一种用于阿尔茨海默病的中药组合物、其制备方法和应用

本发明涉及一种中药组合物及其制备方法和应用，特别涉及一种用于阿尔茨 海默病的中药组合物及其制备方法和应用。本发明属于中药技术领域。

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)是一种进行性、老年性、神经性、退行性的 常见疾病之一，其将严重危及全世界人们的生命和健康，且阿尔茨海默病多表现为在机体 脑组织内部异常蛋白质聚集、炎症反应、血脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB)通透性改 变、氧化应激反应、神经元功能障碍、脑组织内信号通路紊乱等。

目前，阿尔茨海默病的发病机制还不清楚，其主流学说为Aβ蛋白学说，Aβ蛋白与炎 症介质、胆碱能神经元、血管内皮细胞、自由基、基因突变、钙稳态、Tau蛋白、胰岛素抵抗等 均有一定关系，可见，阿尔茨海默病的发病机制是极为复杂的。

一般而言，在机体正常的情况下，Aβ蛋白是β-淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid-β precursor protein，APP)通过β、γ-分泌酶水解产生的Aβ1-40蛋白、Aβ1-42蛋白等，且Aβ1-42蛋 白含量仅占有Aβ蛋白总量的10％，Aβ1-42蛋白将来可以在阿尔茨海默病患者脑组织神经元 外侧形成老年斑(Senile plaques，SP)，引起阿尔茨海默病患者脑组织神经元损伤，造成脑 组织神经元数量减少，尤其是阿尔茨海默病患者脑组织海马区域神经元侵犯最为严重，这 与机体脑组织海马在学习和记忆中起着至关重要作用有一定关系。实际上，Aβ蛋白异常积 累还会引起机体脑组织小胶质细胞及星形胶质细胞异常活化，还会进一步促进小胶质细胞 及星形胶质细胞可以产生更多的炎症介质，例如白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤 坏死因子-α，这些炎症介质IL-1β、TNF-α、IL-6等将会继续加重机体脑组织的炎症反应，继 而对阿尔茨海默病患者带来更大的危害。Aβ蛋白异常积累可以与机体脑组织BBB通透性的 异常改变密切相关，一旦机体脑组织BBB通透性异常会加速Aβ蛋白沉积于机体脑组织，且会 出现Aβ蛋白相关的转运蛋白例如低密度脂蛋白相关蛋白1(Lipoprotein receptor- relatedprotein1，LRP1)、载脂蛋白J(Apolipoprotein J，Apo J)、晚期糖基化终产物受体 (Receptor for advanced glycation end products，RAGE)、核转录因子-κBp65(Nuclear transcription factor-κBp65，NF-κB p65)等表达异常，还会引起学习记忆能力下降、自由 基产生增加、抗氧化功能降低等，其中，抗氧化功能降低主要表现为机体脑组织总抗氧化能 力(Total antioxidant capacity，T-AOC)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase， SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-PX)含量降低及氧化产物丙二 醛(Malondialdehyde，MDA)增加等，而使用抗氧化剂纳米颗粒可以有效地增强GSH-PX、SOD 含量，减少MDA含量，这将会有助于阿尔茨海默病的积极。

针对现代医学许多药物可以防治阿尔茨海默病，例如乙酰胆碱酯酶抑制剂、抗神 经元细胞凋亡药物、抗Aβ药物、雌激素、抗氧化剂等，但是这些药物的副作用比较明显，而依 据中医学理论选择的中医药以副作用小、多靶点、多成分、多效应、协同作用强、整体调节的 特点，在阿尔茨海默病这种难治性疾病的中具有独特的优势，因此，从中医学理论剖析 阿尔茨海默病的病机并且探寻副作用小、作用靶点多、具有整体调节的中药组合物就显得 尤为重要。

本发明的目的在于提供一种用于阿尔茨海默病的中药组合物、其制备方法和 应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种用于阿尔茨海默病的中药组合物，所述的中药组合物由以下重 量份的各原料组成：莲子5-15重量份、天门5-15重量份、北豆根2-10重量份、蚤休2-10重量 份、紫草5-15重量份、地榆5-15重量份、天南星2-10重量份、桔梗2-10重量份、射干2-10重量 份、没药5-15重量份、牡丹皮5-15重量份、羌活15-25重量份、川椒1-5重量份、络石藤5-15重 量份、鸡血藤10-15重量份、香附10-15重量份、青皮5-10重量份以及豆蔻2-8重量份。

其中，优选的，所述的中药组合物由以下重量份的各原料组成：莲子10.5重量份、 天门10.5重量份、北豆根6重量份、蚤休6.5重量份、紫草9重量份、地榆12重量份、天南星6重 量份、桔梗6.5重量份、射干5.75重量份、没药10重量份、牡丹皮12.5重量份、羌活17.5重量 份、川椒3.5重量份、络石藤10.5重量份、鸡血藤12.5重量份、香附12.5重量份、青皮6.5重量 份以及豆蔻4.5重量份。

中医理论认为，阿尔茨海默病又称为呆病、老年呆病、郁证、善忘、癒证、痴呆症等， 在陈士铎《辨证录》中写到关于阿尔茨海默病的病机，人有老年而健忘，犹若茫然，此真健忘 之极也，人以为心血之涸，谁知肾水之竭乎，即阿尔茨海默病的发病基础是肾虚，若针对阿 尔茨海默病进行补肾则有利于阿尔茨海默病的积极，这与现代医家介绍相似，阿尔茨 海默病的病因病机以肾虛为主，肾精亏损，肾气不足，将采用从肾论治，以补肾为主要 原则会具有较好疗效；在《灵枢天年》中提到关于阿尔茨海默病的病机，人八十岁，魂魄离 散，故言善误，即老年人脏腑气血多亏虚尤其是肾虚，很容易出现言语混乱、记忆力衰退、行 为异常等阿尔茨海默病症状；在清代王清任《医林改错》中提出关于阿尔茨海默病的病机， 年高无记性者，脑髓渐空也，即老年人阿尔茨海默病的发生多与脑组织有关；在《千金翼方》 中指出关于阿尔茨海默病的病机，人五十以上阳气始衰，损与日至，心力渐退，忘失前后，兴 居怠惰，即强调阿尔茨海默病会出现典型的学习记忆能力减退；在王肯堂的《证治准绳》指 出关于阿尔茨海默病的病机，有病癫人，善痰为癫，气结痰故也，即指出阿尔茨海默病多因 为痰浊而致病；在《伤寒论》中指出关于阿尔茨海默病的病机，其人喜忘者，必有蓄血，则强 调了瘀血在阿尔茨海默病的病机中的发挥重要作用；在唐容川《血证论痰血》中指出关于阿 尔茨海默病的病机，瘀血攻心，加速心痛、头晕、神气昏迷，而致痴呆，即指出瘀血是阿尔茨 海默病的主要病机之一。

本发明发明人结合众多医家著作的见解分析，可见阿尔茨海默病在机体肾精亏虚 的前提下，内生浊毒侵犯机体而致气滞瘀血，痰瘀实邪，痰浊阻络，湿邪凝聚，引起脑髓损 伤、神明失养、神明逆乱，最终演化为脑组织循环障碍、全脑组织缺血。在现代研究者刘洋详 细介绍阿尔茨海默病的毒损脑络理论中，肾精亏虚是阿尔茨海默病发生的前提，浊毒积聚、 损伤脑髓是阿尔茨海默病发病的重要机制(刘洋.基于毒损脑络病机理论的阿尔茨海默病 机制研究[D].北京中医药大学，2013.)。由此，依据中医学毒损脑络的基本理论，同时结合 《辨证录》、《灵枢天年》、《医林改错》、《证治准绳》、《血证论痰血》等中医学古典著作，阿尔茨 海默病的病机主要表现为肾精亏虚、浊毒积聚、痰瘀实邪、湿邪凝聚、气滞瘀血，造成老年人 精血亏损、脑髓空虚、元气不足，进而机体阴阳失调、神机失用，将会出现呆、傻、愚、笨等阿 尔茨海默病的典型诸症，可见，积极有效地阿尔茨海默病需要坚持补肾祛毒、消痰散 瘀、除湿通络、理气行气的基本原则。

为此，本发明针对阿尔茨海默病的基本原则补肾祛毒、消痰散瘀、除湿通络、 理气行气，于是提供了由十八味中药材组成的中药组合物，该中药组合物包括莲子、天门、 北豆根、蚤休、紫草、地榆、天南星、桔梗、射干、没药、牡丹皮、羌活、川椒、络石藤、鸡血藤、香 附、青皮以及豆蔻。

其中，莲子，别名莲蓬子，味甘、涩，性平，归肾经、心经、脾经、胃经、肝经、膀胱经， 具有补肾养心、补脾开胃、止呕涩肠的功效，常用剂量6～15g内服煎汤；天门，别名天门冬， 味甘、苦，性寒，归肾经、肺经、胃经、大肠经，具有补肾润肺、养阴生津、清心化痰的功效，常 用剂量6～15g内服煎汤；北豆根，别名山豆根，味苦，性寒，归肺经、胃经、大肠经，具有祛毒 止痛、清热祛风的功效，常用剂量3～9g内服煎汤；蚤休，别名七叶一枝花、紫河车、重台草， 味苦，性寒，归心经、肝经，具有祛毒平喘、清热止咳、定惊熄风、消肿止血的功效，常用剂量3 ～10g内服煎汤；紫草，别名大紫草、山紫草，味甘、咸，性寒，归心经、肝经，具有祛毒活血、凉 血透疹的功效，常用剂量6～12g内服煎汤；地榆，别名黄瓜香、山枣子，味苦、酸、涩，性寒，归 肝经、大肠经，具有祛毒止血、敛疮凉血的功效，常用剂量9～15g内服煎汤；天南星，别名山 棒子、鬼南星、山苞米，味辛、苦，性温，归肺经、肝经、脾经，具有消痰祛风、燥湿消肿、解痉除 痫的功效，常用剂量3～9g内服煎汤；桔梗，别名四叶菜、包袱花，味辛、苦，性平，归肺经、胃 经，具有消痰排脓、开宣肺气的功效，常用剂量3～10g内服煎汤；射干，别名扁竹、乌扇，味 苦，性寒，归肺经、肝经，具有消痰散血、祛毒降火的功效，常用剂量4～7.5g内服煎汤；没药， 别名末药、明没药，味苦，性平，归肝经，具有散瘀消肿、散血定痛、健胃活血的功效，常用剂 量5～15g内服煎汤；牡丹皮，别名丹皮、花相，味辛、苦，性凉，归心经、肝经、肾经，具有散瘀 和血、清热凉血的功效，常用剂量7.5～15g内服煎汤；羌活，别名羌滑、胡王使者，味辛、苦， 性温，归膀胱经、肾经，具有除湿散寒、祛风强筋、除痈止痛的功效，常用剂量10～25g内服煎 汤；川椒，别名香椒、山椒，味辛，性温，归脾经、胃经、肾经，具有除湿止痛、温中杀虫的功效， 常用剂量2～5g内服煎汤；络石藤，别名悬石、石龙藤，味辛、苦，性寒，归心经、肝经、肾经，具 有通络止痛、祛毒消肿、清热凉血的功效，常用剂量6～15g内服煎汤；鸡血藤，别名紫梗藤、 血龙藤，味甘、苦，性温，归心经、脾经，具有通络补血、舒筋活血、养血调经的功效，常用剂量 10～15g内服煎汤；香附，别名雷公头、香头草，味辛、甘、苦，性平，归肝经、脾经、三焦经，具 有理气止痛、解郁调经、除痞消痰的功效，常用剂量7.5～15g内服煎汤；青皮，别名青柑皮、 青橘皮，味辛、苦，性温，归肝经、胆经，具有理气消痰、疏肝散结的功效，常用剂量3～10g内 服煎汤；豆蔻，别名白豆蔻、圆豆蔻，味辛，性温，归肺经、脾经、胃经，具有行气消痰、除湿温 中、开胃消食的功效，常用剂量3～6g内服煎汤。

综合分析，本发明选择莲子、天门、北豆根、蚤休、紫草、地榆、天南星、桔梗、射干、 没药、牡丹皮、羌活、川椒、络石藤、鸡血藤、香附、青皮、豆蔻共十八种药材组成中药组合物， 其中，君药莲子、天门、北豆根、蚤休、紫草、地榆主要以补肾祛毒为主；臣药天南星、桔梗、射 干、没药、牡丹皮主要以消痰散瘀为主；佐药羌活、川椒、络石藤、鸡血藤主要以除湿通络为 主；臣药香附、青皮、豆蔻主要以理气行气为主。本发明防治阿尔茨海默病中药组合物的主 要功效为补肾祛毒、消痰散瘀、除湿通络、理气行气。该中药组合物可以在肾精亏虚的前提 下进行补肾，祛除内生浊毒，改善气滞瘀血、痰瘀实邪、痰浊阻络，湿邪凝聚，避免脑髓损伤、 神明失养、神明逆乱，最终将依据阿尔茨海默病的毒损脑络理论进行补肾祛毒、消痰散瘀、 除湿通络、理气行气，这对于肾精亏虚、内生浊毒、痰瘀实邪的阿尔茨海默病，将会具有较好 的效果。

进一步的，本发明将该中药组合物制备成干粉，观察中药组合物高、中、低剂量 (42.32g/kg、21.16g/kg、10.58g/kg)对阿尔茨海默病小鼠的影响及作用机制，检测指标包 括各组小鼠的学习记忆能力、海马APP相关蛋白、海马炎症介质、血脑屏障的通透性、海马抗 氧化能力、海马形态结构、脾指数、胸腺指数、脑指数、体重等，还包括海马LRP1、Apo J、 RAGE、NF-κBp65蛋白和基因表达等。实验结果表明，中药组合物高剂量(42.32g/kg)、中药组 合物中剂量(21.16g/kg)可以改善阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力、海马APP相关蛋白、海 马炎症介质、血脑屏障通透性、海马抗氧化能力、海马形态结构等，其还可以改善海马LRP1、 Apo J、RAGE、NF-κBp65蛋白和基因表达，且其对阿尔茨海默病小鼠心、肺、肝、肾脏器指数和 体重无影响，说明该中药组合物阿尔茨海默病有效并且无副作用。

因此，在上述研究的基础上，本发明还提出了所述的中药组合物在制备用于阿尔 茨海默病的药物中的应用。

其中，优选的，向所述的中药组合物中加入制剂成型所需的辅料，按照药物制剂常 规方法做成临床上适宜的各种药物制剂。其中，优选的，所述的药物制剂为水煎剂、胶囊剂、 丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。

在本发明的一个具体实施例中提供了一种制备用于阿尔茨海默病的水煎剂 的方法，包括以下步骤：

(1)按照本发明所述的重量份称取各原料；

(2)将步骤(1)称取得到的各原料混合后，加入原料总重量8-15倍的蒸馏水，浸泡 1.5-2.5h，之后煎煮1.5-2.5h，过滤，得到第一次中药组合物滤液以及残渣；

(3)向步骤(2)获得的中药组合物残渣中加入与步骤(2)相同体积的蒸馏水，浸泡 中药组合物残渣1.5-2.5h，煎煮中药组合物残渣1.5-2.5h，过滤后，得到第二次中药组合物 滤液；

(4)将第一次中药组合物滤液和第二次中药组合物滤液合并，混匀，即得到用于阿 尔茨海默病的水煎剂。

其中，优选的，所述的过滤是指依次采用5层白纱布、15层白纱布分别过滤。

综上，本发明选择祖国医药莲子、天门、北豆根、蚤休、紫草、地榆、天南星、桔梗、射 干、没药、牡丹皮、羌活、川椒、络石藤、鸡血藤、香附、青皮以及豆蔻共十八种药材组成的中 药组合物，并开展了对阿尔茨海默病小鼠模型的，结果表明本发明的中药组合物对阿 尔茨海默病的综合效果明显并且无副作用。本发明的提出为阿尔茨海默病的提供 了一种新的技术手段，可以产生巨大的经济效益和社会效益，应用前景非常广阔。

图1为中药组合物对阿尔茨海默病小鼠学习能力的影响；注：与对照组比较：*P＜ 0.05，

下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将更为明 显。但实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1中药组合物的制备

所述的中药组合物由以下重量的各原料组成：莲子10.5g、天门10.5g、北豆根6g、 蚤休6.5g、紫草9g、地榆12g、天南星6g、桔梗6.5g、射干5.75g、没药10g、牡丹皮12.5g、羌活 17.5g、川椒3.5g、络石藤10.5g、鸡血藤12.5g、香附12.5g、青皮6.5g以及豆蔻4.5g。

实施例2中药组合物的制备

所述的中药组合物由以下重量的各原料组成：莲子5g、天门15g、北豆根3g、蚤休 3g、紫草5g、地榆15g、天南星5g、桔梗5g、射干5g、没药8g、牡丹皮15g、羌活15g、川椒4g、络石 藤10g、鸡血藤13g、香附12g、青皮7g、豆蔻4g。

实施例3中药组合物的制备

所述的中药组合物由以下重量的各原料组成：莲子15g、天门5g、北豆根10g、蚤休 8g、紫草12g、地榆5g、天南星2g、桔梗3g、射干10g、没药15g、牡丹皮5g、羌活20g、川椒2g、络 石藤12g、鸡血藤8g、香附10g、青皮10g、豆蔻6g。

实施例4用于阿尔茨海默病的水煎剂的制备

(1)按照以下重量称取各原料：

莲子10.5g、天门10.5g、北豆根6g、蚤休6.5g、紫草9g、地榆12g、天南星6g、桔梗 6.5g、射干5.75g、没药10g、牡丹皮12.5g、羌活17.5g、川椒3.5g、络石藤10.5g、鸡血藤 12.5g、香附12.5g、青皮6.5g、豆蔻4.5g，共计162.75g。

(2)第一次煎煮

将步骤(1)称取得到的各原料混合后，放入20000mL大型高颈圆底烧瓶中，加入蒸 馏水1375mL，需要蒸馏水浸泡162.75g中药组合物2h，蒸馏水于100℃下煎煮中药组合物2h， 经过5层白纱布、15层白纱布分别过滤，获得中药组合物的第一次滤液以及残渣。

(3)第二次煎煮

将获得的中药组合物残渣放到大型高颈圆底烧瓶中，加入蒸馏水1375mL，蒸馏水 浸泡中药组合物残渣2h，蒸馏水于100℃下煎煮中药组合物残渣2h，经过5层白纱布、15层 白纱布分别过滤，获得关于中药组合物的第二次滤液。

(4)将中药组合物的第一次滤液和中药组合物的第二次滤液合并，混匀，即得到用 于阿尔茨海默病的水煎剂。

实验例1本发明中药组合物阿尔茨海默病的药效学试验

1实验材料

1.1实验动物

实验用C57BL/6J小鼠为4月龄雄性清洁级健康小鼠，体重为(23±2)g，共105只，实 验用C57BL/6J小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，质量合格证号为SCXK(京) 2012-0001。实验用C57BL/6J小鼠均常温、常湿饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心，提 供C57BL/6J小鼠充足的饮用水及其饲料。C57BL/6J小鼠放于笼中饲养，2只C57BL/6J小鼠/ 笼，均由黑龙江中医药大学实验动物中心李宝龙副主任随时观察C57BL/6J小鼠的一般状 态，2周后C57BL/6J小鼠状态良好就可进行后续的实验研究。

1.2实验仪器

Morris水迷宫，安徽淮北正华生物仪器有限公司；TGL-16G型台式离心机，上海安 亭科学仪器厂；超净工作台，中国上海精密仪器仪表公司；Applied Biosystems型定量PCR 仪，美国应用生物系统公司；-20℃冰箱，中国青岛海尔电器有限公司；PLZOZ-S型电子天平， 高速万能粉碎机，温岭市林大机械有限公司；HMIAS型高清晰度彩分析系统，武汉千屏影 像技术有限公司；6100型酶标仪，美国RT公司；超纯水仪，中国上海精密仪器仪表公司；超声 波清洗器，上海市科导超声仪器公司；E600型尼康显微镜，日本尼康公司；烤片机，德国 Leica公司；TECNAI G2型透射电子显微镜，FEI/Philips公司；其他相关仪器略。

1.3实验药品

盐酸多奈哌齐片，中国重庆植恩药业有限公司，批号20141201；中药组合物莲子、天门、北豆根、蚤休、紫草、地榆、天南星、桔梗、射干、没药、牡丹皮、羌活、川椒、络石藤、鸡血藤、香附、青皮、豆蔻均由黑龙江中医药大学周忠光教授购买于黑龙江中医药大学第一附属医院，同时由黑龙江中医药大学第一附属医院栗明副主任医师鉴定该中药组合物可配伍组合使用，然后由黑龙江中医药大学田明教授将该中药组合物制备成水煎剂、干膏、干粉保存备用；Aβ_1-42，Sigma公司；PrimeRT reagent KIT，日本TaKaRa公司；APP、Aβ_1-42、IL-1β、TNF-α和IL-6试剂盒，南京建成生物工程研究所；β-action、RAGE、LRP1、ApoJ、NF-κBp65均为Santa Cruz Biotechnology公司；Page Ruler^TM Prestained Protein Ladder SM0671，Fermentas公司；SOD、GSH-PX试剂盒，南京建成生物工程研究所；其他试剂均为国产分析纯由黑龙江中医药大学周忠光教授和齐齐哈尔医学院张英博副教授提供。

2方法

2.1实验动物分组

实验选择105只4月龄雄性清洁级C57BL/6J小鼠为研究对象，每组15只，体重(23± 3)g，将C57BL/6J小鼠按照随机数字表随机分成对照组、假手术组、模型组、多奈哌齐组、中 药组合物高剂量组，中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组，共分7组。

2.2阿尔茨海默病小鼠模型复制

参考文献(费洪新，高音，孙丽慧，等.黄芪多糖对阿尔茨海默病小鼠海马组织的影 响[J].中国老年学杂志，2015，35(16)：4426-4429.)制备阿尔茨海默病小鼠模型，选择健康 C57BL/6小鼠，抓取C57BL/6小鼠，麻醉C57BL/6小鼠，固定C57BL/6小鼠，剪去C57BL/6小鼠毛 发，消毒C57BL/6小鼠头部皮肤，剪开C57BL/6小鼠头部皮肤，使用脑组织立体定位仪器SN-2 定位C57BL/6小鼠海马区域，暴露C57BL/6小鼠头部颅骨，无菌条件下使用微量加样器于 C57BL/6小鼠双侧脑组织室一次性注入5μL凝聚态Aβ1-42(80pmol/μL)，微量加样器针头留下 2min，封闭C57BL/6小鼠颅骨孔，向C57BL/6小鼠颅骨内滴加抗生素庆大霉素，包扎C57BL/6 小鼠头部，消毒C57BL/6小鼠头部皮肤，单笼饲养C57BL/6小鼠，避免C57BL/6小鼠感染和 C57BL/6小鼠之间相互撕咬，以此复制关于C57BL/6小鼠的阿尔茨海默病小鼠模型。在制备 阿尔茨海默病模型结束后，可见对照组15只C57BL/6小鼠存活、假手术组14只C57BL/6小鼠 存活、模型组9只C57BL/6小鼠存活、多奈哌齐组9只C57BL/6小鼠存活、中药组合物高剂量组 10只C57BL/6小鼠存活，中药组合物中剂量组11只C57BL/6小鼠存活、中药组合物低剂量组9 只C57BL/6小鼠存活。另外，对照组、假手术组采用同样的方法，在C57BL/6小鼠双侧脑组织 室注射等量的生理盐水的方法进行处理。

2.3中药组合物提取

(1)计算每份中药组合物剂量

实验使用的中药组合物包括莲子10.5g、天门10.5g、北豆根6g、蚤休6.5g、紫草9g、 地榆12g、天南星6g、桔梗6.5g、射干5.75g、没药10g、牡丹皮12.5g、羌活17.5g、川椒3.5g、络 石藤10.5g、鸡血藤12.5g、香附12.5g、青皮6.5g、豆蔻4.5g，共计162.75g，此剂量为正常人 标准体重每份中药组合物的总体剂量。

(2)配制4份中药组合物

配制4份上述中药组合物，组成总重量为651g中药组合物。

(3)获取中药组合物第一次滤液

将651g中药组合物放入20000mL大型高颈圆底烧瓶中，加入蒸馏水5500mL，需要蒸 馏水浸泡651g中药组合物2h，蒸馏水于100℃下煎煮651g中药组合物2h，经过5层白纱布、 15层白纱布分别过滤，获得中药组合物的第一次滤液。

(4)获取中药组合物第二次滤液

将中药组合物残渣放到大型高颈圆底烧瓶中，加入蒸馏水5500mL，蒸馏水浸泡中 药组合物残渣2h，蒸馏水于100℃下煎煮中药组合物残渣2h，经过5层白纱布、15层白纱 布分别过滤，获得中药组合物的第二次滤液。

(5)获取中药组合物干膏

合并中药组合物的第一次滤液和第二次滤液，干燥箱于65℃下干燥中药组合物 5d，获得中药组合物干膏168.28g，则该中药组合物的出膏率为(干膏/中药组合物)× 100％，即(168.28g/651g)×100％＝25.85％，即1g中药组合物干膏相当于中药组合物原药 材3.87g。

(6)获取中药组合物干粉

将获得的中药组合物干膏粉碎、研磨、过滤、称重，获取中药组合物干粉161.19g， 则该中药组合物出粉率＝(干粉/中药组合物)×100％＝(161.19g/651g)×100％＝ 24.76％。

(7)保存中药组合物干粉

实验使用中药组合物651g，最终获取中药组合物干粉161.19g，即1g中药组合物干 粉相当于中药组合物原药材4.04g。分装该中药组合物干粉，12g/袋，于-80℃冰箱(日本 SANYO公司)保存备用，使用中药组合物的时候需要室温内融化中药组合物、搅拌中药组合 物，并按照小鼠的体表面积精细换算小鼠中药组合物给药量。

2.4药物剂量的设定

(1)中药组合物剂量的设定

中药组合物包括莲子10.5g、天门10.5g、北豆根6g、蚤休6.5g、紫草9g、地榆12g、天 南星6g、桔梗6.5g、射干5.75g、没药10g、牡丹皮12.5g、羌活17.5g、川椒3.5g、络石藤10.5g、 鸡血藤12.5g、香附12.5g、青皮6.5g、豆蔻4.5g，一共162.75g，此剂量经过黑龙江中医药大 学附属第一医院栗明副主任医师评定，是临床患者使用的常规可用剂量。依据小鼠和人的 体表面积比值0.0026：1，进行换算该中药组合物常规可用剂量，求得标准体重小鼠中药组 合物剂量是[(162.75g×0.0026)/20g小鼠]，将中药组合物剂量换算成分母是单位kg，将会 获得标准体重小鼠中药组合物剂量是[(162.75g×0.0026)/20g小鼠]×50，即21.1575g，经 过四舍五入后获取标准体重小鼠中药组合物剂量为21.16g，此剂量为针对阿尔茨海默病小 鼠模型的中药组合物中剂量，中药组合物高剂量是中药组合物中剂量的两倍且中药组合物 低剂量是中药组合物中剂量二分之一。最终设定了该中药组合物高剂量、中药组合物中剂 量、中药组合物低剂量分别是42.32g/kg、21.16g/kg、10.58g/kg，并以中药组合物42.32g/ kg、21.16g/kg、10.58g/kg分别作用于阿尔茨海默病小鼠模型，以此开展中药组合物防治阿 尔茨海默病的实验研究。

(2)阳物剂量的设定

临床上阿尔茨海默病患者使用多奈哌齐防治阿尔茨海默病的常规可用剂量是(5 ～10)mg，依据各组实验小鼠和人的体表面积比值为0.0026：1，通过换算成中药组合物阳性 药物剂量分母是单位kg，可以获取多奈哌齐防治阿尔茨海默病的最低常规可用剂量是5× 0.0026×50＝0.65mg/kg，且多奈哌齐防治阿尔茨海默病的最高常规可用剂量是10× 0.0026×50＝1.3mg/kg，即正常标准体重各组实验小鼠多奈哌齐防治阿尔茨海默病的常规 可用剂量是(0.65～1.3)mg/kg，换算成中药组合物阳物剂量分子是单位g，获取正常标 准体重各组实验小鼠多奈哌齐防治阿尔茨海默病的常规可用剂量是(0.00065～0.0013)g/ kg，因此，本发明专利选择0.001g/kg多奈哌齐常规可用剂量对阿尔茨海默病小鼠模型进行 阳物多奈哌齐的实验研究。

2.5实验动物给药

对照组、模型组、假手术组小鼠分别给予等量生理盐水灌胃给药，多奈哌齐组给予 多奈哌齐0.001g/kg灌胃给药，中药组合物高、中、低剂量组分别给予中药组合物42.32g/ kg、21.16g/kg、10.58g/kg灌胃给药，灌胃给药持续50d。在各组小鼠防治阿尔茨海默病的给 药过程中，对照组14只小鼠存活、假手术组14只小鼠存活、模型组8只小鼠存活、多奈哌齐组 8只小鼠存活、中药组合物高剂量组9只小鼠存活，中药组合物中剂量组10只小鼠存活、中药 组合物低剂量组9只小鼠存活，可见，各组中最小存活小鼠的数量为8只，因此，本实验选择 每组8只进行后续的防治阿尔茨海默病工作。

2.6检测学习记忆能力

各组小鼠的学习能力使用小鼠的潜伏期进行表示，采用Morris水迷宫进行测定、 评价小鼠的学习能力。Morris水迷宫实验需要在水池内注入清洁的自来水，水的深度控制 在20cm，水面高于第IV象限的移动平台1cm，以保证实验过程中小鼠看不到第IV象限的移动 平台为标准。水池内加入1000g奶粉及其白素的混合物，以保证水池呈现乳白，便于黑 的实验动物记录实验结果。Morris水迷宫实验进行5d，前4d是小鼠的训练时间。其中第3d 需要更换清洁的自来水，重新加入1000g奶粉及其白素的混合物。第IV象限的移动平台放 于Morris水迷宫第IV象限的中央部位，水池正上方的摄像机同步记录Morris水迷宫的实验 过程，获取第IV象限的移动平台的实验数据。每次第IV象限的移动平台训练的时间是60s， 倘若小鼠60s内寻不到第IV象限的移动平台，就需要将小鼠放在第IV象限的移动平台上 停留15s，用以增强小鼠的学习记忆能力。第5d是实验测试时间，测试的时候需要将小鼠头 朝外侧，放入第I、II、III象限，记录小鼠寻到第IV象限的移动平台的时间为潜伏期，获得 潜伏期数据，以此来评价小鼠的学习能力。测试第5d的时候，撤去平台，检测小鼠60s内到 平台的游泳距离，以此来评价AD小鼠的记忆能力。在测试第5d时候撤去第IV象限的移动平 台，测试在60s内小鼠跨越第IV象限移动平台所在位置的次数(跨平台次数)及其小鼠在原 平台所在象限的游泳时间(目标象限停留时间)，以此来评价小鼠的学习记忆保持能力。最 终使用Morris水迷宫将有效地评价各组小鼠的学习能力、记忆能力、学习记忆保持能力。

2.7检测海马APP相关蛋白及炎症介质

Morris水迷宫实验结束后，抓取各组实验小鼠，眼科镊子快速摘除各组实验小鼠 眼球，获得各组实验小鼠混合血，将各组实验小鼠血液滴入离心管内，静置1h，使用离心机 3000rpm/min离心20min，将各组实验小鼠血清转移到EP小管内，检测各组实验小鼠血清APP 相关蛋白，余下的血清保存于-80℃冰箱备用。另外，迅速在冰上取材各组实验小鼠脑组织， 去除小脑组织和脑干，取材各组实验小鼠脑组织海马，匀浆，4℃冰箱静置匀浆液1h。离心机 3000rpm/min离心20min，取上清液，分装，检测各组实验小鼠海马样品蛋白含量，余下样品 保存于-80℃冰箱备用。严格按照酶联免疫试剂盒的说明书进行操作，采用6100型RT-雷杜 酶标仪进行测定450nm的波长下的吸光度值(OD)，根据标准曲线的方程及其各孔的吸光度 值(OD)计算出样品各组实验小鼠脑组织海马APP相关蛋白及炎症介质的含量。

2.8测定小鼠脑组织BBB通透性

各组实验小鼠脑组织BBB通透性用脑组织伊文氏蓝(EB)渗出量来表示，以EB浓度 为横坐标，吸光度值(A)为纵坐标，求出各组实验小鼠脑组织EB的标准曲线方程。Morris水 迷宫实验结束后，各组实验小鼠尾静脉注射2％EB，10％水合氯醛麻醉各组小鼠，针头扎入 各组实验小鼠左心室灌注生理盐水，剪开各组实验小鼠右心耳，对各组实验小鼠灌注生理 盐水约70mL，超迅速解剖，取脑组织，记录各组实验小鼠脑组织重量为脑组织湿重，将各组 实验小鼠脑组织浸泡于甲酰胺溶液，45℃避光孵育72h，匀浆，离心机3000rpm/min离心 10min，使用RT-雷杜酶标仪，630nm处测定各组实验小鼠脑组织上清液吸光度值(A)。根据EB 标准曲线求出EB含量，EB含量用EB浓度(μg/mL)或EB浓度/脑组织湿重(μg/g)来表示。

2.9观察海马CA1区超微结构

Morris水迷宫实验结束后，各组实验小鼠采取10％水合氯醛腹腔注射进行麻醉， 各组实验小鼠麻醉好后，固定、开胸，暴露各组实验小鼠心脏，使用输液器的针头直接刺入 各组实验小鼠左心室心尖搏动最明显的部位，缓慢匀速点滴各组实验小鼠生理盐水100mL。 之后用2.5％戊二醛进行缓慢匀速灌注各组实验小鼠大约70mL，直到各组实验小鼠四肢及 其尾巴僵硬为止。将各组实验小鼠放到超净工作台上，取材各组实验小鼠脑组织，寻海 马，各组实验小鼠海马CA1区切成1～3mm3的小块，2.5％戊二醛预固定2h、固定、脱 水、包埋、切片、染，TECNAI G2型透射电子显微镜观察各组实验小鼠脑组织海马CA1区的 超微结构。

2.10测定抗氧化能力

Morris水迷宫实验测定结束后，使用10％水合氯醛麻醉各组实验小鼠，在冰上取 材各组实验小鼠全脑组织进行清洗后，取材各组实验小鼠海马，匀浆，静置1h，离心机 3000rpm/min离心20min，取各组实验小鼠海马上清液，进行分装，按照试剂盒说明书测定各 组实验小鼠脑组织海马SOD、GSH-PX含量，以此评价各组实验小鼠脑组织海马的抗氧化能 力。

2.11测定海马蛋白表达

Morris水迷宫实验结束后，使用10％水合氯醛麻醉各组实验小鼠，开胸、暴露各组 实验小鼠心脏、剪开各组实验小鼠右心耳，左心室缓慢匀速点滴各组实验小鼠生理盐水 100mL，改用4％多聚甲醛匀速灌注各组实验小鼠大约50mL，直到各组实验小鼠四肢及其尾 巴僵硬为止。各组实验小鼠心脏灌注好后，取材全脑组织，去除小脑组织和脑干，将各组实 验小鼠脑组织修整齐后，经过各组实验小鼠脑组织海马固定、脱水、透明、融化、切片、烘烤、 保存，采用免疫组织化学的方法测定各组实验小鼠脑组织海马RAGE、LRP1、Apo J、NF-κBp65 蛋白表达，采用HMIAS高清晰度彩医学图文分析系统进行分析，比较分析各组实验小鼠脑 组织海马RAGE、LRP1、Apo J、NF-κBp65蛋白的表达量。

2.12测定海马mRNA的表达

采用Real-time-PCR测定各组实验小鼠海马RAGE、LRP1、Apo J、NF-κBp65mRNA的表 达，需要将新鲜各组实验小鼠脑组织海马RNA，并反转录成cDNA，设计各组实验小鼠海马 RAGE、LRP1、Apo J、NF-κBp65mRNA的特异性引物，对各组实验小鼠海马样本加入特殊SYBR Green I荧光材料，设置各组实验小鼠海马RAGE、LRP1、Apo J、NF-κBp65mRNA的参数包括50 ℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃1min，40Cycles。通过Real-time-PCR进行实时监测SYBR Green I荧光信号强弱，各组实验小鼠海马RAGE、LRP1、Apo J、NF-κBp65mRNA均采用2-ΔΔCt法 计算，使用Real-time-PCR分析所有数据并计算各组实验小鼠海马RAGE、LRP1、Apo J、NF-κ Bp65mRNA含量，且最终获得各组实验小鼠海马RAGE、LRP1、Apo J、NF-κBp65mRNA表达量。

2.13测定脏器指数

Morris水迷宫实验测试结束后，断头处死各组实验小鼠，在超净工作台上解剖各 组实验小鼠，取材各组实验小鼠脾、胸腺、脑组织、心、肺、肾、肝等脏器，洗涤各组实验小鼠 脏器，吸干各组实验小鼠水分，称量各组实验小鼠脏器质量，计算各组实验小鼠的脏器指 数。脏器指数(mg/g)＝脏器质量(mg)/小鼠体重(g)

2.14测定小鼠体重

Morris水迷宫实验测试结束后，测定各组实验小鼠的体重，统计各组实验小鼠在 给药过程中0d、15d、35d、40d体重数据变化，并进行系统化、规范化统计分析，以此评价中药 组合物对各组实验小鼠的副作用。

2.15统计分析

采用SPSS19.0软件分析各组实验小鼠的实验数据，且实验数据采用x±s表示，多 组间比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

3结果

3.1中药组合物对阿尔茨海默病小鼠学习能力的影响

检测各组实验小鼠的潜伏期可以评价各组实验小鼠学习能力，随着各组实验小鼠 训练时间的延长，各组实验小鼠的潜伏期均表现出整体下降的趋势。统计分析测试第5d各 组实验小鼠的潜伏期，结果表明，与对照组小鼠比较，模型组小鼠潜伏期明显延长(P＜ 0.05)，差异有统计学意义，假手术组小鼠潜伏期改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意 义；与模型组比较，多奈哌齐组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组阿尔茨海默病 小鼠潜伏期明显缩短(P＜0.05)，差异有统计学意义，而中药组合物低剂量组阿尔茨海默病 小鼠潜伏期改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义。见表1、见图1。

表1中药组合物对阿尔茨海默病小鼠学习能力的影响(n＝8)

注：与对照组比较：*P＜0.05，