★常规病理送检注意事项★
1. 手术中切取的组织标本，应立即投入固定液中固定(手术室应备有标本瓶和固定液)。一般以10％中性福马林为固定液。固定液的量不得少于标本体积的5～10倍。标本瓶口宜大，便于标本固定后取出。标本与瓶壁、瓶底接触影响固定者，以脱脂棉衬垫；浮于液面者，以脱脂棉覆盖。如为传染性标本，应注意勿污染容器外面。 2. 标本容器上，应贴有患者姓名或送检单联号的标签。如同一患者同时取有数种组织，或同一组织由不同部位取出，应分装不同容器，并分别注明。不同患者的标本，不得放在同一容器内。
3．采取标本时，注意勿用有齿镊或钳夹取，勿挤压，以免发生人为的变形，影响诊断。标本送检前勿剖开，应保持原形全部送检。必须剖开时，最好邀请病理医师到场，否则应在病理检查申请单内详细描写标本剖开前后情况。送检的组织不可太小，以免影响诊断。
4．标本如为整个器官或其大部，或体积较大，可不固定，但应尽早送病理科处理(外地或远途标本，可参照第三节的方法处理后送检)。
5．各种体液、穿刺液细胞学检查标本，应立即送检。若不能立即送检，应随即离心沉淀，将沉渣做成均匀的涂片2～3张，及时放入乙醚和95％乙醇等量混合液或95％乙醇中固定，然后连同固定液，或
在涂片表面涂以甘油后送检。阴道排出物、鼻咽或其他分泌物、穿刺物涂片，应于涂片制成后即放入上述固定液中固定，然后送检。
6. 送检标本时，应逐项详细填写病理检查申请单，字迹要清楚。临床科有特殊要求时，应在申请单上注明或事先联系。
★组织的脱水透明和浸蜡★
(一)工作中注意事项
1．标本未经充分固定，不得进入脱水处理的程序。
2. 在处理全过程中，每l标本均应附有编号。随时注意防止标本间相互混杂。细小标本应用拭镜纸包裹进行脱水，以免遗失。
3．标本多的单位，可根据标本的性质、大小、分类分批进行脱水，以便按组织的特点安排时间，保证质量，常规标本脱水和透明均应在室温进行。 4．一般以乙醇为组织脱水剂，自低浓度向高浓度渐进并多次更换，组织所含水分才能充分去除，透明、浸蜡才能顺利进行，对保证切片质量甚为重要。 5．组织块在二甲苯中的时间不宜过长，使组织透明即可。若较长时间后透明度仍不好，应检查原因，如因脱水不充分，应重行脱水。
6．经常注意所用试剂质量减退情况，根据需要及时更换新液，更换时乙醇可降级重复使用。试剂应经常过滤，以保持清洁
，避免混杂。
7．常规制片所用石蜡的熔点，以56℃左右为宜。在温热的地区或夏季，应用熔点较高的石蜡，在寒冷地区或冬季，则以熔点较低的石蜡为好。
8．硬脂酸-蜡可作为乙醇和石蜡间的中介剂，且可使组织硬度适中便于切片。
9．乙醇、二甲苯等为易燃品，使用过程中2m内不得有明火。加温脱水及浸蜡全过程，应用隔水温箱或无明火设备，提前一级加温，不得用干烤箱。熔蜡用水浴，并有专人守护。
贮存品保管于无火源房间内明亮易取处。实验室应通风良好，备有灭火器及砂箱。丙酮、乙醚、氯仿、氯乙烷、火棉胶等易燃、易爆物品，均应按上述原则处理。
(二)一般步骤和时间
参见表31-2-l。
表31-2-1 不同厚度组织块的脱水、透明与浸蜡的步骤与时间
处 理 步 骤 不同厚度组织块的处理时间(min)
2mm以下
2～4mm
4～5mm
80％乙醇
45～60
60～120
120～240
95％乙醇I
45～60
60～120
120～240
95％乙醇Ⅱ
45～60
60～120
120～240
无水乙醇I
45～60
60～t20
120～240
无水乙醇Ⅱ
45～60
60～120
120～240
二甲苯I*或
15～30
30
60
硬脂酸-蜡(3：2)
120
180
240
二甲苯Ⅱ或
15～30
30
60
硬脂酸-蜡(2：3)
60
90
120
蜡I**
60
60
60～120
蜡Ⅱ
60
120
120～240
* 使用硬脂酸—蜡时，不需二甲苯透明。** 有条件单位可负压浸蜡，以提高浸蜡效果，缩短时间。用时应装压力表和安全瓶。
(三)自动组织处理机的使用和维护
1．自动组织处理机产品有多种，其结构和性能各异，使用前应熟悉机器说明书中的使用说明及注意事项，按照说明书中的使用方法和程序操作。
2．组织处理的程序和时间参见表31-2-2。
表31-2-2 组织处理机处理活检组织的程序和时间(min)
处 理 程 序 处理时间(min)
80％乙醇
95％乙醇I、Ⅱ、Ⅲ
无水乙醇I、Ⅱ、Ⅲ
二甲苯I、Ⅱ*
蜡I／或硬脂酸-蜡(3：2)
蜡Ⅱ／或硬脂酸-蜡(2：3)
蜡Ⅲ／蜡
60
各90
各60
各60
90／180
90／120
60／60
* 用硬脂酸－蜡时不用二甲苯。
3．根据实际工作条件，设计脱水机运行程序、时间和温度等，机器调好后，不要随意变动。使用过程中，要经常注意运行情况，温度、时间控制是否准确。
4．机器应放置干燥、通风、平稳处，经常做好保洁，按说明书要求做好必要的维护。出现有故障时应请维修人员修理。
★石蜡切片HE染法★
(一)染注意事项
1．切片脱蜡应彻底，室温较低时更应注意，以切片在二甲
苯中呈透明状，或移入乙醇后，片上无白斑点为佳。
2．特殊染、组织化学反应、免疫组化染，按各方法的要求进行组织固定处理，以保证效果。做酶反应的组织固定更应严格要求。凡用含固定液固定的组织，于切片脱蜡后，应经脱汞处理，方可染。其法为：切片经水洗2min，浸于0.5％碘酊溶液中10min，水洗，0.5％硫代硫酸钠水溶液5min，用水彻底冲洗，经蒸馏水洗后染。在脱汞过程中，
慎防切片脱落。
3．各种染料试剂一般选用化学纯。各种染料着效果常因生产厂和批号不同而异，启用任何新品，均应先试染。配成的染液、试液应盛于有试剂瓶内，瓶签应写明名称、含量、配制年月日，顺序保存于避光橱中，必要者放冰箱内。凡须临用时配制者，配量应适当。
4．染各步骤所需的时间，常受温度、切片厚度等影响，可根据镜下观察所见酌情予以调整。但对组织化学反应(尤其是酶)，其时间、温度等因素务必恒定，且应做对照片。
染液着力显著减退时应更新，染反应不正常，应检查染液及试剂是否失效或误用。
5．染过程中，勿使切片干燥，以免影响细胞形态。染完毕后用显微镜检查染结果，是否符合要求，并核对标本种类、号码、数量是否无误。
(二)染步骤
1．二甲苯去蜡(经2次)5～10min。
2．无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇各1～2min，然后蒸馏水洗3min(换数次)。
3．苏木紫液染约5rain(视染液种类和着情况增减)。
4．水洗；l％酸性乙醇(盐酸1mI，70％乙醇99m1)，或1％盐酸分化。显微镜下控制。
5．流水浸洗至少15min，至细胞核呈蓝。也可短时水洗后，浸于40℃温水使核变蓝。显微镜观察，若核染过深或不足，应再分化或重染。
6．伊红液染1～2min后，95％乙醇2次，无水乙醇2次，每次约1～2min。
7．苯酚二甲苯(1：3)5min。
8．二甲苯2次，每次3～5min。
9．用中性树胶或DPX以盖片封片，贴标签。
大概过程是先取材，脱水，浸蜡，包埋，切片，脱蜡，染，脱水，透明，封片几个过程。取材要根据你的实验目的来决定，脱水浸蜡有专门的仪器，包埋是另外的仪器，然后上切片机切片，如果要按区域切片，建议分成几个蜡块包埋。切片好了要烘片，趁热放进二甲苯、梯度酒精脱蜡直至蒸馏水，然后将脱蜡好了的切片染苏木精，根据苏木精效果，一般染2-3分钟即可，流水冲洗去除多余苏木精，盐酸酒精酸化15秒，弱碱水蓝化，然后染伊红，再梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。
脱蜡和脱水的不能公用，需要染缸23个左右。
染缸用铜制的比较好。“灌流时组织缩水变形”你是指动物心脏灌注吗？那你注意一下灌洗用的PBS的渗透压和PH值对不对。
实验五 病理组织切片染
实验五 病理组织切片染
一、实验目的
任何切片，不经过染，在显微镜下只能看到细胞和组织的轮廓，远不能满足观察和诊断的目的。染
是将染料配制成溶液，将组织切片浸入染剂内，经过一定时间，使组织和细胞的成分被染上不同的颜，产生不同的折射率，便于在光学显微镜下进行观察。因此，染在组织形态学、病理学诊断、研究工作中，具有非常重要的实用价值。
二、实验原理
染是染剂和组织细胞的结合过程。使用不同的染方法，其原理有差别。苏木素伊红染法为病理组织切片最常用的染方法。由于它对组织细胞的各种成分都可染出，便于对组织成分的全面观察，且以任何固定液固定的材料，各种切片法都可适用。用H．E染的标本，不易褪可以长期保存。
在常规的苏木素伊红染中，苏木素经过氧化变成酸性染料苏木红，而苏木红和铝结合形成一种带正电荷的蓝精，带正电荷的蓝精和带负电荷的脱氧核糖核酸酸根，通过正、负电荷的极性吸着来完成结合，使细胞核染成蓝紫。伊红是一种酸性红胞浆性染料，它们的染可能是通过渗透作用或弥散作用而完成的，使细胞浆染成红。
三、主要仪器及试材
HE染全套试剂，染缸（卧式），摊片盘，搪瓷缸，盖玻片，中性树胶，牙签，显微镜。
四、实验方法与步骤
常规石蜡切片H．E染程序
(一)脱蜡至水
1．二甲苯Ⅰ 5-15分钟
2．二甲苯Ⅱ 5-15分钟
3．无水乙醇 3分钟
4．95％酒精 3分钟
5．80％酒精 3分钟
6．70％酒精 3分钟
7．自来水洗
(二)染
1．Harris苏木素液 5-7分钟
2．自来水洗 5分钟
3．1％盐酸溶液分化 30秒
4．自来水洗 5分钟
5．1％氨水返蓝 10秒
6．自来水洗 15-20分钟
7．95％酒精 3分钟
8．1％伊红酒精溶液 1-2分钟
(三)脱水、透明和封固
l．95％酒精 2分钟
2．无水酒精Ⅰ 2分钟
3．无水酒精Ⅱ 2分钟
4．二甲苯Ⅰ 5分钟
5．二甲苯Ⅱ 5分钟
6．中性树胶封固
结果：细胞核呈蓝，细胞浆呈红。
五、实验注意事项
1．任何石蜡切片必须经过二甲苯进行脱蜡后才能染
，石蜡切片要求平板烘干，以便组织与玻片粘贴牢固。组织切片脱蜡的好坏，与二甲苯的温度及时间有关，二甲苯使用时间过长，应及时更换。
2．在H．E染过程中，其成败的关键在于分化，如果分化不当致使应该分化脱的部分末予脱去，或分化不足致染不均匀，复染对也不能得到对比鲜明的彩，另外流水冲洗时间的长短对组织返蓝彩鲜艳与否也有一定的关系。须要提及的是，染的成败除染技术以外，组织材料的过分陈旧或
长期固定在甲醛中的组织，由于过度酸化都会影响染；或组织固定不当，固定不足组织发生自溶等均会使染模糊。
3．伊红染后必须经梯度酒精脱水，特别需要经过无水乙醇，脱水一定要彻底，否则，影响透明。
4．脱水后，经二甲苯进行透明，才能封固。透明应注意时间充足，才能达到良好效果。封片时，中性树胶不能滴加太多或太少。封固好的切片应平放在摊片盘上，及时放置于恒温箱中40-50℃烘烤15小时左右，有利于切片的保存。
六、实验结果处理
每人交2-3张质量良好的切片，并描述病理变化。
七、思考题
1．病理组织切片染的原理和意义？
2．病理组织切片染有哪些程序，应注意什么问题？
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