沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法

沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法

技术领域

本发明涉及双重实时荧光PCR同步检测性传播疾病沙眼衣原体(Chlamydia Trachomatis，CT)、淋病奈瑟菌(Neisseria Gonorrhoeae，NG)技术。

背景技术，

随着分子生物学技术的飞速发展，人们已经将实时荧光PCR技术(real-time fluorescence polymerase chain reaction)广泛应用于临床检验包括病毒、细菌等多种病原 微生物的检测，也包括多种病毒、细菌耐药性检测。实时荧光PCR(real-time fluorescence polymerase chain reaction)是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标 记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可对结果进行分析，计算待测样品的初始模 板量。目前临床用的PCR检测技术多数采用实时荧光PCR技术。实时荧光PCR技术具有以下 优点：(1)PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性；(2)仪器自动分析， 效率高、无后续处理；(3)独特的定量原理，即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于 定量，定量范围宽，无须稀释样品，结果重现性好；(4)采用dUTP-UNG酶的防污染系统，所 有试剂均是一次扩增，毋须开盖，不产生污染。

性病是全球流行最广泛的传染性疾病，它的概念已从过去经典的5种性病演变为包括艾 滋病在内的与性行为接触密切相关的20余种传染病，统称性传播疾病(sexually transmitted disease，STD)。性病临床传统的检测方法包括细菌涂片、细菌培养、酶联反应等，普遍存在 检出率低、周期长、特异性差的缺点，给临床诊断带来困难。近几年发展起来的荧光PCR技 术不仅解决了检出率低、周期长的问题，而且克服了常规PCR技术假阳性率高的缺陷。随着 人们思想的改变和性观念的转变，以及对性传播疾病(STD)有关知识的匮乏，加之管理上缺乏 相应法规，检测手段不先进，性健康教育和公共卫生宣传严重不足，致使STD发病率呈现逐 年上升之势，且多种STD病原体混合感染率高达28.8％。STD除了引起男、女泌尿生殖道的 感染，造成尿道狭窄、排尿困难，还可导致盆腔炎和菌血症(严重的病例)，引起关节炎、心 内膜炎、皮肤损害和不孕不育症。混合感染机理：当感染一种病原体时，生殖道粘膜受损， 使得其它病原体更易入侵。沙眼衣原体(CT)、解脲支原体(UU)和淋病奈瑟菌(NG)是 泌尿生殖系统性传播疾病(STD)的三个最常见病原体。UU在非淋菌性尿道炎中占40％-50％， CT占非淋菌性尿道炎40％。约有19％-40％的NG患者伴有CT感染。淋病伴混合感染时仅 用对淋病奈瑟菌有效地药物，则80％以上病人的尿道炎持续存在或好转后复发。

目前应用于沙眼衣原体、淋病奈瑟菌临床检测的方法：主要是检测NG感染常用的方法是 涂片革兰氏染，因为分泌物中含大量的杂菌而影响检测结果，在慢性感染病人中其检出阳 性率则更低；CT感染常用的方法是ELISA法，但该法与许多细菌如金葡球菌、A及B链球 菌有相同的抗原，易发生交叉反应，使其准确性不高，以上检测方法操作繁琐、费时费力、 灵敏度较低，重复性低。其次用于临床检测的PCR方法，多是单检荧光PCR或者常规PCR方 法。

发明内容

为了克服以上沙眼衣原体、淋病奈瑟菌临床检测技术的不足，本发明采用一种双重实时 荧光PCR技术同步检测沙眼衣原体、淋病奈瑟菌病原体。本发明分别针对沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因的特异性核苷酸序列设计两对 引物、两条不同荧光染料标记的探针，采用实时荧光PCR扩增的方法，利用探针在无特异性 PCR发生时，荧光信号不变，当有特异性PCR发生时，探针会在PCR过程中被切断而引起荧 光信号的增长。荧光信号伴随着PCR的过程进行，伴随PCR产物增长而增长，当荧光强度达 到设定的阈值时所需要的循环次数Ct值作为结果判断的依据，Ct值0或大于27：阴性；Ct 值小于27：阳性。沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法具有以下特点：①有 利于早期诊断。对于女性患者，可以说沙眼衣原体初感染时几乎见不到特异症状，但正是这 个原因，导致了不理会后有可能不孕的生育力损害，延误了。淋球菌感染若不及时， 可进入后尿道或宫颈，向上蔓延引起泌尿生殖道和附近器官的炎症。因此对淋球菌和沙眼衣 原体感染的早期诊断及时预防和甚为重要。②有利于无症状诊断。非淋菌性尿道炎中约 30％-40％病人症状不典型或根本无症状。约1/3左右的淋球菌尿道炎病人合并沙眼衣原体感 染，淋病治愈后又出现尿道炎症状，易误诊为慢性淋病或ppNG菌株感染。③诊断方便简单， 从样本取材到结果只需数小时即可完成。④减轻患者痛苦，一次取样即可同时诊断两种病原 体。⑤生产成本低，一份酶与反应液即可检测两种病原体。⑥指导临床用药。

本发明的双重实时荧光PCR方法包括以下步骤：

1、确定待检测的特异性基因--即扩增序列沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基 因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因；

2、根据沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基 因分别设计引物、探针，沙眼衣原体设计一对引物PCT，探针FCT，淋病奈瑟菌设计 一对引物PNG，探针FNG；其中探针FCT，PNG分别标记不同的荧光物质；两对引物设 计过程中，尽量将两对引物PCT、PNG的Tm值设置相近，在PCR扩增过程中，采用相 同的变性温度；

3、双重实时荧光PCR反应体系组成：5XPCR缓冲液，两对引物、两条探针，反应用Taq 酶、UNG酶，DNA模板。

双重实时荧光PCR扩增反应体系：

5xPCR缓冲液(mix)                    10μl

PCT(80pmol/μl)                     1μl

PNG(80pmol/μl)                     1μl

FCT(60pmol/μl)                     1μl

FNG(60pmol/μl)                     1μl

Taq酶(2U/μl)                       2μl

UNG酶(0.1U/μl)                     2μl

模板                                5μl

ddH₂O                              27μl

总反应体积：50μl

5XPCR缓冲液组成成分：

250mM Tris-HCl(pH8.0)、15mM MgCl₂、250mM KCl、3％的甲酰胺、1000uM dATP，1000uM dGTP，1000uM dCTP，1000uM dUTP，500uM dTTP。

4、阳性、阴性质控样品组成：阳性样品是经过基因工程克隆、纯化的位于T-vector上的 Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因的PCR扩增序列； 阴性质控样品包括阴性临床样品、ddH₂O；

5、反应条件：

PCR程序

1  37℃                           5min

2  93℃                           45s

3  55℃                           1min

4  Go to 2，10cycles

5  93℃                           30s

6  55℃                           45s

7  Go to 5 30cycles，

在第六步采集荧光。

8  end

6、检测：本发明采用双通道检测，检测用两种互不干扰检测波长。使用ABI实时荧光PCR 仪进行检测，检测采用两个不同波长(波长1，波长2)进行检测。

7、结果判断：波长1检测探针FCT标记的荧光染料度，Ct值0或大于27：沙眼衣原体 阴性，Ct值小于26：沙眼衣原体阳性，病人沙眼衣原体感染；波长2检测探针FNG 标记的荧光染料强度，Ct值0或大于27：淋病奈瑟菌阴性，Ct值小于26：淋病奈瑟 菌阳性，病人淋病奈瑟菌感染。如果沙眼衣原体、淋病奈瑟菌检测同时为阳性，则病 人合并感染沙眼衣原体、淋病奈瑟菌。

本发明扩增的沙眼衣原体基因序列、引物、探针如下所示：

扩增模板序列：(109bp)

 1AGCTTTTGCG GCGTCGTATC AAAGATATGG ACAAATCGTA

21TCTCGGGTTA ATGTTGCATG ATGCTTTATC AAATGACAAG

81CTTAGATCCG TTTCTCATAC GGTTTTCCT

特异性引物：

PCT1上游模板：5‘---TTTTGCGGCGTCGTATCAAAGAT----3’23bp

PCT2下游模板：5‘---GTTCGAATCTAGGCAAAGAGTATGC---3’25bp

FCT特异性探针：

5‘----CTCGGGTTAATGTTGCATGATGCTTTAT---3’27bp

针对淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因设计的特异性引物、探针：

特异性引物：

PNG1：5’--CTGAACCGCGTGCTTTTACTAA--3’22bp

PNG2：5’--ACTTCAGTTGTTGATCCGACAAAC--3’24bp

特异性探针：

FNG：5’--CGAGCA AGGCTTCAAAGTTTTCCTGATG--3’28bp

本发明扩增的淋病奈瑟菌基因序列、引物、探针如下所示：

扩增特异性模板(88bp)：

 1CTGAACCGCG TGCTTTTACT AATAGAGAAC GAGCAAGGCT

41TCAAAGTTTT CCTGATGATT TTGAGTTTGT CGGATCAACA

81ACTGAAGT

特异性引物：

PNG1：5’--CTG AAC CGC GTG CTT TTA CTA A--3’22bp

PNG2：5’--ACT TCA GTT GTT GAT CCG ACA AAC--3’24bp

特异性探针：

FNG：5’--CGA GCA AGG CTT CAA AGT TTT CCT GAT G--3’28bp

具体实施方式

实施例----沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测及其试剂盒

1、沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR诊断试剂盒组成

试剂盒由PCR缓冲液(mix)，两对引物PCT、PNG，两条探针FCT、FNG，Taq酶， UNG酶组成，包括沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶 转甲基酶基因两种阳性对照、阴性对照。

通过大量的基因保守序列分析，我们分别选择沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1 基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因保守序列设计两对引物、两条探针，其中探针分别 标记不同波长的荧光染料。两对引物、两条探针设计的Tm值接近，相差不到2℃，因此反应 程序可设置同样的参数。

针对沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因设计的特异性引物、探针：

特异性引物：

PCT1上游模板：5‘---TTTTGCGGCGTCGTATCAAAGAT----3’23bp

PCT2下游模板：5‘---GTTCGAATCTAGGCAAAGAGTATGC---3’25bp

FCT特异性探针：

5‘----CTCGGGTTAATGTTGCATGATGCTTTAT---3’27bp

针对淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因设计的特异性引物、探针：

特异性引物：

PNG1：5’--CTGAACCGCGTGCTTTTACTAA--3’22bp

PNG2：5’--ACTTCAGTTGTTGATCCGACAAAC--3’24bp

特异性探针：

FNG：5’--CGAGCAAGGCTTCAAAGTTTTCCTGATG--3’28bp

沙眼衣原体的Bour cryptic plasmid ORF1基因扩增序列为一段编码序列，全长109bp， 在基因组中是单拷贝序列；淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因扩增序列为一段编码序列，全 长89bp。

试剂盒的配置过程如下：

5xPCR缓冲液(mix)                        10μl

PCT(80pmol/μl)                         1μl

PNG(80pmol/μl)                         1μl

FCT(60pmol/μl)                         1μl

FNG(60pmol/μl)                         1μl

Taq酶(2U/μl)                           2μl

UNG酶(0.1U/μl)                         2μl

模板                                    5μl

ddH₂O                                  27μl

总反应体积：50μl

5XPCR缓冲液组成成分：

250mM Tris-HCl(pH8.0)、15mM MgCl₂、250mM KCl、3％的甲酰胺、1000uM dATP，1000uM dGTP，1000uM dCTP，1000uM dUTP，500uM dTTP。

DNA裂解液分为两部分：

DNA提取液体系

裂解液1：20％         PEG6000

         1M           NaCl

         1％          SiO₂

裂解液2：20mmol/L     NaOH

         10mmol/L     Tris-HCl(pH 8.0)

         0.1mmol/L    EDTA

         1％          Triton X-100

         1％          NP-40

阴性样品：非阳性菌株、ddH₂O；

阳性样品：阳性样品是经过基因工程克隆、纯化的位于T-vector上的Bour cryptic plasmid ORF1基因、淋病奈瑟菌的胞嘧啶转甲基酶基因的PCR扩增序列

2、使用沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR诊断试剂盒检测

(1)样品处理和模板提取

收集尿道分泌物、生殖道分泌物，根据收集样品的量，用100--500μl生理盐水处理， 取100μl生理盐水处理的上清液用于DNA提取。

DNA提取方法

1.将100ul待测样品血清置入一干净的1.5ml离心管，加入100ul裂解液1。

2.振荡5秒混匀，室温静置5min。

3.13000rpm，4℃离心10min，小心弃净上清。

4.向管中加入20ul裂解液2，振荡使沉淀完全悬浮。

5.100℃恒温处理10min。

6.13,000rpm，4℃离心10min。

7.小心转移上清至一干净的离心管中(小心不要带上沉淀)，以作为定量PCR模板备用。

(2)荧光PCR扩增

配制双重实时荧光PCR反应体系：

5xPCR缓冲液(mix)                  10μl

PCT(80pmol/μl)                   1μl

PNG(80pmol/μl)                   1μl

FCT(60pmol/μl)                   1μl

FNG(60pmol/μl)                   1μl

Taq酶(2U/μl)                     2μl

UNG酶(0.1U/μl)                   2μl

模板                              5μl

ddH₂O                            27μl

总反应体积：50μl

PCR程序

1  37℃                           5min

2  93℃                           45s

3  55℃                           1min

4  Go to 2，10cycles

5  93℃                           30s

6  55℃                           45s

7  Go to 5 30cycles，

在第六步采集荧光。

8  end

(3)检测：使用ABI实时荧光PCR仪进行检测，检测采用两个不同波长(波长1，波长2) 进行检测。结果判断：波长1检测探针FCT标记的荧光染料度，Ct值0或大于27：沙眼衣 原体阴性，Ct值小于26：沙眼衣原体阳性，病人沙眼衣原体感染；波长2检测探针FNG标 记的荧光染料强度，Ct值0或大于27：淋病奈瑟菌阴性，Ct值小于26：淋病奈瑟菌阳性， 病人淋病奈瑟菌感染。如果沙眼衣原体、淋病奈瑟菌检测同时为阳性，则病人合并感染沙眼 衣原体、淋病奈瑟菌。

用上述方法对125例临床性病待测样品进行检测，其中沙眼衣原体35例、淋病奈瑟菌 17例，合并感染2例，阳性率45.6％；准确率98％，远远高于淋病奈瑟菌、沙眼衣原体培养 法。本发明具有特异性好，灵敏度高，定量精确，快速简便，可重复性高，可对沙眼衣原体、 淋病奈瑟菌进行快速定性定量检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和ELISA(酶联免疫吸 附试验)诊断方法。此外，沙眼衣原体、淋病奈瑟菌双重实时荧光PCR检测方法降低了临床样 品PCR诊断的工作量和诊断的成本。

沙眼衣原体、淋病奈瑟菌扩增用基因序列、引物、探针

本发明扩增的沙眼衣原体基因序列、引物、探针如下所示：

扩增模板序列：(109bp)

 1AGCTTTTGCG GCGTCGTATC AAAGATATGG ACAAATCGTA

21TCTCGGGTTA ATGTTGCATG ATGCTTTATC AAATGACAAG

81CTTAGATCCG TTTCTCATAC GGTTTTCCT

特异性引物：

PCT1上游模板：5‘---TTTTGCGGCGTCGTATCAAAGAT---3‘23bp

PCT2下游模板：5‘---GTTCGAATCTAGGCAAAGAGTATGC---3‘25bp

FCT特异性探针：

5‘----CTCGGGTTAATGTTGCATGATGCTTTAT---3‘27bp

本发明扩增的淋病奈瑟菌基因序列、引物、探针如下所示：

扩增特异性模板(88bp)：

 1CTGAACCGCG TGCTTTTACT AATAGAGAAC GAGCAAGGCT

41TCAAAGTTTT CCTGATGATT TTGAGTTTGT CGGATCAACA

81ACTGAAGT

特异性引物：

PNG1：5’--CTGAACCGCGTGCTTTTACTAA--3’22bp

PNG2：5’--ACTTCAGTTGTTGATCCGACAAAC--3’24bp

特异性探针：

FNG：5’--CGAGCAAGGCTTCAAAGTTTTCCTGATG--3’28bp