论著•基础研究doi：10. 3969/j.issn. 1671-8348. 2021. 06. 006
李兰•曹倩△，李勇，李云川，邹莹，龙俊君，刘浩文，何柳余
(昆明市第一人民医院眼科，云南昆明650000)
[摘要]目的探讨大鼠角膜移植术术后玻璃体腔内注射白细胞介素-1受体拮抗剂（IL-lra)对白细胞介素-ip(IL-ip)、调节性T淋巴细胞（T re g)及排斥反应的影响。方法取心脏死亡供体S D大鼠角膜分别在24 只受体S D大鼠内行穿透性角膜移植术，将受体大鼠分为磷酸缓冲盐溶液（P B S)组与I L-l r a组，术毕分别于玻璃体腔注射P B S或IL-lra 1I U。术后1、3、5周，观察并记录角膜排斥反应指数（R I)，取全血、淋巴结检测IL-ip 水平与T r e g数量。结果术后1、3、5周，两组全血、淋巴结IL-1(3水平逐渐降低，T r e g数量均逐渐升高，组内 不同时间点两两比较差异有统计学意义（P<0.05)。术后1、3、5周，I L-l r a组全血、淋巴结中IL-1(3水平较P B S组明显下降（P<0.05);I L-l r a组全血、淋巴结中T r e g数量较P B S组升高，其中术后3、5周全血T r e g数 量两组间差异有统计学意义（P<0.05)，术后1、3、5周淋巴结中T r e g数量两组间差异有统计学意义（P< 0.05)。术后3、5周，I L-l r a组R I明显低于P B S组（P C0.05)。结论大鼠角膜移植术术后玻璃体腔注射IL- l r a可减轻炎性反应，升高全血、淋巴结中T r e g数量，减少排斥反应。 [关键词]白细胞介素-1受体桔抗剂；角膜移植；排斥反应；调节性T淋巴细胞；Sprague D a w ley大鼠 [中图法分类号]R779.6 [文献标识码] A [文章编号]1671-8348(2021)06-0927-05
Exploring the effect of interleukin-1 receptor antagonist on Treg after
corneal transplantation in rats "
L l L a n，C A O Q i a7i s，L I Y o n g，L l Y u n c h u a n，Z O U Y i7i g，L O N G J u n j u n，L l U H a o w e n，H E L i u y u (Department o f O p h t h a m o l o g y，the First Hos pit al o f K u n m i n g，Y u n n a n，K u n m i n g6SQQQQ，China) [Abstract] Objective To investigate the effects of vitreous cavity injection of interleukin-1 receptor antagonist (IL-lra) on interleukin-l(3 (I L-ip), regulatory T lymphocytes (T reg) and transplant rejection after corneal transplantation. Methods The cornea of cardiac death donor SD rat were transplanted on 24 recipient SD rats,the receptor rats were divided into the phosphate buffer saline (PBS) group and the IL-lra group, 1 IU of PBS injection or IL-lra were injected into vitreous cavity after surgery. 1,3,and 5 weeks after surgery, the corneal rejection index (RI) was observed and recorded,and the whole blood and lymph nodes were collected to detect the level of IL-1(3 and the number of Treg. Results The IL-1J3 level in the whole blood and lymph nodes of the two groups were grudually decreased at the time of 1,3 and 5 weeks a
fter surgery,and the number of Treg were grudually increased, the differences in pairwise comparisons at different time point were statstically significant (P<C0. 05). 1,3, and 5 weeks after operation, IL-ip levels in the whole blood and the lymph nodes in the IL-lra group were significantly lower than those in the PBS group (P<〇. 05). The number of Treg in the whole blood and the lymph nodes in the IL-lra group were higher than that in the PBS group. Among them,the number of Treg in whole blood was significantly different between the two groups at 3 and 5 weeks after surgery (P<〇. 05),and the number of TregvS in lymph nodes was significantly different between the two groups at 1,3,and 5 weeks after surgery (P<C0. 05). The RI of the IL-lra group was significantly lower than that of the PBS group at 3,5 weeks after surgery (P<i0. 05). Conclusion Intravitreal injection of IL-lra after corneal transplantation in rats can reduce inflammatory response,increase the number of Treg in whole blood,lymph nodes,and reduce rejection.
[Key words] interleukin-1 receptor antagonists；corneal transplantation；rejection；regulatory T lymphocytes； Sprague Dawley mice *
*基金项目：云南省科技厅昆医联合专项（2018FE00U—010))。作者简介：李兰（1963 )，主任医师，硕士，主要从事眼表疾病及角膜病研究。通信作者，E-mail:*******************。
角膜移植术是目前角膜盲患者复明的唯一方式[1]，即使在局部和全身免疫抑制的前提下•患者的角膜移植术失败率仍可能超过50%M。介导角 膜移植术排斥反应的细胞和分子机制还不十分清楚。大量研究提示，炎性因子介导的炎性反应是角膜移植术排斥反应发生的基础，其中白细胞介素IpOnterleu- kin-l(3，IL-l(3)是关键因子…]。CD4+CD25+ Foxp3 +调节性T淋巴细胞（regulatory T cells. T reg)为参与 眼前房相关免疫偏离的重要细胞W，近年来成为研究热点。目前研究表明炎性微环境下多聚泛素化作用可导致F o x p3蛋白降解，T r e g免疫抑制功能受损[6]。为了解角膜移植术术后白细胞介素-1受体拮抗剂（in- terleukin-1 receptor antagonist，IL-lra，美国Selleck 公司）对IL-l(3、T r e g及排斥反应的影响，本文建立心脏死亡供体（donation after cardiac death, DCD)大鼠 角膜移植术模型后，受体S D大鼠玻璃体腔注射IL- l r a，观察角膜移植术情况并检测S D大鼠全血、淋巴 结中IL-l(3、T r e g水平.旨在为角膜移植术排斥反应的防治提供一定的实验依据。
1材料与方法
1.1材料
S D大鼠，体重220〜250 g,8〜10周龄.购于湖南 斯莱克景达实验动物有限公司，词料由江苏美迪森生物医药有限公司提供，清洁级适应性词养1周后进行实验。实验程序经过昆明市第一人民医院医学伦理委员会动物实验伦理审查批准通过（批准号：YLS.2020-119)。
1.2 方法
1.2.1 供体准备
取12只S D大鼠，使用5 m L注射器抽取5 mL 空气于大鼠左侧肋骨角偏左上方心脏方向处进针，回抽见血液确定穿刺部位位于心腔，注射5 m L空气处 死大鼠，建立心脏死亡模型。5%〜10%聚维酮碘消毒右眼结膜囊5 m im生理盐水冲洗结膜囊。沿角膜缘360°剪下全层角膜供体,4. 25 m m环钻制作角膜植片置于O ptiso l保护液中备用。
1.2.2受体准备
共24只S D大鼠，采用硬币法分为磷酸盐缓冲液(PB S)组与I L-l r a组，各12只。采用10%水合氯醛按照3 m L/k g行大鼠腹腔麻醉后以盐酸奥布卡因滴眼液滴右眼，4.0 m m环钻制作好植床。
1.2.3角膜移植术
取D C D大鼠角膜植片，分别在受体大鼠内行穿透性角膜移植术，将供体角膜植片置于受体植床上，使用12-0国产显微缝线进行间断缝合8针，线节不埋藏.前房内注人空气约0.1 m L形成前房。术毕.按照 实验分组，P B S组玻璃体腔注射PBS 1I U，IL-l r a组 玻璃体膜注射IL-lra 1I U，结膜囊内点妥布霉素眼膏，6-0缝线缝合眼睑中部防止术后大鼠抓挠眼部引起感染，术后24 h剪开眼睑缝线，点妥布霉素眼
膏，1次/天，连续使用1周。
1.2. 4 观察指标
(1)角膜移植术排斥反应情况评分：术后用体视镜每周观察并拍照记录术眼角膜水肿、角膜混浊、新 生血管情况，由同一医生进行角膜移植术排斥反应评分，3项评分之和为排斥指数（rejection index, R I), 当R I>6，确定为排斥w。（2)分别于术后1、3、5周处 死每组大鼠各4只，取外周血、淋巴结，E L IS A法检测 IL-1P表达水平，流式细胞术检测T r e g数量。
1.3 统计学处理
采用S P S S19.0软件对数据进行统计分析，计量资料以I± .s•表示，术后同组各时间点比较采用重复测量方差分析，同一时间点组间比较采用两独立样本t检验，以P〈0. 05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 大鼠全血和淋巴结中IL-1(3水平比较
术后1、3、5周.两组全血、淋巴结IL-1|3水平逐渐降低，T r e g数量均逐渐升高，组内不同时间点两两比较差异有统计学意义（户<〇.〇5)。术后1、3、5周，11，l r a组大鼠全血、淋巴结中IL-1(3水平均明显低于PBS 组大鼠，差异有统计学意义（P<〇.〇5)。见表1、2。
表1大鼠角膜移植术后全血IL-i p水平
比较，pg/m L)
时间
PBS组
(w=4)
IL-lra 组
(n=4)
t P
术后1周42.454±4.03518.540士2.973 5.4120.032 5术后3周27.248±3.877a4. 705士1.501a7.1950.018 8术后5周16.330±2.943a b 3.136士2.851a b18.0400.003 1 F20.5523.52
P0.030 90.038 1
"：尸<0.05，与同组术后1周比较，1>：尸<0.05，与同组术后3周比较。
表2大鼠角膜移植术后淋巴结中水平
比较(!F士5，pg/m L)
时间
PBS组
(«=4)
IL-lra 组
(w=4)
t P
术后1周57.173士7.02216.374土3.478 6.1930.025 1术后3周36.353土4.465a13.844土4.673a17.6800.003 2
IL -1ra 组
续表2 大鼠角膜移植术后淋巴结中I L 1卩水平比较(7士s ,pg /m L )时间PBS 组(w=4)IL-lra 组 (n=4)t P 术后5周28.839 土 3.978a b 5.583±1.524a b 7.703 0.016 4F 17.4197.25P 0.049 30.005 4"：尸<0.05，与同组术后1周比较汐：户<0.05，与同组术后3周比较。2. 2 大鼠全血和淋巴结T r e g 数量比较术后1、3、5周，两组全血、淋巴结T r e g 数量逐渐 升高，组内不同时间点两两比较差异有统计学意义 (P <0.05)。见表3、4。术后1周P B S 组全血Treg 数量与I L -l m 组比较，差异无统计学意义（P 二0.090)，见表3，图1A 。术后3、5周，I L -l r a 组全血
T r e g 数量高于P B S 组，差异有统计学意义（P <
0.05)。术后1、3、5周，I L -l r a 组淋巴结T r e g 数量均 高于P B S 组，差异有统计学意义（P C 0.05)，见表4, 图1B 。表3 大鼠角膜移植术后全血T re g 数量
比较(：？ 土 △••%)时间P B S 组(w=4)IL-lra 组（《=4)t P 术后1周1,167 士 0.046 1.483±0.035 1.7400.090 0术后3周 2.225土0.09”6. 560土 0.079s 474.600<0.000 1
术后5周 5.135±0.091a b 9.538士 0.490a b 14.4200.004 8F 1 043.000388.400
P 0.000 70.002 4
|:P <0.05，与同组术后1周比较，b:P <0. 05，与同组术后3周比较。
PBS 组
10' M 'C D 4 - P E -C V 7-A i ：
~~i o ' «*• »• ~v t
11_一1「3组
1周
I 。* I *-
f
PBS 组
□
^
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焊 V -3d -U • £dx£周5H f «.
C d X O d * * * *
2^"""p <3d -« • £d
X 〇d A：全血；B：淋巴结。
图1 流式细胞术检测Tregs 表达情
况
表4大鼠角膜移植术后淋巴结T regs数量
比较(7 士.、•，％)
时间PBS(«=4)II.，lra组（w=4)t P
术后1周 2.780 土0.562 3.899 士0.239 3.9860.018 4
术后3周 4.289 土0.036" 6.417 士0.105a11.6800.007 2
术后5周7.399 士0.304a b10.363 土0.089a b16.0100.003 9
F77.5201 187.000
P0.005 9<0.000 1
a:P<0. 05，与同组术后1周比较/:/><0. 05，与同组术后3周比较。
2.3角膜移植术排斥情况评分比较
术后1、3、5周，两组R I逐渐增加；术后1周，IL- l r a组与P B S组大鼠R I比较，差异无统计学意义(P = 0.337 5)；术后3、5周，I L-lr a组大鼠R I均低于 P B S组大鼠，差异有统计学意义（P C0.05)，见图2、表5〇
P B S组
术后1周术后3周术后5周
IL-1ra组
术后1周术后3周术后5周
图2体视显微镜观察移植角膜移植术排斥
反应情况（6.5X)
表5大鼠角膜移植术术后R I比较（7土s)
时间PBS组（”=4)IL-lra组（”=4)t P
术后1周 2. 800 士0.980 1.833 士0.898 1.0890.337 5
术后3周4.833土1.4623.500士0.9572.6970.042 9
术后5周5.833士0.898 4.167土0.9002.9880.030 5
F12. 3507.647
P0.005 90.013 1
3讨论
角膜移植术术后角膜植片的透明性主要通过3 种方法来维持：（1)抑制角膜异体免疫应答“2)诱导 免疫耐受；（3)清除存在于移植物-宿主处的可溶性细胞因子和膜结合蛋白或阻断免疫效应物[8_9]。近年 来，研究者致力于通过增加外源性T r e g的数量来抑制角膜移植术术后排斥反应，延长角膜植片的存活时间。研究表明.角膜移植术后的微环境是一种炎性环境，肿瘤坏死因子-a(T N F-a)中和性抗体及天冬氨酸特异性胱氨酸蛋白酶-8(C aspase-8)抑制剂可有效延缓角膜移植术排斥反应的发生，开拓了角膜移植术免疫排斥防治的新思路[1°'11]。本实验在D C D大鼠角膜移植术术毕于受体大鼠玻璃体腔内注射IL-lr a，并检测 到术后全血及淋巴结中T r e g数M增加。
眼前节免疫赦免机制在角膜移植术术后受到破坏，有大量炎性细胞浸润于角膜植片及房水中。以往 的实验研究也发现，角膜移植术术后眼前房内有大量巨噬细胞聚集，并可见巨噬细胞黏附于角膜内皮[11]
。巨噬细胞可产生T N F、IL-6等多种炎性细胞因子，是 角膜移植术术后早期浸润的炎性细胞.这表明角膜移植术术后的微环境是一种炎性环境。本实验中发现P B S组角膜移植术术后全血、淋巴结中I L-l p水平较]L-l r a组明显升高；I L-lr a组术后1、3、5周全血和淋巴结中IL-1(3水平均明显下降，且术后5周I L-i p水 平降至最低，表明IL-1 r a可明显抑制大鼠角膜移植术术后前房内炎性反应。
T r e g在免疫稳态的建立与维持中起重要作用，不 仅对T淋巴细胞具有抑制增殖、促进凋亡的作用，而 且可以负向调控B淋巴细胞、自然杀伤细胞（N K细 胞）、自然杀伤T淋巴细胞（N K T细胞）等多种免疫细胞的生物功能D213]，是参与眼前房相关免疫偏离的重要细胞类型之一[14]。有研究表明，IL-1卩刺激下Treg 减少，增加了角膜移植术术后排斥反应发生的概率[1516]。本研究中，流式细胞术检测术后1、3、5周 I L-lr a组全血、淋巴结中T r e g数量均升高，且术后5周升至最高，而全血检测到IL-1P水平逐渐降低，在术 后5周时降至最低，说明I L-l r a抑制了炎性因子的表达，促进了T r e g增殖。角膜移植术后排斥反应评分表明，随着时间延长R I增加，但I L-l r a组R I在术后 3周开始较P B S组明显降低。
综上所述，大鼠角膜移植术术后玻璃体腔注射
I L-lr a可降低全血、淋巴结中I L-i p水平，增加全血、淋巴结中T r e g数量，减轻术后排斥反应。但IL-lra 具体是通过何种通路作用于T re g，抑制角膜移植术后排斥反应的发生，仍需要进一步实验研究。
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(收稿日期:2020-12-18 修回日期：2021-0卜12)
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