Linegene9600应用手册
目录
第一章、荧光定量PCR的原理 江 第二章、Linegene9600系列荧光定量PCR仪通道信息情况说明 李 第三章、引物与探针设计原则 段 第四章、编程介绍 顾 第五章、Linegene9600的应用及举例 李 第六章、参考文献 顾 第七章、试剂信息 顾 第一章荧光定量PCR的原理
描述PCR动态进程的曲线即扩增曲线。PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线(如下图)。
荧光定量PCR扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。 二、 荧光阈值（threshold）
一般将PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，，荧光阈值缺省设置为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10' SDcycle6-15。做荧光定量PCR实验时，经常采用手动设置，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号时荧光信号超过阈值（如下图）。
三、 C t值
也称循环阈值，C代表Cycle，t代表threshold。Ct值是指反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的PCR反应循环数。在PCR循环过程中，即荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。在实际操作中，这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值的时刻，可见Ct指取决于阈值。
如上图所示，黑的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑线时所经历的循环数即为Ct值。
因为Ct值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT 值范围在18-30之间，过大和过小都
将影响实验数据的精度。
同一模板经过96次PCR扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct值极具重现性。根据这个特点，可以利用已知起始拷贝数的标准样品的Ct值做出标准曲线，只要在同一次PCR 实验中得到未知样品的Ct值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。
第二章 Linegene9600系列荧光定量PCR仪通道信息情况说明
一、linegene9600系列荧光定量PCR仪型号规格说明
１、型号：FQD – 96 A
96表示最大样本数为96
PCR）检测系统
的缩写
F1，F2滤光片）
F1，F2，F3，F4滤光片）
F1，F2，F3，F4，F5，F6滤光片）
F1，F2，F3，F4，F5，F6，F7，F8滤光片）
规格代号，96表示最大样本数为96
博日荧光定量PCR分析系统系列规格的英文名称
仪器统称为LineGene9600系列，都具有相同的技术平台，订购时可以根据性价比需要选择不同规格。规格区分是按光电组件中所装滤光片组和倍增管情况来确定的（参见如下表格1）
规格代号
滤光片组 光电倍增管 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 PMT1 PMT2
LineGene9620 √ √ √
LineGene9640 √ √ √ √ √
LineGene9660 √ √ √ √ √ √ √ √ 推荐 LineGene9680 √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ 定制
二、各通道波长范围，各通道染料种类
滤光片组定义：标配F1-F6波长已定义，F7、F8作为预留客户定制的滤光片组。各通道覆盖的染料及具体的染料信息见如下表格二：
通道
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7F8常 用 染 料
6-FAM (492/515) VIC (538/554)
Cy3 (552/570)ROX (568/595)Cy5 (649/666)
LightCycl er- Red （705） 备用备用SYBR Green- I
HEX (535/556)5-TAMRA (542/568)TAMRA (565/580) Quasar705 （705）
TET (521/536)NED (546/575)
Texas-Red (595/620)
JOE (525/555)
激发光中心波长nm 470 523
543 571 628 678
半峰宽nm 30 20 20 20 40 12
荧光中心波长nm 525 584 584 612 692 718
半峰宽nm
20 20 20 20 40 25
可见光光谱范围如下，供参考：
三、各通道染料的实验结果
1、F1通道(FAM探针)实验结果举例
2、F2通道(HEX探针)实验结果举例
3、F3通道(TRAMA探针)实验结果举例
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