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本技术介绍了一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，包括平板菌落计数步骤；96孔细胞培养板铺制步骤；土壤样本稀释和点板步骤；放线菌培养和纯化步骤；放线菌筛选和鉴定步骤。与现有技术相比，该方法在稀有放线菌新种发现上具有独特优势。 技术要求
1.一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，将放线菌选择培养基加入96孔细胞培养板各孔室，土壤样本经稀释后添加至96孔板各孔室进行放线菌培养，达到隔离培养的效果。
2.根据权利要求1所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、平板菌落计数：称取土壤样本，加入无菌水进行系列稀释，得到稀释倍数成梯度的稀释液；分别吸取稀释液涂布ISP2平板，28-30℃培养7-14天，进行平板菌落计数，得出土壤样本稀释倍数，稀释液添加量和菌落数之间的关系；
S2、96孔细胞培养板铺制：将呈液体状态的ISP2培养基倒入储液槽，使用微量移液器向96孔板各孔室加入ISP2培养基，待凝固后使用；
S3、土壤样本稀释和点板：根据平板菌落计数结果换算出土壤样本稀释倍数达到0.4-0.8个菌落/孔的理论值；称取土壤样本，按换算出的稀释倍数进行土壤样本的稀释，得待筛选土壤稀释液；向步骤S2中96孔板的各孔室加入所述待筛选土壤稀释液，静置；
S4、放线菌培养和纯化：将步骤S3的96孔板置于恒温培养箱中28-30℃倒置培养7-12天后，从96孔板各孔室挑取单菌落，在ISP2平板上连续划线，划线后置于恒温培养箱中28-30℃倒置培养2-10天；
S5、放线菌筛选和鉴定：基于菌落特征识别霉菌，霉菌之外的菌株基于16S rDNA序列分析法进行鉴定。
3.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S1和S4中，所述ISP2平板是将ISP2培养基倒入培养皿，待培养基凝固制备而得。
4.根据权利要求1或2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，所述ISP2培养基是将酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，琼脂粉15g，用去离子水定容至1000ml，调节pH至7.2，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷至55-60℃时，加入
K2Cr2O7和萘啶酮酸，混合均匀而得；所述K2Cr2O7的终浓度为50μg/ml，所述萘啶酮酸的终浓度为20μg/ml。
5.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S1中，稀释倍数成梯度的稀释液为10倍、100倍、1000倍三个梯度的稀释液。
6.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S2中，使用8道或12道微量移液器向96孔板各孔室加入ISP2培养基100或200μl。
7.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S3中，使用8道或12道微量移液器向96孔板各孔室加入所述待筛选土壤稀释液5-10μl，静置5-10min，使菌液吸附进培养基。
8.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S5中，霉菌菌落的培养特征包括霉菌菌落较大，质地疏松，外观干燥，不透明，呈现或松或紧的形状。
9.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，步骤S5中，16S rDNA序列分析法鉴定步骤包括菌株小量培养、基因组DNA小量提取、PCR扩增16S rDNA片段和16S rDNA序列比对分析。
10.根据权利要求2所述的应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，其特征在于，PCR扩增16S rDNA片段采用细菌16S rRNA基因测序通用引物27F和1492R作为PCR扩增引物。
技术说明书
一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法
技术领域
本技术属于微生物技术领域，涉及一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法；尤其涉及一种能消除培养皿平板培养时微生物间的竞争、抑制等影响的从土壤中筛选稀有放线菌的方法。
背景技术
稀有放线菌是指用常规分离程序和手段筛选放线菌时，出现频率比链霉菌低得多的放线菌。稀有放线菌可产生种类多样的抗生素，如红霉素、庆大霉素、利福霉素、万古霉素、马杜拉霉素等，已创造出巨大的经济价值，稀有放线菌产生新抗生素的潜力极大。
迄今为止，科研人员通过设计新型培养基、进行样品前处理和采集极端或特殊生境样品等方式，在稀有放线菌资源开发上取得了显著进步，越来越多的稀有放线菌新分类单元得以发现。然而，目前从土壤中筛选稀有放线菌主要依赖传统的培养皿平板涂布法。培养皿平板培养时，适应力强、生长快的霉菌或链霉菌会在平板上率先形成大的菌落，竞争资源和空间，其代谢过程中产生的过氧化物、自由基和超氧化物可能使其周围适应力较差或生长较慢的放线菌受到抑制或毒害，处于休眠状态或死亡，导
致其不可培养，限制了稀有放线菌的发现。
通过对现有专利文献的检索发现，CN101974470A介绍了一种主要用于土壤稀有放线菌的分离方法；其通过无菌水多次淘洗减少土壤样品中的优势菌；根据放线菌容易紧密依附于营养基质的特点，通过接种淘洗后剩下的沉淀泥于放线菌选择培养基上来提高稀有放线菌分离的成功率，解决了分离放线菌时土壤中优势菌的干扰问题。然而，该专利在土壤样品处理后采用培养皿平板培养法，菌落间的相互抑制无法回避。
技术内容
本技术针对培养皿平板培养法筛选稀有放线菌的缺陷，提供一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法。
本技术的目的是通过以下技术方案来实现的：
本技术涉及一种应用96孔细胞培养板从土壤中筛选稀有放线菌的方法，将放线菌选择培养基加入96孔细胞培养板各孔室，土壤样本经稀释后添加至96孔板各孔室进行放线菌培养，达到隔离培养的效果。
进一步的，所述方法包括如下步骤：
S1、平板菌落计数：称取土壤样本，加入无菌水进行系列稀释，得到稀释倍数成梯度的稀释液；分别吸取稀释液涂布ISP2平板，28-30℃培养7-14天，进行平板菌落计数，得出土壤样本稀释倍数，稀释液添加量和菌落数之间的关系；(放线菌从自然生境土壤转移到人工培养基中，需要一个适应期，之后进入繁殖期，适应力强繁殖快的放线菌3-5天内可形成肉眼可见的菌落，适应力弱繁殖慢的放线菌则需要1-2周甚至更长时间，为了培养种类更多的放线菌，一般培养7-14天)
S2、96孔细胞培养板铺制：将呈液体状态的ISP2培养基倒入储液槽，使用微量移液器向96孔板各孔室加入ISP2培养基，待凝固后使用；
S3、土壤样本稀释和点板：根据平板菌落计数结果换算出土壤样本稀释倍数达到0.4-0.8个菌落/孔的理论值；称取土壤样本，按换算出的稀释倍数进行土壤样本的稀释，得待筛选土壤稀释液；使用微量移液器向步骤S2中96孔板的各孔室加入所述待筛选土壤稀释液，静置；
S4、放线菌培养和纯化：将步骤S3的96孔板置于恒温培养箱中28-30℃倒置培养7-12天后，从96孔板各孔室挑取单菌落，在ISP2平板上连续划线，划线后置于恒温培养箱中28-30℃倒置培养2-10天；
S5、放线菌筛选和鉴定：基于菌落特征识别霉菌，霉菌之外的菌株基于16S rDNA序列分析法进行鉴定。
进一步的，步骤S1和S4中，所述ISP2平板是将ISP2培养基倒入培养皿，待培养基凝固制备而得。
进一步的，所述ISP2培养基是将酵母浸粉4g，麦芽浸粉10g，葡萄糖4g，琼脂粉15g，用去离子水定容至1000ml，调节pH至7.2，115℃高压蒸汽灭菌30min，冷至55-60℃时，加入
K2Cr2O7和萘啶酮酸，混合均匀而得；所述K2Cr2O7的终浓度为50μg/ml，所述萘啶酮酸的终浓度为20μg/ml。
进一步的，步骤S1中，稀释倍数成梯度的稀释液为10倍、100倍、1000倍三个梯度的稀释液。
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