计数，采用刺激细胞分类或抑制细胞分裂的方式，控制细胞数量在10
7-108；
70.s6、将s5中获取的小鼠b细胞与s2中获取的小鼠骨髓瘤细胞，按照数量1:1混匀，在900rpm下离心11min，弃去上清，获得初步混合细胞；
71.s7、用融合缓冲液重悬初步混合细胞，在900rpm下离心11min，并重复离心一次，获得初步融合细胞；
72.s8、用融合缓冲液调整细胞密度为1*e7/ml并混匀，将细胞转入融合池中，转入量为每池0.8ml；
73.s9、设定融合参数，设备电压75v、设备电流形式ac、设备运行时间30s，融合瞬时电压1500v、融合时间40us；融合循环1次，post fusion ac 3s，按照参数进行融合；
74.s10、将融合的细胞转入hat培养基中，融合池用hat培养基清洗一次回收残留的细胞；
75.s11、按照b细胞的密度铺36孔板，维持细胞数量在10
4-105/孔，并在37℃培养，筛选后即获得杂交瘤融合细胞。
76.在本实施例中，获取小鼠b细胞的具体步骤为：
77.s31、将小鼠摘眼球采血，脫颈致死，并用75％酒精浸泡消毒；
78.s32、在生物安全柜中用无菌手术器械无菌取脾脏；
79.s33、将0.2μm孔径的滤网放在离心管中；
80.s34、脾脏置于离心管中0.2μm孔径的滤网中，用1ml 1640培养基润洗脾脏；
81.s35、用研磨棒研磨脾脏，并用1640培养基冲洗滤网和利用研磨棒收集b细胞。
82.实施例3
83.s1、取6皿小鼠骨髓瘤细胞于生物安全柜台面，晃动并弃去培养基上清及漂浮细胞，每皿加入4ml基础培养基，并吹下细胞，将所有细胞收集于50ml离心管中，并在1000rpm下离心5分钟，获得初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞；
84.s2、用20ml 1640培养基重悬初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞并计数，采用刺激细胞分类或抑制细胞分裂的方式，控制细胞数量在10
7-108；
85.s3、获取小鼠b细胞；
86.s4、将小鼠b细胞，在1000rpm下离心10min，弃去上清，加入5ml红细胞裂解液重悬，红细胞裂解液按滴添加的方式加入，并在加入的过程中人工搅拌后，静置6分钟，获得初步处理后的小鼠b细胞；
87.s5、用培养基重悬初步处理后的小鼠b细胞并计数，采用刺激细胞分类或抑制细胞分裂的方式，控制细胞数量在10
7-108；
88.s6、将s5中获取的小鼠b细胞与s2中获取的小鼠骨髓瘤细胞，按照数量1.5:1混匀，在1000rpm下离心10min，弃去上清，获得初步混合细胞；
89.s7、用融合缓冲液重悬初步混合细胞，在1000rpm下离心10min，并重复离心一次，获得初步融合细胞；
90.s8、用融合缓冲液调整细胞密度为1*e7/ml并混匀，将细胞转入融合池中，转入量为每池1.0ml；
91.s9、设定融合参数，设备电压75v、设备电流形式ac、设备运行时间30s，融合瞬时电压1500v、融合时间40us；融合循环1次，post fusion ac 3s，按照参数进行融合；
92.s10、将融合的细胞转入hat培养基中，融合池用hat培养基清洗一次回收残留的细胞；
93.s11、按照b细胞的密度铺96孔板，维持细胞数量在10
4-105/孔，并在37℃培养，筛选后即获得杂交瘤融合细胞。
94.在本实施例中，获取小鼠b细胞的具体步骤为：
95.s31、将小鼠摘眼球采血，脫颈致死，并用75％酒精浸泡消毒；
96.s32、在生物安全柜中用无菌手术器械无菌取脾脏；
97.s33、将0.25μm孔径的滤网放在离心管中；
98.s34、脾脏置于离心管中0.25μm孔径的滤网中，用2ml 1640培养基润洗脾脏；
99.s35、用研磨棒研磨脾脏，并用1640培养基冲洗滤网和利用研磨棒收集b细胞。
100.实施例4
101.s1、取7皿小鼠骨髓瘤细胞于生物安全柜台面，晃动并弃去培养基上清及漂浮细胞，每皿加入3ml基础培养基，并吹下细胞，将所有细胞收集于50ml离心管中，并在1100rpm下离心4分钟，获得初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞；
102.s2、用22ml 1640培养基重悬初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞并计数，采用刺激细胞分类或抑制细胞分裂的方式，控制细胞数量在10
7-108；
103.s3、获取小鼠b细胞；
104.s4、将小鼠b细胞，在1100rpm下离心9min，弃去上清，加入4-6ml红细胞裂解液重悬，红细胞裂解液按滴添加的方式加入，并在加入的过程中人工搅拌后，静置7分钟，获得初步处理后的小鼠b细胞；
105.s5、用培养基重悬初步处理后的小鼠b细胞并计数，采用刺激细胞分类或抑制细胞分裂的方式，控制细胞数量在10
7-108；
106.s6、将s5中获取的小鼠b细胞与s2中获取的小鼠骨髓瘤细胞，按照数量2:1混匀，在1100rpm下离心9min，弃去上清，获得初步混合细胞；
107.s7、用融合缓冲液重悬初步混合细胞，在1100rpm下离心9min，并重复离心一次，获得初步融合细胞；
108.s8、用融合缓冲液调整细胞密度为1*e7/ml并混匀，将细胞转入融合池中，转入量为每池1.2ml；
109.s9、设定融合参数，设备电压75v、设备电流形式ac、设备运行时间30s，融合瞬时电压1500v、融合时间40us；融合循环1次，post fusion ac 3s，按照参数进行融合；
110.s10、将融合的细胞转入hat培养基中，融合池用hat培养基清洗一次回收残留的细胞；
111.s11、按照b细胞的密度铺72孔板，维持细胞数量在10
4-105/孔，并在37℃培养，筛选后即获得杂交瘤融合细胞。
112.在本实施例中，获取小鼠b细胞的具体步骤为：
113.s31、将小鼠摘眼球采血，脫颈致死，并用75％酒精浸泡消毒；
114.s32、在生物安全柜中用无菌手术器械无菌取脾脏；
115.s33、将0.3μm孔径的滤网放在离心管中；
116.s34、脾脏置于离心管中0.3μm孔径的滤网中，用3ml 1640培养基润洗脾脏；
117.s35、用研磨棒研磨脾脏，并用1640培养基冲洗滤网和利用研磨棒收集b细胞。
118.综上所述：利用电融合的方式，获取小鼠b细胞与小鼠骨髓瘤细胞的杂交瘤细胞，融合的效果好，操作方便；利用小鼠眼球部位获取b细胞，便于操作人员操作和获取b细胞。
119.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种杂交瘤融合筛选方法，其特征在于，具体包括如下步骤：s1、取5-7皿小鼠骨髓瘤细胞于生物安全柜台面，晃动并弃去培养基上清及漂浮细胞，每皿加入3-5ml基础培养基，并吹下细胞，将所有细胞收集于50ml离心管中，并在900-1100rpm下离心4-6分钟，获得初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞；s2、用适量培养基重悬初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞并计数，控制细胞数量在10
7-108；s3、获取小鼠b细胞；s4、将小鼠b细胞，在900-1100rpm下离心9-11min，弃去上清，加入适量红细胞裂解液重悬，静置5-7分钟，获得初步处理后的小鼠b细胞；s5、用培养基重悬初步处理后的小鼠b细胞并计数，控制细胞数量在10
7-108；s6、将s5中获取的小鼠b细胞与s2中获取的小鼠骨髓瘤细胞，按照数量1:1-2:1混匀，在900-1100rpm下离心9-11min，弃去上清，获得初步混合细胞；s7、用融合缓冲液重悬初步混合细胞，在900-1100rpm下离心9-11min，并重复离心一次，获得初步融合细胞；s8、用融合缓冲液调整细胞密度为1*e7/ml并混匀，将细胞转入融合池中；s9、设定融合参数，设备电压75v、设备电流形式ac、设备运行时间30s，融合瞬时电压1500v、融合时间40us；融合循环1次，post fusion ac 3s，按照参数进行融合；s10、将融合的细胞转入hat培养基中，融合池用hat培养基清洗一次回收残留的细胞；s11、按照b细胞的密度铺孔板，维持细胞数量在10
4-105/孔，并在37℃培养，筛选后即获得杂交瘤融合细胞。2.根据权利要求1所述的一种杂交瘤融合筛选方法，其特征在于：所述s2中，适量培养基的具体数值为18-22ml，此培养基的类型为1640培养基。3.根据权利要求1或2所述的一种杂交瘤融合筛选方法，其特征在于：所述s3中，获取小鼠b细胞的具体步骤为：s31、将小鼠摘眼球采血，脫颈致死，并用75％酒精浸泡消毒；s32、在生物安全柜中用无菌手术器械无菌取脾脏；s33、将滤网放在离心管中；s34、脾脏置于离心管的滤网中，用培养基润洗脾脏；s35、用研磨棒研磨脾脏，并用培养基冲洗滤网和利用研磨棒收集b细胞。4.根据权利要求3所述的一种杂交瘤融合筛选方法，其特征在于：所述s33中和s34中，滤网的孔径在0.2-0.3μm。5.根据权利要求1所述的一种杂交瘤融合筛选方法，其特征在于：所述s34和所述s35中，培养基选用1640培养基，且s34中，润洗脾脏的培养基数量为1-3ml。6.根据权利要求1所述的一种杂交瘤融合筛选方法，其特征在于：所述s4中，红细胞裂解液的数值为4-6ml，且红细胞裂解液按滴添加的方式加入，并在加入的过程中人工搅拌。7.根据权利要求1所述的一种杂交瘤融合筛选方法，其特征在于：所述s2和所述s5中，细胞数量的控制采用刺激细胞分类或抑制细胞分裂的方式进行。8.根据权利要求1所述的一种杂交瘤融合筛选方法，其特征在于：所述s8中，单个融合池中的细胞转入量为0.8-1.2ml。9.根据权利要求1所述的一种杂交瘤融合筛选方法，其特征在于：所述s11中，孔板选用
36孔板、72孔板或96孔板。

技术总结

本发明公开了一种杂交瘤融合筛选方法，包括用适量培养基重悬初步处理后的小鼠骨髓瘤细胞并计数；获取小鼠B细胞；获取初步处理后的小鼠B细胞；用培养基重悬初步处理后的小鼠B细胞并计数；获得小鼠B细胞与小鼠骨髓瘤细胞的初步混合细胞；获得初步融合细胞；将细胞转入融合池中；电融合；将融合的细胞转入HAT培养基中；并在37℃培养，筛选后即获得杂交瘤融合细胞。本发明中，利用电融合的方式，获取小鼠B细胞与小鼠骨髓瘤细胞的杂交瘤细胞，融合的效果好，操作方便。操作方便。操作方便。