一种丝素蛋白与脱细胞基质的复合材料及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料及其制备方法。

背景技术：

2.脱细胞基质材料是在细胞外基质成分与结构的基础上，通过脱细胞工艺去除细胞而保留其生物活性成分的材料，是由多种生物活性成分构成高度协调的有机统一体，能够诱导并促进细胞的黏附、增殖、分化及组织形成，是机体组织修复的基础。脱细胞基质修复缺损促进组织再生机制是“内源性诱导再生”，所具备的三维多孔连通网络结构，为细胞迁移、长入、合成新生胶原提供物理微环境，促进组织修复。基于良好的修复能力，脱细胞组织材料作为一种新型的生物材料，在创伤修复、组织工程、整形美容等领域应用广泛，且有明显的效果。
3.作为一种天然生物材料，脱细胞基质材料也存在着一些缺点，主要表现在力学性能较差，降解时间较快等问题。解决这一问题的常见方法是将材料用交联剂交联，但也存在一些问题，如常用的交联剂戊二醛具备一定的细胞毒性。另外，交联后的脱细胞基质材料虽然强度增加，但韧性或弹性会明显下降。脱细胞基质材料也存在着尺寸受限的缺点。常见的脱细胞基质材料如脱细胞小肠黏膜下层还存在厚度偏小，难以作为三维细胞支架等问题。为了解决材料厚度偏小的问题，美国库克医疗（cook medical incorporated）采用真空压制法将多层脱细胞小肠黏膜基质材料叠加成型，这一方法会压缩材料，造成三维结构的破坏。专利cn103272278将多层脱细胞小肠黏膜基质材料物理重叠后后冻干，虽然不破坏空间结构，但仅靠物理重叠难以保证强度。专利cn105920669将多层脱细胞小肠黏膜基质或脱细胞膀胱粘膜层基底膜用过医用粘合剂和真空层压联合应用，同样存在孔隙压缩、三维结构破坏的问题。
4.丝素蛋白是近年来较为热门的一种天然生物材料，广泛应用于再生修复医学领域。丝素蛋白具有生物相容性好、力学强度高、降解时间可控等优点，这些性质正是常规的脱细胞基质材料所欠缺的，利用丝素蛋白与脱细胞基质材料复合能够得到改良型的脱细胞基质材料。

技术实现要素：

5.针对现有脱细胞基质材料的不足，本发明提供一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料及其制备方法。
6.本发明所采用的技术方案如下：一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料，该复合材料包含脱细胞基质材料和丝素蛋白，其中丝素蛋白占复合材料干重的质量分数为5%~50%；所述复合材料包含1~8层脱细胞基质材料，厚度为100~3000μm。
7.所述脱细胞基质材料为动物组织经过脱细胞工艺处理除去了会引起免疫反应的
细胞、dna、α-gal抗原等物质得到的；其中的动物组织为真皮、心包膜、小肠粘膜下层、膀胱基底膜或腹腔大网膜的一种；所述丝素蛋白为蚕丝经脱丝胶和再生处理后得到的可溶性丝素蛋白；丝素蛋白的分子量为10~150kda。
8.本发明进一步公开了丝素蛋白与脱细胞基质复合材料的制备方法包括以下步骤：（1）将脱细胞基质材料浸泡于丝素蛋白溶液中一定时间；（2）将步骤（1）所得充分吸收丝素蛋白溶液的脱细胞基质材料置于模具中单层平铺或叠加多层；（3）将步骤（2）所得单层平铺或叠加多层的材料密封后置于一定温度保持一定时间使其中的丝素蛋白凝胶化，材料初步成型；（4）将步骤（3）所得的初步成型的材料浸泡于含有交联剂的水溶液中一定时间交联定型；（5）将步骤（4）所得交联定型的材料用纯化水清洗后冷冻干燥。
9.所述脱细胞基质材料是由动物组织经过脱细胞处理得到的。
10.所述动物组织为真皮、心包膜、小肠粘膜下层、膀胱基底膜或腹腔大网膜的一种。
11.所述动物组织来源于猪、牛或羊。
12.所述丝素蛋白为蚕丝经脱丝胶和再生处理后得到的可溶性丝素蛋白。
13.所述蚕丝来源于桑蚕丝或柞蚕丝。
14.所述丝素蛋白的分子量为10~150kda，优选地，为30~100kda。
15.所述步骤（1）中丝素蛋白溶液的浓度为10~150mg/ml，优选地，为30~100mg/ml。
16.所述步骤（1）中丝素蛋白溶液的ph为3.0~6.0，优选地，为4.0~5.0。
17.所述步骤（1）中浸泡时间为10~60min。
18.所述步骤（2）中充分吸收丝素蛋白溶液的脱细胞基质材料的叠加层数为2~8层。
19.所述步骤（3）中温度为30~37℃，时间为2~48h。
20.所述步骤（4）中的交联剂为1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）。
21.所述步骤（4）中交联剂的浓度为1~10mg/ml。
22.所述步骤（4）中的交联时间为10~120min。
23.本发明进一步公开了丝素蛋白与脱细胞基质复合材料在用于非目的的组织修复再生方面的应用，实验结果显示：丝素蛋白与脱细胞基质复合材料对于大鼠腹壁缺损有良好的修复效果，且无明显的不良反应。
24.本发明的主要机理在于：将脱细胞基质浸泡于弱酸性的丝素蛋白溶液中，脱细胞基质会发生一定程度的溶胀，其三维网络的整体结构基本不变但孔隙增大，丝素蛋白的分子链容易进入和穿过脱细胞基质的网络孔隙中形成半互穿网络结构。另一方面，弱酸性的环境有助于丝素蛋白的凝胶化。
25.吸收了丝素蛋白溶液充分溶胀的脱细胞基质材料由于水的内聚力能够通过叠加暂时粘合成多层的结构。将该多层脱细胞基质密封以阻止水分蒸发，置于较高于室温的温度下一定时间诱导丝素蛋白结构由α-螺旋向β-折叠结构转变，微观上与脱细胞基质形成互穿网络结构，宏观上表现为凝胶化，将多层脱细胞基质融合为整体，初步成型。最后通过碳
二亚胺使材料部分化学交联，增强材料最终的稳定性，固定成型。
26.本发明公开的丝素蛋白与脱细胞基质复合材料及其制备方法对比现有技术相比所具有的积极效果在于：1、本发明所用与脱细胞基质复合的材料丝素蛋白为天然生物蛋白材料，具有良好的生物相容性、可降解性和生物活性，材料价廉易得，来源广泛。
27.2、本发明提供的丝素蛋白与脱细胞基质复合材料未经过机械或真空压制成型，极大程度地保留了细胞外基质原有的微观三维结构和组分，更接近于组织内细胞生长的的微环境，有利于受损组织的修复和再生。
28.3、本发明提供的丝素蛋白与脱细胞基质复合材料中丝素蛋白和脱细胞基质构成了互穿聚合物网络结构，存在物理交联和化学交联双重交联形式，增加材料抗张强度的同时不降低材料的断裂伸长率，达到强而韧的效果，实现材料综合力学性能的提升。
29.4、本发明提供的丝素蛋白与脱细胞基质复合材料相对单纯的脱细胞基质材料具有更强的抗降解能力，同时可通过调节化学交联的程度调控降解时间，适应不同组织修复的需要。
30.附图说明
31.图1为本发明实施例1所得样品的扫描电镜图片；图2为本发明实施例1所得样品和未经处理的脱细胞小肠粘膜下层材料的体外降解曲线；图3为l929细胞接种于本发明实施例4所得样品后培养21天内的生长曲线。
32.具体实施方式
33.下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
34.实施例1一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料：由脱细胞猪小肠黏膜下层材料和丝素蛋白构成，其中丝素蛋白占复合材料干重的质量分数为20%，复合材料包含单层脱细胞猪小肠黏膜下层，厚度为100μm。
35.制备步骤如下：（1）取脱细胞处理后的猪小肠粘膜下层材料浸泡于所含分子量为约100kda的丝素蛋白浓度为50mg/ml、ph为4.5的丝素蛋白溶液中10min；（2）将步骤（1）所得充分溶胀吸收丝素蛋白溶液的脱细胞猪小肠黏膜下层材料平铺于模具中；（3）使用保鲜膜将步骤（2）所得材料密封，转移至37℃恒温箱中保温16h，使丝素蛋
白凝胶化；（4）将步骤（3）所得材料浸泡于含edc浓度为2mg/ml的溶液中60min；（5）将步骤（4）所得材料用纯化水清洗后冷冻干燥，得到一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料。
36.使用扫描电镜观察本实施例所得最终材料的微观结构，如图1所示，可以看出明显的互穿网络结构，丝素蛋白纤维穿过脱细胞基质的纤维孔隙形成复杂的三维结构。
37.实施例2一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料：由脱细胞猪真皮基质材料和丝素蛋白构成，其中丝素蛋白占复合材料干重的质量分数为50%，复合材料包含5层脱细胞猪真皮基质，厚度为3000μm。
38.制备步骤如下：（1）取脱细胞处理后的猪真皮基质材料浸泡于所含分子量为约10kda的丝素蛋白浓度为150mg/ml、ph为6.0的丝素蛋白溶液中60min；（2）将步骤（1）所得充分溶胀吸收丝素蛋白溶液的脱细胞猪真皮基质材料平铺于模具中，在其上叠加其他充分溶胀吸收丝素蛋白溶液的脱细胞猪真皮基质材料至5层；（3）使用保鲜膜将步骤（2）所得材料密封，转移至30℃恒温箱中保温48h，使丝素蛋白凝胶化；（4）将步骤（3）所得材料浸泡于含edc浓度为1mg/ml的溶液中120min；（5）将步骤（4）所得材料用纯化水清洗后冷冻干燥，得到一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料。
39.实施例3一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料：由脱细胞牛心包基质材料和丝素蛋白构成，其中丝素蛋白占复合材料干重的质量分数为5%，复合材料包含单层脱细胞牛心包基质，厚度为2000μm。
40.制备步骤如下：（1）取脱细胞处理后的牛心包基质材料浸泡于所含分子量为约150kda的丝素蛋白浓度为10mg/ml、ph为3.0的丝素蛋白溶液中30min；（2）将步骤（1）所得充分溶胀吸收丝素蛋白溶液的脱细胞牛心包基质材料平铺于模具中；（3）使用保鲜膜将步骤（2）所得材料密封，转移至37℃恒温箱中保温2h，使丝素蛋白凝胶化；（4）将步骤（3）所得材料浸泡于含edc浓度为10mg/ml的溶液中10min；（5）将步骤（4）所得材料用纯化水清洗后冷冻干燥，得到一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料。
41.实施例4一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料：由脱细胞猪小肠黏膜下层材料和丝素蛋白构成，其中丝素蛋白占复合材料干重的质量分数为30%，复合材料包含8层脱细胞猪小肠黏膜下层，厚度为1200μm。
42.制备步骤如下：
（1）取脱细胞处理后的猪小肠粘膜下层材料浸泡于所含分子量为约50kda的丝素蛋白浓度为50mg/ml、ph为4.5的丝素蛋白溶液中30min；（2）将步骤（1）所得充分溶胀吸收丝素蛋白溶液的脱细胞猪小肠黏膜下层材料平铺于模具中，在其上叠加其他充分溶胀吸收丝素蛋白溶液的脱细胞猪小肠黏膜下层材料至8层；（3）使用保鲜膜将步骤（2）所得材料密封，转移至37℃恒温箱中保温16h，使丝素蛋白凝胶化；（4）将步骤（3）所得材料浸泡于含edc浓度为1mg/ml的溶液中60min；（5）将步骤（4）所得材料用纯化水清洗后冷冻干燥，得到一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料。
43.实施例5一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料：由脱细胞猪腹腔大网膜材料和丝素蛋白构成，其中丝素蛋白占复合材料干重的质量分数为40%，复合材料包含2层脱细胞猪腹腔大网膜，厚度为400μm。
44.制备步骤如下：（1）取脱细胞处理后的猪腹腔大网膜材料浸泡于所含分子量为约30kda的丝素蛋白浓度为100mg/ml、ph为4.0的丝素蛋白溶液中20min；（2）将步骤（1）所得充分溶胀吸收丝素蛋白溶液的脱细胞猪腹腔大网膜材料平铺于模具中，在其上叠加其他充分溶胀吸收丝素蛋白溶液的脱细胞猪腹腔大网膜材料至2层；（3）使用保鲜膜将步骤（2）所得材料密封，转移至33℃恒温箱中保温8h，使丝素蛋白凝胶化；（4）将步骤（3）所得材料浸泡于含edc浓度为5mg/ml的溶液中100min；（5）将步骤（4）所得材料用纯化水清洗后冷冻干燥，得到一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料。
45.实施例6一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料：由脱细胞猪膀胱基底膜材料和丝素蛋白构成，其中丝素蛋白占复合材料干重的质量分数为25%，复合材料包含6层脱细胞猪膀胱基底膜，厚度为800μm。
46.制备步骤如下：（1）取脱细胞处理后的猪膀胱基底膜材料浸泡于所含分子量为约50kda的丝素蛋白浓度为30mg/ml、ph为4.5的丝素蛋白溶液中50min；（2）将步骤（1）所得充分溶胀吸收丝素蛋白溶液的脱细胞膀胱基底膜材料平铺于模具中，在其上叠加其他充分溶胀吸收丝素蛋白溶液的脱细胞猪膀胱基底膜材料至6层；（3）使用保鲜膜将步骤（2）所得材料密封，转移至35℃恒温箱中保温36h，使丝素蛋白凝胶化；（4）将步骤（3）所得材料浸泡于含edc浓度为2mg/ml的溶液中20min；（5）将步骤（4）所得材料用纯化水清洗后冷冻干燥，得到一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料。
47.实施例7
力学性能试验：拉伸试验：使用万能材料试验机分别检测a组样品（实施例1）、b组样品（将脱细胞小肠粘膜下层材料按实施例1缺少步骤（4）的方法处理）、c组样品（将脱细胞小肠粘膜下层材料仅按实施例1中步骤（4）的方法处理）、d组样品（实施例4）和e组样品（未经处理的脱细胞小肠粘膜下层材料）的拉伸断裂强度和断裂伸长率。将各样品沿纵向裁剪成哑铃状，长度为6cm，最窄处宽度为8mm，浸泡于生理盐水中充分浸润后固定于万能材料试验机夹具上进行拉伸试验，设置拉伸速率为30mm/min，记录各样品断裂时的力和拉伸长度，计算拉伸断裂强度和断裂伸长率，结果如表1所示。可以看出，实施例1相对未经处理的脱细胞小肠粘膜下层材料，其拉伸断裂强度显著提高，同时断裂伸长率没有明显下降；b组样品仅用丝素蛋白复合形成物理交联的互穿网络结构，其拉伸断裂强度和断裂伸长率均有提高，但程度较小；c组样品仅用edc对脱细胞小肠粘膜下层材料进行化学交联，其拉伸断裂强度有较大程度提高，但断裂伸长率急剧降低，材料失去韧性。
48.表、各样品组拉伸断裂强度和断裂伸长率结果。
实验组a组b组c组d组e组拉伸断裂强度（n/cm）5.1
±
1.23.2
±
0.84.3
±
0.662.8
±
9.62.1
±
0.5断裂伸长率（%）43.3
±
4.353.1
±
7.111.8
±
2.742.5
±
4.545.7
±
5.2
49.剥离试验：取实施例4样品沿纵向裁剪成哑铃状，长度为6cm，最窄处宽度为8mm。浸泡于生理盐水中充分浸润后沿中间剥离出1cm后固定于万能材料试验机夹具上，以20mm/min的速率剥离。测得过程平均剥离力为3.9n/cm。
50.实施例8体外降解实验：使用i型胶原酶分别处理实施例1所得样品和未经处理的脱细胞小肠粘膜下层材料。将各样品裁剪成2
×
2cm的正方形，浸泡于含i型胶原酶10u/ml的磷酸盐缓冲液中，样品与酶溶液的比例为10：1（mg:ml），置于37℃恒温箱中，分别在2h、4h、6h、8h、10h、12h取出残留样品烘干称重，计算降解率，结果如图2所示。可以看出，实施例1样品相比未经处理的脱细胞小肠粘膜下层材料抗酶解能力明显增强。
51.实施例9细胞实验：将实施例4所得丝素蛋白与脱细胞基质复合材料裁剪为直径为8mm的圆片，辐照灭菌后置于48孔板中，加入含10%胎牛血清的dmem培养基400μl充分浸润复合材料。取l929细胞接种于装有材料的孔中，每孔接种细胞数量约2
×
105个，每2~3天更换一次培养基。在接种后的第1、3、7、14、21天取样用cck-8试剂盒检测活细胞的数量，结果如图3所示，活细胞的数量持续增长，表明复合材料能够有效地支持l929细胞的生长和增殖。
52.实施例10动物实验：以体重200g左右的sd大鼠构建腹壁缺损模型。麻醉后在腹部手术制造1cm
×
1cm的腹壁部分缺损，以实施例4所得丝素蛋白与脱细胞基质复合材料作为实验组，以真空压制法
制备的8层脱细胞猪小肠黏膜下层材料作为对照组，分别将上述材料裁剪至缺损相同面积大小进行修复。分别于术后2、4、8、16周随机取材进行大体及组织学观察。结果显示实验组和对照组均能达到良好的修复效果。同时观察到对照组材料在8周时基本降解，实验组材料降解时间更长，在8周时仍然可见部分材料。he染的结果显示在2周后均存在轻微的炎症反应，但在4周后明显缓解，8周后基本无炎症反应。masson染结果显示实验组和对照组在4周时修复区有胶原沉积，到8周时已形成大量排列规整的胶原纤维。总体来说，实验组对大鼠腹壁缺损的修复效果与对照组相近。

技术特征：

1.一种丝素蛋白与脱细胞基质的复合材料，其特征在于：该复合材料包含脱细胞基质材料和丝素蛋白，其中丝素蛋白占复合材料干重的质量分数为5%~50%；所述复合材料包含1~8层脱细胞基质材料，厚度为100~3000μm；所述脱细胞基质材料为动物组织经过脱细胞工艺处理除去了会引起免疫反应的细胞、dna、α-gal抗原物质得到的；其中的动物组织为真皮、心包膜、小肠粘膜下层、膀胱基底膜或腹腔大网膜的一种；所述丝素蛋白为蚕丝经脱丝胶和再生处理后得到的可溶性丝素蛋白；丝素蛋白的分子量为10~150kda；所述丝素蛋白与脱细胞基质复合材料的制备方法包括以下步骤：（1）将脱细胞基质材料浸泡于丝素蛋白溶液中，浸泡时间为10~60min；丝素蛋白溶液的浓度为10~150mg/ml；丝素蛋白溶液的ph为3.0~6.0；（2）将步骤（1）所得充分吸收丝素蛋白溶液的脱细胞基质材料置于模具中单层平铺或叠加多层；（3）将步骤（2）所得单层平铺或叠加多层的材料密封后置于温度为30~37℃，时间为2~48h；使其中的丝素蛋白凝胶化，材料初步成型；（4）将步骤（3）所得的初步成型的材料浸泡于含有交联剂的水溶液中；（5）将步骤（4）所得交联定型的材料用纯化水清洗后冷冻干燥。2.权利要求1所述丝素蛋白与脱细胞基质复合材料，其特征在于步骤（2）所述的充分吸收丝素蛋白溶液的脱细胞基质材料的叠加层数为2~8层；步骤（4）中所述交联剂为1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）；交联剂的浓度为1~10mg/ml；交联时间为10~120min；所述动物组织为小肠粘膜下层。3.权利要求1所述丝素蛋白与脱细胞基质复合材料，其特征在于所述动物组织的来源为猪、牛或羊。4.权利要求1所述丝素蛋白与脱细胞基质复合材料，其特征在于所述蚕丝为桑蚕丝或柞蚕丝。5.权利要求1所述丝素蛋白与脱细胞基质复合材料，其特征在于所述丝素蛋白的分子量为30~100kda。6.权利要求1所述丝素蛋白与脱细胞基质复合材料，其特征在于所述步骤（1）中丝素蛋白溶液的浓度为30~100mg/ml。7.权利要求1所述丝素蛋白与脱细胞基质复合材料，其特征在于所述步骤（1）中丝素蛋白溶液的的ph为4.0~5.0。8.权利要求1所述丝素蛋白与脱细胞基质复合材料在用于非目的的组织修复再生方面的应用。

技术总结

本发明提供一种丝素蛋白与脱细胞基质复合材料及其制备方法。其主要制备步骤是：（1）将脱细胞基质材料浸泡于丝素蛋白溶液中一定时间；（2）将浸泡后充分吸收丝素蛋白溶液的脱细胞基质材料置于模具中单层平铺或叠加多层；（3）将单层平铺或叠加多层后的材料密封置于一定温度保持一定时间使其中的丝素蛋白凝胶化，材料初步成型；（4）将初步定型的材料浸泡于含有交联剂的水溶液中一定时间交联定型；（5）将交联定型的材料用纯化水清洗后冷冻干燥。这一方法将丝素蛋白和脱细胞基质进行复合，得到的复合材料保留了原脱细胞基质的三维结构和组分，相对于常规的脱细胞基质材料，力学性能和抗降解性能得到明显提高，同时能做到降解时间和厚度的调控。和厚度的调控。