刘新梅;张晓玲;赵宗峰;靳颖;吴卫东
【摘 要】探讨从石蜡组织中提取核酸的简便、实用方法,比较两种脱蜡方法对DNA质量的影响.取收集的20例包埋好的银屑病皮损组织,分别用二甲苯和TES溶液脱蜡、酚-氯仿提取,然后检测DNA的浓度及纯度,并用PCR扩增方法检测哪种脱蜡方法对提取DNA更有优势.结果表明,用TES溶液脱蜡提取DNA的D260/D280=1.6～1.8的比例为60％,而二甲苯脱蜡的比例为35％.从实用、快速和经济的角度综合考虑,TES溶液脱蜡、酚-氯仿提取是值得推荐的石蜡组织DNA提取方法.%To investigate a simple and practical method for extraction of nucleic acids from paraffin-embedded skin tissues, and evaluate the influences of dewaxing methods for DNA quality, twenty cases of pathology embedding psoriatic lesions tissues were selected and divided into xylene dewaxing group and improved TES dewaxing group. The results demonstrated that the ratio of OD260/ OD280 between 1. 6 and 1. 8 took 60% in DNA samples extracted by improved TES dewaxing method with water-bath, whereas it took 35% in DNA samples extracted by using xylene dewaxing method. , Considering the speed,
practical and economic point of view, the improved TES dewaxing with water-bath followd by DNA extraction using phenol-chloroform is a method worthy of recommending for paraffin embedded skin tissues.
【期刊名称】《宁夏大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2013(034)001
【总页数】3页(P67-69)
【关键词】石蜡包埋皮肤组织;TES溶液;DNA提取
【作 者】刘新梅;张晓玲;赵宗峰;靳颖;吴卫东
【作者单位】新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科,新疆乌鲁木齐830001
【正文语种】中 文
【中图分类】R361.2
在医学临床研究中，新鲜取材比较困难［1—2］，常常选择石蜡包埋的技术制成蜡块贮存标本，以供日后的回顾性研究.国内外对石蜡包埋组织（paraffinembedded tissues，PET）提取核酸也做了很多研究［3］，但从PET组织中提取基因组DNA有一定的难度.传统用二甲苯脱蜡的方法，其过程长、有毒性，并且获得的 DNA易降解、得率低［4］.如何避免DNA分子损失，保持DNA相对完整性和纯度值得探讨和研究.笔者在已有的经验和基础上，就脱蜡环节上摸索和改良，对2种方法提取PET组织中的核酸质量进行比较［5］.在传统提取DNA的方法上进行改良，成功PCR出了较长的目标片段，从而为研究DNA提供一个相对简便、成本低廉的可行方法.
1 材料与方法
1.1 实验材料
1）组织样本.取新疆维吾尔自治区人民医院皮肤科收集的20份组织，在活检后立即固定于10%中性福尔马林溶液中，然后按常规组织病理方法处理成石蜡组织块放置室温贮存备用.时间范围为2009年1月至2012年4月，均经免疫组织化学染诊断为银屑病.
2）主要试剂及仪器.二甲苯、SDS（十二烷基磺酸钠）、Tris-HCl、EDTA-Na2（乙二胺四乙酸二钠盐）、琼脂糖（北京鼎国昌盛生物技术有限责公司）；蛋白酶K（美国Sigma公司）.Nanodrop ND-1000 UV微量紫外／可见分光光度计，C1000PCR仪（美国Bio-Rad公司）.
3）试剂.TES溶液（10mmol Tris-HCl，1mmol EDTA，0.5%SDS）；TET 溶 液 （100mmol Tris-HCl，1mmol EDTA，1%TritonX-100）；消 化 裂 解 液（100mmol／L NaCl，10mmol／L Tris-HCl，25mmol／L EDTA，1%SDS，20mg／mL蛋白酶K）.
1.2 DNA提取方法
实验采用传统的二甲苯脱蜡法和改良的TES溶液水浴脱蜡法提取DNA，具体做法如下：
1.2.1 二甲苯脱蜡法 每个石蜡组织切10～15片，厚度为5μm；加入l mL二甲苯溶液，在37℃水浴锅中轻摇10min，4℃13 000r／min离心15min；小心吸去二甲苯后加入1mL无水乙醇洗涤，上下颠倒3min；4℃13 000r／min离心15min，弃去无水乙醇，此步重复3次.加入500μL消化裂解液，封口膜封口后放入55℃水浴锅中过夜，24h后取出放入99℃的水浴
锅中煮沸10min，灭活蛋白酶K.冷却至室温，每管加入等体积的饱和酚溶液，上下颠倒10min，4℃13 000r／min离心10min；取上层清液，加入等体积的V（酚）∶V（氯仿）∶V（异戊醇）=25∶24∶1的 混 合 液，上 下 翻 转 10min，4 ℃13 000r／min离心10min；取上层清液，加入等体积的V（氯仿）∶V（异戊醇）=24∶1，轻轻翻转10min，4℃13 000r／min离心10min；取上层清液，加入1mL无水乙醇和30μL的乙酸钠，混匀，-20℃过夜，24h后取出，4℃13 000r／min离心15min；加入75%的无水乙醇混匀3min后同上方式离心，室温晾晒45min后加入40μL的TE缓冲液，放置-20℃贮存.
1.2.2 改良的TES溶液水浴脱蜡法［6］ 每支试管中加入1 mL的TES溶液，混匀后放入70℃水浴30min，4℃13 000r／min离心15min，重复3次.然后加入500μL的TET溶液和30μL蛋白酶K，完全混匀后，放入37℃水浴锅中过夜.24h后取出加入500μL饱和酚，充分振荡，4℃13 000r／min离心10min；取上层清液，加入250μLTris饱和酚、250μL V（氯仿）∶V（异戊醇）=24∶1，上下翻转10min，4℃13 000r／min离心10min；取上层清液并加入1mL预冷的无水乙醇及30μL 3mol／L乙酸钠，完全混匀，-20℃过夜.24h后取出，4℃13 000r／min离心15min；弃去上层清液，加入75%的乙醇1mL，轻轻翻转3min，4℃13 000r／min离心15min；弃去上层清液，室温干燥20min，加入40μL TE缓冲液溶解DNA，于-20
℃保存.
1.3 检测DNA的质量与完整性
1.3.1 测定DNA的浓度、纯度及完整性 各取2μL的DNA，用微量紫外-可见分光光度计检测DNA的D260／D280及产量.一般，当D260=1时，DNA的浓度为50μg／mL；D260／D280=1.6～1.8，说明DNA较纯；高于1.8说明有RNA存在，低于1.6说明有蛋白质杂质存在等.用2μL样本在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳分析，用TFM-26紫外线透照成像系统（美国Pathtech公司）进行图像处理（图1）.
图1 石蜡包埋的皮肤组织中所提取基因组DNA
1.3.2 PCR检测 所提取的模板DNA，在PCR反应中以230bp的儿茶酚胺氧位甲基转移酶（cate cholamine-O-methyltransferase，COMT）为目的基因，2种方法提取的DNA均扩增成功（图2），反应体系见表1.
图2 不同方法所得DNA
表1 12.5μL PCR反应体系循环参数10×缓冲液 2.5 95℃，成分 V／μL 5min dNTP 0.5 95℃， 45s p1引物 0.5 58℃， 60s p2引物 0.5 72℃， 45s Taq酶 0.5模板DNA 1 72℃， 10min重蒸H2O 7 4℃总计12.5
2 结果
2.1 DNA浓度与纯度
用改良TES水浴法脱蜡提取DNA的D=1.6～1.8的样品比例为60%，而二甲苯脱蜡法提取的DNA的D=1.6～1.8的样品比例为35%.两结果比较，用改良TES水浴法脱蜡提取核酸的方法明显优于用二甲苯脱蜡法（表2～3）.
2.2 基因组DNA电泳图
电泳检测结果显示（图1），改良的TES水浴法提取DNA的完整性优于二甲苯脱蜡法.
2.3 PCR扩增结果
扩增结果（图2）明显，说明用TES水浴脱蜡法提取的基因组DNA优于二甲苯脱蜡法.
表2 样品光密度的测定结果编号 二甲苯脱蜡法D260 D280 D260／D280 ρ／（μg·mL-1）改良TES水溶法D260 D280 D260／D280 ρ／（μg·mL-1）1 1.423 0.895 1.59 71.15 1.496 0.923 1.62 74.8 2 1.326 0.804 1.65 66.3 1.503 0.895 1.68 75.15 3 1.458 0.894 1.63 72.9 1.532 0.875 1.75 76.6 4 1.406 0.896 1.57 70.3 1.511 0.939 1.61 75.55 5 1.528 0.822 1.86 76.4 1.576 0.812 1.94 78.8 6 1.512 0.905 1.67 75.6 1.534 0.919 1.67 76.7 7 1.533 0.829 1.85 76.65 1.527 0.827 1.85 76.35 8 1.536 0.872 1.76 76.8 1.536 0.853 1.8 76.8 9 1.416 0.891 1.59 70.8 1.523 0.87 1.75 76.15 10 1.424 0.901 1.58 71.2 1.517 0.872 1.74 75.85 11 1.306 0.843 1.55 65.3 1.545 0.878 1.76 77.25 12 1.452 0.955 1.52 72.6 1.537 0.859 1.79 76.85 13 1.205 0.809 1.49 60.25 1.526 0.862 1.77 76.3 14 1.546 0.845 1.83 77.3 1.542 0.82 1.88 77.1 15 1.529 0.944 1.62 76.45 1.516 0.936 1.62 75.8 16 1.245 0.896 1.39 62.25 1.389 0.938 1.48 69.45 17 1.536 0.883 1.74 76.8 1.567 0.825 1.9 78.35 18 1.445 0.807 1.79 72.25 1.521 0.85 1.79 76.05 19 1.033 0.948 1.09 51.65 1.437 1.14 1.26 71.85 20 1.376 1.09 1.26 68.8 1.434 1.086 1.32 71.7
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