免疫组化步骤
1、烤片:放于60℃烘箱内,20-25min;
2、脱蜡:二甲苯I、II、III,3次,5min/次;
3、复水:100%酒精---100%酒精---95%酒精---90%酒精---80%酒精---70%酒精---50%酒精,5min/次;
4、ddH2O洗2次,5min/次;
5、抗原修复:柠檬酸盐抗原修复液1x(迈新MVS-0100),125℃,5min;
注:1x修复液:198ml ddH2O + 2ml抗原修复液100x,混匀;
抗原修复高压锅的使用:确定垫圈和导热片的放入,加入700ml ddH2O,放入铁架固定切片盒,注意不要压到导热片,盖上锅盖检查排气嘴是否可以自由旋转,锅盖上的“close”对 准白点,“open”所指处与边缘无缝隙,设置程序,开始;结束后等到排气口的红指示消失即可打开锅盖;
6、修复结束后冷却至室温(30min),1xPBS洗2次,5min/次;
7、去除 H202酶:3%H202,15min;注意遮光;
注:用1xPBS稀释30% H202至3% H202(如5ml 30% H202+45ml PBS 50ml 3%H202)
8、PBS 2次,PBST 1次,5min/次;
9、封闭(blocking):先将片子擦干,注意保持组织部分的湿润,再用专用记号笔沿距离组织3mm处画圈,然后加入封闭液,室温1h,湿盒;封闭液不要过多,以免溢出; 注:封闭液:1xPBS,%Triton X-100,10% goat serum(如:870ulPBS+30ul 10% Triton X-100+100ul 10% goat serum 1ml封闭液);
10、孵一抗:用封闭液稀释一抗,不同的抗体稀释的倍数不同,4℃,过夜(有的抗体是室温1h),湿盒。对照组加不含抗体的封闭液;注:拿到4℃冰箱时动作延缓慢,小心不 要使一抗跑出圈外;加一抗前可以重新画圈,以免一抗外流;
常用抗体的稀释比例:GFAP--1:200,Ki67--1:200,CD31--1:20~1:40,Flag--1:200,Nestin--1:200,III-Tubulin--1:1000
11、室温,30min;(从冰箱拿出时动作也要缓慢)
12、PBST洗3次,5min/次;
注:PBST:1L 1xPBS+10ml 10%Triton X-1000 ;
13、①加荧光标记的二抗(封闭液稀释抗体1:1000),1h,室温,湿盒;②加HRP标记的二抗(封闭液稀释抗体1:10000),室温30min; 注:加二抗前可以重新画圈,以防二抗外流;
14、PBST洗3次,5min/次;
15、若①复染:DAPI染,避光,5min;若②TSA放大3~10min,PBST洗3次,5min/次,再复染DAPI;
注:DAPI:50uM DAPI用1xPBS稀释1000倍
16、封片:直接向组织滴加抗荧光淬灭剂,注意不要产生气泡,盖盖玻片时也要注意不要产生气泡,避光4~5min后即可拍片。