选修1《生物技术实践》必背知识点
课题1果酒和果醋的制作
1.果酒制作菌种是酵母菌，是一种单细胞真菌，真核生物，代谢类型为异养兼性厌氧型，适宜条件下进行出芽生殖。酵母菌在有氧条件下进行有氧呼吸大量繁殖，无氧条件下进行酒精发酵产生酒精。（1）有氧呼吸反应式：C 6H 12O 6＋6H 2O ＋6O 2─→酶 6CO 2＋12H 2O ＋大量能量
（2）无氧呼吸反应式：C 6H 12O 6─→酶
2C 2H 5OH ＋2CO 2＋少量能量
制酒原理：酵母菌无氧呼吸将葡萄糖转化为酒精。
2.果醋制作菌种是醋酸菌，原核生物，代谢类型为异养需氧型，以二分裂方式增殖。原理如下：（1）当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将果汁中的糖分解成醋酸。
（2）当氧气充足，缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再变为醋酸。
3.葡萄酒的自然发酵，菌种来自附着在葡萄皮上的野生型酵母菌；工业酿酒可在无菌条件下人工接种酵母菌菌种。
4.葡萄酒呈现深红的原因：在发酵过程中，红葡萄皮的素进入发酵液中，使葡萄酒呈现深红。
5.在传统酿酒过程中，一般不需要严格的灭菌过程，是因为在缺氧、呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，绝大多数其他微生物无法适应而受到抑制。
6.果酒制作中，酒精含量达一定程度后不变，CO 2也不产生，原因可能是原料耗尽或高浓度的酒精抑制了酵母菌细胞呼吸。
7.喝剩的果酒放置一段时间后会变酸，原因是醋酸菌在有氧条件下把酒精变为醋酸。
8.制作果醋时，变酸的酒表面常常有一层白菌膜，这层白菌膜是醋酸菌大量繁殖形成的。9.果酒和果醋制作流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵(→果酒)→醋酸发酵(→果醋)（1）新鲜的葡萄应先冲洗再去梗。若先去梗再冲洗，会造成汁液流失和杂菌污染。（2）冲洗的目的是洗去浮尘，但不能反复冲洗，以防止菌种流失。
（3）葡萄汁装入发酵瓶，要留约1/3的空间，目的是让酵母菌有氧呼吸大量繁殖，防止发酵液溢出。（4）果酒制作温度控制在18～25℃，时间为10～12d ；果醋制作温度控制在30～35℃，时间为7～8d 。（5）果酒制作前期需氧后期不需氧，果醋制作一直需氧。10.果酒和果醋制作的发酵装置（见右图）
（1）充气口：在酒精发酵时应关闭；在醋酸发酵时连接充气泵泵入无菌空气。
（2）排气口：酒精发酵时排出酵母菌产生的CO 2；醋酸发酵时排出剩余的空气、CO 2。（3）出料口：取样、监测。
（4）排气口连接长而弯曲的胶管目的是防止空气中微生物的污染。
注：若使用带盖的瓶子制果酒果醋：在发酵过程中，每隔12h 左右将瓶盖拧松一次，以放出CO 2，此后再将瓶
盖拧紧。当发酵产生酒精后，再将瓶盖打开，盖上一层纱布，进行制果醋的发酵。
11.酒精检测：在酸性条件下，橙的重铬酸钾与酒精反应呈灰绿。
课题2腐乳的制作
1.腐乳制作的菌种主要是毛霉，丝状真菌，真核生物，代谢类型为异养需氧型，进行孢子生殖。
2.腐乳制作原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将腐乳中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
3.腐乳制作流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。
（1）豆腐含水量为70%左右为宜。含水量过高，豆腐不易成形；含水量过低，不利于毛霉生长。
（2）豆腐上长毛霉：利用空气中的毛霉孢子，温度控制在15～18℃，保持一定湿度，5d 后豆腐块表面布满菌丝；
现代腐乳生产是在严格无菌条件下将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可避免其他菌种的污染，保证产品品质。（3）加盐方法：逐层加盐，随层数加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些，以有效防止杂菌污染。
盐的作用：豆腐与盐的质量比为5:1。盐具有析出豆腐中水分，抑制微生物生长，调味的作用。盐浓度过低，
不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐浓度过高，会影响腐乳的口味(苦咸)。
（4）卤汤由酒及各种香辛料组成。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右，酒具有抑制微生物生长及调味的作用；
香辛料具有防腐杀菌和调味的作用。酒精含量过高，腐乳成熟时间会延长；含量过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败变质。
（5）密封腌制：创造无氧环境，利用厌氧菌产生的酶继续厌氧发酵，促进腐乳的后熟。
课题3制作泡菜并检测亚硝酸盐含量
1.泡菜制作的菌种是乳酸菌，来自蔬菜表面。常见乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌，其中乳酸杆菌常用于生产酸奶。
2.乳酸菌属于原核生物，代谢类型为异养厌氧型，以二分裂方式增殖。
3.泡菜制作原理：乳酸菌在无氧条件下进行乳酸发酵，将葡萄糖分解成乳酸。（C 6H 12O 6─→酶
2C 3H 6O 3＋能量）
4.含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶，是因为酸奶的制作依靠的是乳酸菌的发酵作用，而抗生素能够杀死或抑制乳酸菌的生长，因此含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶。
5.选用的蔬菜要新鲜，否则蔬菜中的硝酸盐易被还原为亚硝酸盐。膳食中的绝大部分亚硝酸盐在人体
内以“过客”形式随尿排出，只有在特定的条件下(如适宜的pH 、温度和一定的微生物作用)，才会转变成致癌物──亚硝胺。
6.配制盐水：清水与盐的质量比为4:1，盐水要煮沸冷却。煮沸的目的是灭菌除氧，冷却是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响。盐有灭菌、渗出蔬菜中过多的水分以及调味的作用。盐水浓度不能太高，因为盐水浓度太高会引起乳酸菌细胞渗透失水，影响乳酸菌生长繁殖，甚至导致乳酸菌死亡。
7.在冷却后的盐水中加入少量“陈菜泡液”，目的是增加乳酸菌数量，缩短泡菜制作时间。
8.加入调味料后要装坛密封(坛盖边沿水槽注水)，目的是创造无氧条件，利用乳酸菌发酵。
9.泡菜中亚硝酸盐的含量与腌制时间、腌制温度和食盐用量有关。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，易造成细菌大量繁殖，使亚硝酸盐含量增加。一般在腌制10d 后，亚硝酸盐的含量开始下降。10.亚硝酸盐含量的测定（1）方法：比法。
（2）原理：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N-1-萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红染料。将显反应后的样品与已知浓度的标准显液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
（3）步骤：配制溶液→制备标准显液→制备样品处理液→比。
11.发酵过程中应定期测定亚硝酸盐的含量，原因是发酵不同时期亚硝酸盐含量会发生变化，及时测定是为了把握
取食泡菜的最佳时机。泡菜腌制过程中，亚硝酸盐的含量先增加后减少，最后稳定在较低水平。
12.从开始制作到泡菜质量最佳这段时间，泡菜液逐渐变酸，这段时间内泡菜坛中乳酸菌数量增加，杂菌数量减少，
原因是乳酸菌比杂菌更耐酸。
专题2微生物的培养与应用
课题1微生物的实验室培养
1.培养基按物理性质分为液体培养基和固体培养基，区别是固体培养基中加入了凝固剂琼脂；按用途分为选择培养基和鉴别培养基。微生物可在固体培养基表面形成肉眼可见的菌落，固体培养基可用于微生物的分离、鉴定、活菌计数和保藏菌种。
2.各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。另外，培养基还需要满足微生物生长对pH 、特殊营养物质以及氧气的要求。如培养细菌(如乳酸杆菌)时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将培养基的pH 调至酸性，培养细菌时需将pH 调至中性或微碱性，培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。
3.无菌技术的目的是获得纯净培养物，关键是创造无菌条件，防止外来杂菌的入侵。
4.消毒和灭菌
（1）消毒：用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物，不包括芽孢和孢子。
具体方法有：煮沸消毒法；牛奶用巴氏消毒法，既杀死牛奶中微生物，又使牛奶中的营养成分不被破坏；用酒精
擦拭双手、消毒水源是化学药剂消毒法；接种室、接种箱或超净工作台用紫外线消毒法。
（2）灭菌：用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。具体方法有：灼烧灭菌：如接种环、接种针、试管口、瓶口。
干热灭菌：如培养皿、试管、吸管等，所用工具是干热灭菌箱。
高压蒸汽灭菌：如培养基、无菌水、移液管，所用工具是高压蒸汽灭菌锅。
5.制备培养基：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。
（1）在溶化后灭菌前调节pH ，若先灭菌后调pH 易污染培养基。（2）培养基高压蒸汽灭菌，培养皿干热灭菌。（3）平板冷却后，将平板倒置的原因：防止皿盖上的冷凝水落入培养基，造成污染。6.微生物接种方法(分离纯化细菌方法)
（1）平板划线法：通过接种环(工具)在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞体，即菌落。
①灼烧接种环目的：第一次灼烧：避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；以后每次划线前灼烧：杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种来自上次划线末端；划线结束灼烧：杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。灼烧次数＝划线次数＋1。②在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线，以免接种环温度太高杀死菌种。
③每次从上一次划线的末端开始，目的是将聚集的菌体逐步稀释分散到培养基表面，以便得到单个菌落。
（2）稀释涂布平板法：用移液管(工具)和无菌水将菌液进行一系列的梯度稀释，然后用涂布器(工具)将不同稀释度的菌液分别均匀地涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在
稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。①梯度稀释原因：培养液中菌体浓度高，直接培养很难分离得到单菌落。
罗平县第三中学
黄伟编2004初审人教版2019年第二版
②梯度稀释中，每次取样前需用手指轻压移液管橡皮头，吹吸三次，目的是使微生物和无菌水混合均匀。注：①以上操作均在酒精灯火焰旁进行，防止杂菌污染。注：②若要分离纯化并统计活菌数，应选用稀释涂布平板法。
注：③平板划线法不能用于活菌计数的原因：菌落连成片，无法计数。
7.菌种保藏：频繁使用的菌种用临时保藏法(4℃冷藏室)，但保存时间不长，因为菌种易被污染或产生变异。7.菌种保藏：需长期保存的菌种用甘油管藏法(-20℃冷冻箱)。
课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.在自然界寻目的菌：要根据目的菌对生存环境的要求，到相应的环境中去寻。实验室目的菌株筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH 等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2.选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
例如：以尿素为唯一氮源的培养基可筛选出尿素分解菌；以纤维素为唯一碳源的培养基可筛选出纤维素分解菌；以石油为唯一碳源的培养基可筛选出石油分解菌；缺乏有机碳源的培养基可筛选出自养微生物；缺乏氮源的培养基可筛选出固氮微生物；加入抗生素的培养基可筛选出酵母菌、霉菌等真菌。3.微生物计数方法
（1）稀释涂布平板法（活菌计数法）
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②原则：设置重复组，同一稀释度下至少涂布3个平板，增强实验说服力和准确性；重复组结果应一致。
为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
③计算公式：每克样品中的菌株数＝(C ÷V )×M (个/mL )。其中，C 代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V 代表涂布平板时所用的稀释液体积(mL )，M 代表稀释倍数。
④结果：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
⑤需要设置未接种(或接种等量无菌水)的培养基作为空白对照，目的是判断培养基是否被杂菌污染。（2）显微镜直接计数法
①主要用具：血细胞计数板和显微镜。②血细胞计数板使用方法：“先盖后滴再吸”，即先盖盖玻片，后滴培养液，再用吸水纸吸。
③计算公式：1mL 培养液中细胞个数＝小方格中细胞平均数×400×104×稀释倍数(个/mL )
④结果：估算值比实际值偏大，因为该方法不能区分细胞的死活，计数到的细胞数包括了死亡的细胞数。
4.实验流程：土壤取样→样品稀释→涂布培养与观察→计数。
（1）土壤取样：土壤有“微生物的天然培养基”之称。土壤取样时应选取取富含有机质、pH 接近中性且潮湿的、距地表约3～8cm 的土壤层。取一定量土溶于无菌水中，制成土壤溶液。（2）将样品进行梯度稀释：样品稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。用一定稀释范围的样品液进行涂布培养，以保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。测定细菌数量一般选用104、105和106倍稀释液，测定放线菌数量一般选用103、104和105倍稀释液，测定真菌数量一般选用102、103和104倍稀释液进行平板培养。（3）培养与观察：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和时间。将样品涂布到固体培养基表面，不能用平板划线法。为防止皿盖上的水珠滴入培养基造成污染，需将培养皿呈倒置状态放置。每隔24h 统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，这些特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜等方面。（4）计数：当菌落数目稳定时，取同一稀释度下至少3个平板进行计数，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底。
5.未接种或接种等量无菌水的培养基(空白对照)上有菌落生长，说明培养基被杂菌污染。
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落的数目和种类远大于选择培养基时，说明选择培养基具有筛选作用。
6.分解尿素的细菌合成的脲酶能将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强，pH 升高。在以尿素为唯一氮源的选择培养基中加入酚红指示剂(鉴别培养基)培养细菌，若pH 升高，指示剂将变红，可初步确定该种细菌能够分解尿素。
7.伊红美蓝培养基属于鉴别培养基，大肠杆菌代谢产物会和伊红、美蓝发生反应，使菌落呈现黑。
课题3分解纤维素的微生物的分离
1.纤维素是一种多糖，其组成单位是为葡萄糖。纤维素酶是一种复合酶，它至少包括三种组分，即C 1酶、C X 酶和葡萄糖苷酶。纤维素─────→C 1酶、C X 酶
纤维二糖─────→葡萄糖苷酶
葡萄糖。
2.纤维素分解菌的筛选方法是刚果红染法。刚果红(简称CR )是一种染料，能与纤维素形成红复合物，当纤维
素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，透明圈的大小可反应细菌降解纤维素的能力。3.实验流程：土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。（1）土壤取样：选择纤维素含量丰富的土壤环境采集土样。取一定量土溶于无菌水中，制成土壤溶液。
（2）选择培养：以纤维素为唯一碳源的培养基，属液体培养基(物理性质)、选择培养基(用途)。选择培养的目的是增加目的菌株的浓度；振荡培养的目的是增加培养液中溶解氧含量，提高营养物质的利用率。（3）梯度稀释：目的是使纤维素分解菌分散开，以便能够得到单细胞菌落。
（4）涂布培养：用固体培养基(物理性质)、鉴别培养基(用途)。为防止皿盖上的水珠滴入培养基造成污染，需将培养皿呈倒置状态放置。此步也可用平板划线法。
（5）筛选菌株：挑选产生透明圈的菌落。透明圈越大，说明细菌分解利用纤维素的能力越强。(右图)
4.以纤维素为唯一碳源的选择培养基可初步筛选出纤维素分解菌，为进一步确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶实验。纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。
专题4酶的研究与应用
课题1果胶酶在果汁生产中的应用
1.果胶：（1）作用：组成植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一。1.果胶：（2）成分：由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物。1.果胶：（3）特点：不溶于水。在果汁加工中，果胶的存在易导致果汁出汁率低，果汁浑浊。
2.果胶酶：（1）来源：植物、霉菌、酵母菌和细菌均能产生果胶酶。食品加工业中的果胶酶是由霉菌发酵生产的。2.
果胶酶：（2）作用：①将不溶性的果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸，使浑浊的果汁变得澄清。
②瓦解植物细胞的细胞壁和胞间层，使榨取果汁变得更加容易，提高出汁率。
2.果胶酶：（3）组成：是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶、果胶脂酶等。2.果胶酶：（4）化学本质：果胶酶是蛋白质，能被蛋白酶水解掉。
3.酶的活性与影响酶活性的因素（1）酶的活性
①概念：指酶催化一定化学反应的能力。
②表示方法：酶活性的高低可以用在一定条件下，酶所催化的某一化学反应的反应速度来表示。③酶反应速度的表示方法：用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。（2）影响酶活性的因素：温度、pH 和酶的抑制剂等。3.实验设计
【实验一】探究温度和pH 对酶活性的影响（1）实验变量：自变量：温度或pH ；因变量：酶的活性；
无关变量：果泥用量、果胶酶的浓度和用量、反应时间、过滤时间等。
（2）操作方法：在不同温度或pH 下，将一定量的果胶酶加入一定量的果泥中，反应同样长时间，再将反应液过滤同样长的时间，用量筒测量滤出的苹果汁的体积。
注：①在混合果泥和果胶酶之前，将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理，可以保证底物和酶在混合时的
温度是相同的，避免了果泥和果胶酶混合时影响混合物的温度，从而影响果胶酶活性。
②探究温度或pH 对酶活性的影响时，不同的温度梯度或不同的pH 梯度之间就可以作为相互对照。（3）判断果胶酶活性高低的方法
①测定单位时间内产生果汁的体积来判断。获得的果汁越多，说明果胶酶的活性越高。②比较果汁的澄清度来判断果胶酶的活性。果汁越澄清，表明果胶酶的活性越高。【实验二】探究果胶酶的用量
（1）实验变量：自变量：酶的用量；因变量：果汁体积；无关变量：温度、pH 、反应时间、果泥用量等。（2）判断果胶酶用量是否合适的思路
①如果随着酶的用量增加，过滤得到的果汁体积也增加，说明酶的用量不足；
②当酶的用量增加到某个值后，再增加酶的用量，过滤得到的果汁的体积不再改变，说明酶的用量已经足够，那么，这个值就是酶的最适用量。
课题2探讨加酶洗衣粉的洗涤效果
1.加酶洗衣粉
（1）概念：加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉。（2）酶制剂
①常用种类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶四类。
②应用最广泛、效果最明显的种类是：碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。
③作用原理：酶制剂能将难溶性大分子物质分解为可溶性小分子物质，使污迹易从衣物上脱落。如碱性蛋白酶能将血渍、奶渍中含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子肽，脂肪酶将脂肪水解成甘油和脂肪酸。
④影响酶活性的因素：温度、酸碱度和表面活性剂。
⑤生产方式：通过基因工程生产出能够耐酸、耐碱、忍受表面活性剂和较高温度的酶。
（4）优点：加酶洗衣粉降低了表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，使洗涤剂朝低磷无磷的方向发展，减少对环境的污染。普通洗衣粉中含有磷，含磷污水的排放可能导致微生物和藻类的大量繁殖，造成水体富营养化。2.实验设计
【问题1】普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍洗涤效果的区别①变量分析：自变量：洗衣粉的类型；因变量：洗涤效果。
②对照实验：对照组：普通洗衣粉＋污染物；实验组：加酶洗衣粉＋污染物。【问题2】加酶洗衣粉的最适洗涤温度
①变量分析：自变量：温度；因变量：洗涤效果。②对照实验：不同实验组之间的洗涤效果形成相互对照。【问题3】不同类型的加酶洗衣粉的洗涤效果
①变量分析：自变量：加酶洗衣粉的种类；因变量：洗涤效果；无关变量：污渍的种类、程度等。②对照实验：不同加酶洗衣粉的洗涤效果互为对照。
3.判断洗涤效果的方法和标准：可在洗涤后比较污物的残留状况，如已消失、颜变浅、面积减小等。
4.影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素：酶制剂的种类，污物的类型，水温、水量、水质，衣物的质地和大小，洗衣粉的用量，浸泡时间，洗涤时间等。
课题3酵母细胞的固定化
1.直接使用酶的实际问题：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品品质。
2.固定化酶的应用实例——生产高果糖浆
（1）反应原理：高果糖浆的生产需要使用葡萄糖异构酶，它能将葡萄糖转化成果糖。（2）生产原理：使用固定化酶技术，将葡糖糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装入反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液可以自由出入。（3）生产过程
①将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入。
②使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触。③转化成的果糖，从反应柱的下端流出。（4）固定化酶的优缺点
①优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，还可以被反复利用。②缺点：一种酶只能催化一种反应，不能催化一些列的酶促反应。3.固定化酶和固定化细胞技术
（1）概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
（2）常用方法：包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为体积大的细胞难以被吸附或结合，而体积小的酶易从包埋材料中漏出。
图A ：包埋法图B ：化学结合法图C ：物理吸附法（3）固定化细胞技术的优缺点
①优点：成本低，易操作，对酶活性影响小，能固定一系列酶，催化一系列反应。
②缺点：只能以小分子物质作为反应物，大分子物质不易进入细胞，反应时需要为固定化细胞提供营养物质。（4）载体：本课题使用包埋法来固定细胞，即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。本实验选用海藻酸钠作载体包埋酵母细胞。4.固定化酵母细胞的实验操作（1）制备固定化酵母细胞
①酵母细胞的活化：向干酵母中加入蒸馏水，调成糊状，使其活化。注：活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。②配制CaCl 2溶液
③配制海藻酸钠溶液：溶解海藻酸钠采用酒精灯加热，边加热边搅拌。加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到完全溶化。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。
④海藻酸钠溶液与酵母细胞混合：向冷却至室温的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混合均匀，再转移至注射器中。注：“冷却至室温”的目的是防止(海藻酸钠溶液)温度过高而导致酵母菌死亡。
⑤固定化酵母细胞：以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl 2溶液中，观察液滴在CaCl 2溶
液形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl 2溶液中浸泡30min 左右。
注：CaCl 2作用：使海藻酸钠胶体聚沉，以便形成结构稳定的凝胶珠。“浸泡30min ”：使凝胶珠结构更稳定。（2）用固定化酵母细胞发酵
固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2～3次，加入到用于发酵的的葡萄糖溶液中，于25℃下发酵24h 。注：“冲洗”的目的：洗去凝胶珠上多余的CaCl 2溶液，以免对实验造成影响。
葡萄糖溶液作用：既作为反应物，又为酵母菌提供营养物质。
5.固定化酵母细胞实验操作的结果分析与评价
（1）如果制作的凝胶珠颜过浅、呈白，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再做尝试。可以制备不含酵母细胞的凝胶珠作对照。
（2）利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味，而不含酵母菌的凝胶珠所做的对照组实验则无此现象。
6.如果希望反复使用固定化酵母细胞，就需要避免其他微生物污染。在工业生产中，细胞的固定化是在严格无菌的条件下进行的。
专题5DNA 和蛋白质技术
课题3血红蛋白的提取和分离
1.蛋白质分离的理论依据：蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
2.分离蛋白质的方法（1）凝胶谱法
①概念：也称做分配谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
②凝胶：是一些微小的多孔球体，这些球体大多数由多糖类化合物构成，如葡聚糖或琼脂糖。在小球体内部有许多贯穿的通道。
③原理：当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，通过凝胶的时间较长；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，通过凝胶的时间较短。因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分子分离。④分离过程：蛋白质混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→先收集大分子→后收集小分子。（2）电泳
①概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。
②原理：在一定的pH 下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③影响电泳速率的因素：待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
④方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
A.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率取决于各种分子所带电荷性质的差异及分子大小、形状的不同，从而得以分离。
B.聚丙烯酰胺凝胶电泳：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS 。SDS 能与各种蛋白质形成蛋白质－SDS 复合物，SDS 所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
注：在测定蛋白质分子量时通常使用SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳。SDS 能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS 的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。3.缓冲溶液
（1）作用：在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH 的影响，维持pH 基本不变。
（2）配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH 范围内使用的缓冲液。
4.蛋白质提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。（1）样品处理
血液由血浆和各种血细胞组成，其中红细胞最多。血红蛋白由四条肽链组成，包括两条α－肽链和两条β－肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红。注：血红蛋白呈现红这一特点对进行血红蛋白质分离的意义：血红蛋白是有蛋白，因此在凝胶谱分离时可通过观察颜来判断什么时候应该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。①红细胞的洗涤
a.目的：去除杂蛋白(如血浆蛋白)，获得纯净红细胞。
b.过程：血样低速短时间离心→吸出上层透明黄血浆(含血浆蛋白)，将下层暗红的红细胞液体倒入烧杯→加入五倍体积的生理盐水→再低速短时间离心→重复三次，直至上清液不在呈现黄→得到纯净红细胞。注：为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂柠檬酸钠。注：生理盐水作用：能保持红细胞渗透压稳定而不至于破裂。
注：洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，到不到分离的效果。②血红蛋白的释放
a.目的：使红细胞破裂，释放血红蛋白。
b.过程：红细胞加蒸馏水到原血液的体积→加40%体积的甲苯→磁力搅拌器上搅拌→红细胞破裂，释放血红蛋白注：蒸馏水作用：使红细胞吸水涨破。甲苯作用：加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。③分离血红蛋白溶液
a.目的：经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开。
b.过程：混合液离心→用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层→分液漏斗中静置片刻→分离出下层的红透明液体。试管中混合液离心后分为四层，从上往下数：第1层：无透明的甲苯层。第2层：白薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层。第3层：红透明液体，是血红蛋白的水溶液。第4层：暗红的杂质沉淀层。（2）粗分离——透析
①目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质。
②原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
③方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液中，透析12h 。（3）纯化——凝胶谱操作
①目的：通过凝胶谱法将相对分子质量不同于血红蛋白的杂蛋白除去。②过程
a.凝胶谱柱的制作
b.凝胶谱柱的装填：本实验使用的是交联葡聚糖凝胶。干凝胶用蒸馏水充分溶胀，配成凝胶悬浮液。为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，这种方法不断节约时间，还可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。装填时可轻轻敲动谱柱，使凝胶装填均匀。谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。装填完后，立即用磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶，使凝胶装填紧密。
c.样品的加入和洗脱：滴加样品，在50cm 高操作压下用磷酸缓冲液洗脱，如果红区带均匀一致地移动，说明谱柱制作成功。
（4）纯度鉴定——在鉴定的方法中，使用最多的是SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳。
专题6植物有效成分的提取
课题1植物芳香油的提取
1.植物芳香油具有很强的挥发性，其组成比较复杂，主要包括萜类化合物及其衍生物。
2.植物芳香油的提取方法有蒸馏法、压榨法和萃取法等。具体采用哪种方法要根据植物原料的特点来决定。
（1）水蒸气蒸馏法：是利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，混合物又会重新分出油层和水层。根据原料放置的位置又可分为水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏。适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油。水中蒸馏不适用于柑橘和柠檬，因为会导致原料焦糊和有效成分水解等问题。（2）压榨法：通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油，主要适用于柑橘、柠檬芳香油的制备。
（3）萃取法：将粉碎、干燥的植物原料用有机溶剂浸泡，使芳香油溶解在有机溶剂中，然后蒸发出有机溶剂，就可获得纯净的植物芳香油。适用于易溶于有机物溶剂的有效成分的提取，如胡萝卜素的提取。3.玫瑰精油的提取
（1）玫瑰精油性质：化学性质稳定，难溶于水，能随水蒸气一同蒸馏(据此可用水蒸气蒸馏法提取)；易溶于有机溶剂(据此可用萃取法提取)。
（2）提取方法：鲜玫瑰花采用水蒸气蒸馏法，干玫瑰花采用萃取法。（3）实验流程：鲜玫瑰花＋清水→水蒸气蒸馏→油水混合物───→加NaCl
分离油层──────→加无水Na 2SO 4
除水──→过滤
玫瑰油。
①鲜玫瑰花与清水的质量比为1:4。玫瑰花要在花开的盛期采收，因为在此阶段花朵含油量最高。
②提取效率主要受蒸馏温度和蒸馏时间影响。蒸馏温度太高、时间太短，产品品质就会比较差。要提高精油品质，在操作中需要通过控制温度来实现延长蒸馏时间的目的。当原料量等其他条件一定时，提取量随蒸馏时间的变化趋势是在一定时间内提取量随时间的延长而增
加，一定时间后提取量不再增加。
③蒸馏得到的乳白乳浊液是玫瑰油与水的混合物，加入NaCl 可增加盐浓度，促进油水分层，分层原因是因为油层的密度比水层小。
④油水分层后可用分液漏斗分出油层。
⑤油层中有一定的水分，可以加入无水Na 2SO 4除水。⑥过滤的目的是除去固体不溶物(固体Na 2SO 4)。
（3）蒸馏装置中冷凝管的作用：使油水混合物冷却分层，防止精油过度蒸发。4.橘皮精油的提取
（1）提取方法：不适于使用水中蒸馏法，因为会产生原料焦糊和有效成分水解等问题，一般采用压榨法。（2）实验流程：石灰水浸泡→漂洗→压榨→过滤→静置→再次过滤→橘皮油。
①橘皮处理：为了提高出油率，需要将柑橘皮干燥去水，并用石灰水浸泡10h 以上。石灰水浸泡的目的是破坏细胞结构，分解果胶；防止压榨时滑脱；提高出油率。
②橘皮的压榨：为了使橘皮油易于与水分离，压榨时要加入相当于橘皮质量0.25%的NaHCO 3和5%的Na 2SO 4。③压榨液的处理：压榨液中含有橘皮精油和大量水分，还有一些糊状残渣等杂质。先用普通布袋过滤除去大的固体物和残渣，然后离心除去质量小的固体物，再用分液漏斗或吸管将上层的橘皮油分离出来。橘皮油还含少量的水和果醋，需在5～10℃下静置5～7d ，使果醋等杂质沉淀，用吸管吸出上层澄清橘皮油，其余部分通过滤纸过滤。滤液和吸出的上层橘油合并，成为最终的橘皮精油。
5.提取到的精油需要低温保存，目的是防止温度过高精油因挥发而损失。
课题2胡萝卜素的提取
1.胡萝卜素根据碳碳双键的数目可划分为α、β、γ三类，β-胡萝卜素是其中最主要的组成成分。
2.胡萝卜素的作用
①可维生素A 缺乏症，如夜盲症、幼儿生长发育不良、干皮症等，因为一分子的β-胡萝卜素(在人或动物的小肠、肝脏等器官)能被氧化成两分子的维生素A ；
②常用的食品素，广泛地用作食品、饮料、饲料的添加剂；③具有使癌细胞恢复成正常细胞的作用。3.胡萝卜素是橘黄结晶，化学性质较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。4.胡萝卜素的提取途径：从植物中提取、从大面积养殖的盐藻中获得、利用微生物的发酵生产。5.根据胡萝卜素不溶于水，易溶于有机溶剂的特点，可以用萃取法提取胡萝卜素。6.胡萝卜素提取实验流程：胡萝卜→粉碎→干燥→萃取→过滤→浓缩→胡萝卜素。
7.萃取剂选用原则：有较高的沸点，能充分溶解胡萝卜素，不与水混溶(乙醇、丙酮能与水混溶)。还要对人体无毒(甲醇、丙酮、四氯化碳有毒)、不易燃、易与产品分离除去、不影响产品质量。
8.萃取胡萝卜素应选用石油醚等水不溶性有机溶剂做萃取剂。萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量；还受原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取温度和时间的影响。萃取前要将胡萝卜进行粉碎和干燥。粉碎的目的是增大接触面积，使提取物能充分溶解。原料要进行干燥，因为萃取效率受原料颗粒含水量的影响；干燥时要注意控制温度和时间，因为温度太高、干燥时间太长会导致胡萝卜素分解。
9.萃取过程应避免明火加热，采用水浴加热，因为有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热易引起燃
烧、爆炸。在加热瓶口安装回流冷凝装置，目的是防止加热时有机溶剂挥发。萃取液的浓缩可直接使用蒸馏装置，浓缩的目的是将萃取剂与胡萝卜素分开(或去除萃取剂)。浓缩前还要进行过滤，其目的是除去萃取液中的不溶物。
10.对胡萝卜素粗品的鉴定采用纸层析法，原理是：不同素在层析液中的溶解度不同，溶解度高的随层析液在滤
纸上扩散得快，反之则慢。装置中玻璃盖的作用是防止层析液挥发；层析液不可没及样品原点，以免素溶解于层析液中，使鉴定失败。用最细的注射器针头在基线上A 、D 点点标准样品，B 、C 点点提取样品。点样应快速细致，点样后在基线上形成细小的圆点，注意保持滤纸干燥。若萃取样品出现和标准样品一样的层析带，说明提取胡萝卜素的实验成功。
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