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[2016-14-26修回〕
(编辑杜娟)
利用转录组学数据探究阿尔茨海默病与食管癌的关联
殷晓莎田肃岩（吉林大学第一医院临床研究部，吉林长春20621）
〔摘要〕目的利用转录组数据，从基因和通路探索阿尔茨海默病（AD）和食管癌（EC）的关联。方法从基因表达综合数据库（GEO）中下载AD数据集（GSE4C354），分别对大脑4个区（海马、内嗅皮质、上额叶皮质、后中央回）的AD组与健康组使用R/mma包进行稳健t检验，获得差异表达基因（I d/FC I>1,FDR<6.2-）；从癌症基因组图谱（TCGA）中下载EC数据集，对肿瘤组织和癌旁正常组织的基因表达值进行稳健t检验，进行差异表达基因分析（I w UFCI-FDR v//-）。使用R cPpterPmfUer包对AD和EC的差异表达基因进行富集分析。结果AD和EC共享的差异表达基因有白细胞分化抗原（CD）44、生长抑素（SST）、CD86、核糖核酸输出因子（RAE）2嗜铬粒蛋白（CHG）A等19个，其中有报道表明CD44、CD86与AD和EC均有关联。CD44在两病中均上调，且高表达的EC患者预后差;CD86在两病中也均上调，但其表达水平和预后无关（P> 6.69）o对AD和EC的差异表达基因进行富集分析，得到8个共享的基因本体论（GO）注释，结果显示AD和EC的差异表达基因同时富集在内吞作用的调节、肽基酪氨酸磷酸化的正调控、神经元死亡等功能路径。结论利用转录组数据发现AD与EC间存在关联。 〔关键词〕食管癌；阿尔茨海默病；差异表达基因；通路富集分析
［中图分类号〕R735.1;R749.16;Q811.4［文献标识码〕A［文章编号〕1005-9200（2001）06-1165-07:doi2962/j.issn2005-9201.2021.06.213
阿尔茨海默病（AD）是一种常见的神经退行性疾病，多见于77岁以上人，占痴呆症患者的
基金项目：吉林省教育厅"十三五”科学技术项目（JJKH20190032KJ）通信作者：田肃岩（1977-），女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事生物统计研究。
第一作者：殷晓莎（1694-），女，硕士在读，主要从事医学大数据分析研究。66%~89%〔〕。食管癌（EC）的死亡率在癌症相关死亡中排名第六，发病率在所有癌症中排名第七〔〕，是一种常见的恶性消化道癌症。老年食管癌患者数量不断增加，且食管癌在老年人中预后更差⑶O
一些研究为AD和癌症之间的关联提供了流行病学、细胞水平及分子水平的证据。Mn等⑷的me-
O分析将队列研究中人的年龄、性别等干扰因素进行调整后发现，相较于未罹患AD的人，罹患AD的人癌症风险降低42%；相较于未罹患癌症的人，罹患癌症的人发生AD风险降低87%o YarcUonn等〔〕研究也表明，与未罹患癌症人相比，罹患癌症人AD的发生率显著降低，并检测了罹患癌症与未罹患癌症的人脑内神经原纤维缠结（NTF）和0-淀粉样蛋白（A0）水平，结果显示A0水平相似，但罹患癌症的人脑内NTF明显低于未罹患癌症的人。AD和癌症都随着年龄增长，发病率快速增高〔《〕，AD和癌症之间存在复杂的生物学关系。AD和癌症可看作是衰老的不同表现,AD中神 经元进行性死亡标志着神经元变性，细胞不受控制的增殖是癌变的特征〔〕。AD和癌症中存在相同基因发生不同方向的失调，如已知的肿瘤抑制基因P58在AD中上调，在癌症中下调⑼，死亡蛋白激酶（DAPI01在AD中上调，在癌症中失活〔4〕。
通过查阅文献发现AD和EC之间存在共享分子。氧化应激标志物4-羟基壬烯醛（4-HNE）可促进AD中A0沉积、tan蛋白磷酸化〔252〕，它在EC上皮中的含量相较于正常食管上皮显著增多，且随癌症进展而增加^83;miR-91可抑制AD中A0表达〔2〕，它在EC晚期显著升高，能诱导癌症细胞生长和侵袭〔5〕。这些证据表明AD和EC之间可能存在关联，但仍需进一步探索。随着基因芯片和二代测序技术的发展，对高通量转录组学数据进行大数据分析，能快速发现不同疾病共享的基因和通路，进而探究不同疾病之间潜在的生物学关联。本研究利用基因表达谱数据，通过识别AD和EC共享的基因和通路来探索二者间关联。
1材料方法
1.1数据来源和处理AD数据集对应基因表达综合数据库（GEO）（https：//bU nlm.nih. nva/gds/）中的GSE48394数据集，该数据集的检测芯片为AffynietUx Humnn Gesoma U138Plus
2.2Au ray。该数据集包含58个健康人的173个脑组织和29例AD患者的82例AD脑组织，这些脑组织分别来自大脑的4个区域（海马、内嗅皮质、上额叶皮层和中央后回）。EC数据集来自癌症基因组图谱（TCGA）中食道癌（ESCA）队列的RNA-seq数据，包括191例肿瘤组织和11例癌旁正常组织。
AD数据集（GSE48394）已经鲁棒多阵列平均（RMA）法背景校正和10x2转化。使用AffynietUx Humnn Gesoma U138Plus2.2Army芯片对应的注释包yhdl33pldsh.dd进行探针集和基因名的转化，如
果有多个探针集对应一个基因，则保留平均表达量最高的探针，EC数据集来自TCGA中的EC队列。AD和EC数据集测序方法、平台不一样，所包含的基因不一样，为保证AD和EC数据集中含有相同的基因，事先将两个数据集内的基因取交集得到重叠的16379个基因。
采用邦弗罗尼-霍克伯格（BH）法〔4〕对P值进行多重检验校正，调整后P值为错误发现率（FDR）。统计分析均在R语言（https：///）3.6.1版本中进行。
1.2统计方法
1.2.1筛选AD和EC的差异表达基因（DEGs）
在R语言环境下调用/umn包，对大脑4个区（海马、内嗅皮质、上额叶皮质、中央后回）AD组与健康组基因表达值分别进行稳健t检验，设置差异表达基因的阈值为I log2FC1^1,FDR<2.21，如果有基因在两个及以上脑区差异表达则取最小的FDR；对EC 的癌症组和癌旁组的基因表达值进行稳健检验，设置DEGs阈值为丨log2FC I^2FDR<2.21获得EC 的DEGs o在线工具（http：///mmformatics.psh. ugent.be/weXtools/Vexn/）绘制韦恩图，使用ggnloU 包绘制火山图。
在R语言环境下调用tinyarray包选取基因表达值的最佳截断点，并利用最佳截断点对共享基因的表达值分组（高、低表达组），对两组生存曲线进行log rand检验。KM生存曲线图使用s/mminar包
和ggnioth包绘制。
1.2.2对AD和EC DEGs的富集分析基因本体论（GO）功能注释是进行大规模功能富集研究的常用方法,GO数据库对基因的描述包括3个方面，分别为生物学过程（BP），分子功能（MF）和细胞组分（CC）。京都基因与基因组百科全书（KEGG、是一个广泛使用的数据库，它存储和基因组、生物途径、疾病、化学物质和药物有关的大量数据。富集分析是一种可以把GO和KEGG数据库中的功能和通路等进行整合计算的算法。将筛选出的AD和EC的DEGs分别在cmsterPmfimU/〕包中进行G0〔2〕功能注释和KEGG〔2〕通路富集，富集分析阈值为coanis M2,FDR<2.05。
2结果
2.1AD与EC的差异表达基因AD和EC DEGs 的重叠（AD195个,EC2345个），得到19个共享基因包括白细胞分化抗原（CD）44、生长抑素（SS）T、
CD86、泛素结合酶E2T（UBE2T）、着丝粒蛋白（CENP）W等。在AD中5个基因中有6个基因上调,13个基因下调；在EC中5个基因有7个基因上调4个基因下调，见表5AD和EC DEGs见图1标记出的5个共享基因。
2.0AD和EC DEGs富集分析AD的DEGs富集分析得到153个GO注释和6个KEGG通路；对EC 的DEGs
进行富集分析得到1371个GO注释和33个KEGG通路。最终,AD和EC没有重叠的KEGG 通路，但有8个重叠的GO注释，分别为内吞作用的调节、肽基酪氨酸磷酸化的正调控、细胞器定位的建立、神经元死亡、神经元死亡的调节、肿瘤坏死因子超家族细胞因子产生的调控、受体复合体、谷氨酸能突触，见表2o
23AD与EC相关联基因CD44.CD86在AD与EC 中均呈高表达，通过绘制CD44与CD86高、低表达组的KM生存曲线，对预后进行评估发现CD44表达值高的组预后差，而CD86高低表达组生存曲线无显著差别，表明CD86不具有预后价值。见图2o
表1AD和EC12个共享基因表达
LFC：log2差异倍数
序号基因
AD EC
LFC FDR LFC FDR 1CD44 1.3120004769600000 2SST-7068 2.026-3.04100000 3CD86 1.060002675500000 4UBE2T-758 2.022 2.84700000 5CENPW-70270000 2.58300000 6GABRD-752 2.022********* 7SH3GL2-71350000-2.21900000 8STMN2-74320000-72500000 9SERPIAA3725
0000-786300000 12RAE1-2.8740000737200000 11CHGA-757 2.002-3.46100000 12SNX14-72720000 2.37500000 13STON2754 2.002737800005 14FABP3-71310000-7299 2.026 15MAP7D2-7547 2.002-7439 2.024 5PLK2-7143000270230000 5ANKIL1 4.844 2.0027098 2.002 5PHYHD172290008-76790000 5MAL2-705 2.0217157 2.021
100 75ANKIB1100ANKIB1
90
ANKIB1
50
RAE1 2575
25
d60
-2024RAE1
30
RAE1
log2（差异倍数）内嗅皮层区-2024
log2（差异倍数）
海马区
-2.50.0 2.5 5.0
log2（差异倍数）
中央后回
ANKIB1 90
60
RAE1
30
-2.50.0 2.5 5.0
log2（差异倍数）
额上回20
15
10
5
.•UB^T
-50
log2（差异倍数）
EC
图1AD和ECDEGs
火山图
表0 AD 和EC 共享的GO 富集分析
序号
Id
GO 注释
AD EC
计数
FDR
计数
FDR 2GO ：O4341O4内吞作用的调节9434564
4. 4392GO ： 045473 2
肽基酪氨酸磷酸化的正调控
6 4. 446
49 4. 0473
GO ： 0451656细胞器定位的建立14 4.059146
4. 425
4GO ： 0474997神经元凋亡14 4. 046
77 4.0185
GO ： 1941214神经元凋亡的调节
14
434367 4. 437
6GO ： 1943555肿瘤坏死因子超家族细胞因子产生的调控
5 4. 44839
4.4137GO ： 0443235受体复合体8 4. 44992
4. 043
8
GO ： 0993975
谷氨酸能突触
12
4. 004
79 4.414
分组
十低C D44(»=138) + 高C D44(72=23)
1.00
75O 5
5 20.0.虽0.034
500
1 000 1 500
2 000
时间(d)
500
1 000 1 500
2 000
时间(d)
0.00
图0 CD44和CD86高、低表达组的KM 生存曲线
9讨论
目前还没有研究利用转录组学数据探究AD 和
EC 间的关联，本研究通过对基因表达谱数据分析, 识别AD 和EC 之间共享的异常表达基因和通路，
出将两种复杂疾病联系在一起的共享机制，探索两 种疾病的关联情况。本研究得到的共享基因中，有 些炎症相关基因已明确涉及AD 和EC 的发病，如 CD44、CD86和CHGA ，提示炎症反应可能是将两种 疾病关联起来的共同机制之一。CD44有22个外显
子，仅含有组成型外显子的CD44转录产物为标准 CD44（CD44S ） ,EC 上皮中CD44S 表达增高与E-钙 黏着蛋白在上皮-间质转化中缺失有关〔確22，这种蛋 白的缺失降低了组织内细胞的黏附力，使EC 细胞
转移和侵袭能力增强；星形胶质细胞可清除AD 脑
组织中的A0,CD44是星形胶质细胞形成过程中的
重要黏附分子，在AD 脑内，CD44阳性的星形胶质 细胞弥漫性急剧增加〔2〕，可能A0的刺激动员了星 形胶质细胞发生炎症反应,CD44因此表达升高。上
述研究均表明CD44在AD 和EC 中呈现高表达，与 本研究结果一致，通过对CD44在EC 中的预后分
析，发现CD44表达值高的组预后差，与Oemota 等⑵〕研究结果一致。
CD86是促炎性M2表型的标志物，A0可促进 小胶质细胞激活产生促炎性M1表型，促进炎症和
组织损伤,AD 中存在大量M2表型的小胶质细胞,
CD86也处于高表达状态〔3〕，这支持本研究中CD86
在AD 中上调。CD86是树突细胞表面分子，它的低 表达使得树突细胞呈递抗原的功能下降，癌细胞更
容易逃脱免疫监视。杨文锋〔5〕通过RT-PCR 检测 了 EC 组织中CD86的mRNA 水平，发现其相对于正 常对照组表达降低，推测这可能是炎症因子（转化
生长因子和白细胞介素14）导致CD86表达降低。 本研究中CD86显示在EC 中上调，与杨文锋等〔3〕 的结果不一致，可能是由于测量人的异质性或基
因多态性〔⑹导致，需要进一步设计实验验证。
嗜铬粒蛋白（CHG ） A 是一种可溶性糖蛋白，与 激素和神经肽一起存储在内分泌细胞的分泌颗粒 中，是神经内分泌肿瘤的分化标志物，参与肿瘤血管
生成和肿瘤生长调节C22,28\突触障碍可能在AD 的
病理生理中起关键作用，Lechder 等〔3〕通过免疫组 化实验发现，约44%的CHGA 免疫阳性斑块和细胞
外沉积物弥漫着活化的小胶质细胞，提示CHGA 可 能是AD 中神经元、神经胶质和炎性机制之间的
介体。
本研究还发现在共享基因中SST 与激素分泌有 关，提示激素分泌也可能是AD 和EC 中共享的潜在
机制。SST 广泛存在于下丘脑、大脑皮层、胃肠道 中，已知它通过与高亲和力的G 蛋白耦联生长抑素
受体结合而抑制许多次要激素的释放，在共享的GO注释中可发现,AD和EC的DEGs同时被富集在激素转运、激素分泌、调节介素分泌这几个激素相关的生物学功能上，提示激素可能在AD和EC中有关键
作用。SST是A01K2选择性最强的结合物，干扰A0原纤维化并促进A0装配体的形成〔6〕。Jm 等〔-〕通过实时甲基化特异性聚合酶链反应对EC 患者中SST的超甲基化进行检测，发现在食管腺癌中，天然未甲基化中的SST mRNA水平显著高于天然甲基化中的SST mRNA水平，且在鳞癌和腺癌中，SST的甲基化频率和标准化甲基化均显著高于正常对照组，表明SST的高甲基化和EC发生有关。
综上,AD和EC这两种疾病共享相同的差异表达基因，但它们在两种疾病中的差异表达方向有的相同，有的相反，这些共享的基因和通路涉及的炎症反应(如CD44、CD86)、激素释放(如SST、G0：0637160)等生物学过程可能是将AD和EC联系在一起的机制。AD和EC之间可能存在关联，关于两种疾病关联研究的证据还不充分，需要大型实验进行验证。本研究从转录组学水平，利用生物信息学的方法对AD和EC的关联进行探索，提供了两种疾病关联研究的新视角。
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豫公网安备41160202000603
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