具有针对登革病毒和其他黄病毒的抗病毒活性的化学化合物

技术领域

本发明涉及制药工业，特别是描述了使用包含两个在功能上不同的亚结构[C]-[A]的化学化合物来影响或抑制与病毒进入靶细胞以及子代病毒粒子装配有关的登革病毒病毒复制循环的不同事件。所述化学化合物可用于预防性和/或性由登革病毒的四种血清型以及由其他黄病毒引起的感染。

现有技术

黄病毒(flavivirus)属包括大约70种病毒，包括对动物和人中升高的发病率和死亡率负责的重要病原体，例如登革病毒、西尼罗病毒，蜱传脑炎病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒、圣·路易脑炎病毒和墨累山谷脑炎病毒。然而，对于黄病毒感染来说还没有可用的特异疗法，并且迄今仅批准了针对所述属中的三种病毒的用于人使用的疫苗。

在黄病毒中，登革病毒是世界上主要的健康问题之一，特别是在热带和亚热带地区。登革病毒被分为四种血清型：DEN1、DEN2、DEN3和DEN4，并且通过媒介，主要是埃及伊蚊(Aedes aegypti)这种蚊子，而传播给人。被登革病毒感染的患者可以是无症状的或显示出各种不同的临床症状，包括从难以鉴别的发热(UF)、登革热(DF)直至该疾病的更严重和偶而致命的形式，已知为登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)(Guha-Sapir，D.和Schimmer，B.(2005)Dengue fever：newparadigms for a changing epidemiology.Emerg.Themes.Epidemiol.2：1-10)。

尽管登革病对于公众健康的重要性，但目前还没有针对该疾病的可用的疫苗或抗病毒药物(Chaturvedi，U.C.，Shrivastava，R.和Nagar，R.(2005)Dengue vaccines：problems and prospects.Indian J Med Res.121：639-652)。也没有特异的；该疗法基于控制症状和适当地补偿脱水和出血的影响，同时机体产生针对该病毒的中和抗体。控制媒介是预防感染的唯一途径，然而，通常很少有效(Rico-Hesse，R.(2003)Microevolution and virulence of dengue viruses.Adv.Virus Res.59：315-341)。

开发针对登革病的疫苗的主要障碍是缺少对于DHF发病机制的更完全的了解和没有令人满意的动物模型。此外，被所述血清型之一感染不能赋予针对被其余三种血清型再感染的长期的保护性免疫力(SABIN，A.B.(1952)Research on dengue during World War II.Am J Trop.MedHyg.1：30-50)；更加糟的是，已将第二或第三的异源感染与DHF/DSS联系了起来(Halstead，S.B.，Nimmannitya，S.和Cohen，S.N.(1970)Observations related to pathogenesis of dengue hemorrhagic fever.IV.Relation of disease severity to antibody response and virus recovered.YaleJ Biol Med.42：311-328；Halstead，S.B.(1988)Pathogenesis of dengue：challenges to molecular biology.Science.239：476-481)。在DHF/DSS的发病机制中，称为抗体依赖性扩增(antibody-dependent amplification，ADA)的效应起着重要的作用(Mady，B.J.，Erbe，D.V.，Kurane，I.，Fanger，M.W.和Ennis，F.A.(1991)Antibody-dependent enhancement of denguevirus infection  mediated by bispecific antibodies against cell surfacemolecules other than Fc gamma receptors.J Immunol.147：3139-3144)。因此，有效的疫苗应当是四价的，并且能够诱导同时针对登革病毒的四种血清型的中和抗体保护性应答。

减毒的活病毒四价疫苗是最具希望的疫苗候选物(Chaturvedi，U.C.，Shrivastava，R.和Nagar，R.(2005)Dengue vaccines：problems andprospects.Indian J Med Res.121：639-652；Edelman，R.(2007)Denguevaccines approach the finish line.Clin Infect.Dis.45：56-60)。这些是通过将登革病毒的四种减毒的血清型组合为四价制剂而开发出来的；所述减毒的病毒通过下列方式来获得：在原代犬肾细胞中进行连续传代(Bhamarapravati，N.和Sutee，Y.(2000)Live attenuated tetravalentdengue vaccine.Vaccine.18：44-47)，或者经由将特定突变引入到感染性病毒cDNA克隆中的重组DNA技术(Durbin，A.P.，Karron，R.A.，Sun，W.，Vaughn，D.W.，Reynolds，M.J.，Perreault，J.R.，Thumar，B.，Men，R.，Lai，C.J.，Elkins，W.R.，Chanock，R.M.，Murphy，B.R.和Whitehead，S.S.(2001)Attenuation and immunogenicity in humans of a live dengue virus type-4vaccine candidate with a 30 nucleotide deletion in its 3′-untranslatedregion.Am J Trop.Med Hyg.65：405-413)，或者将编码结构蛋白(前膜蛋白(premembrane protein)和包膜蛋白)的基因插入到减毒的登革病毒株或黄热病毒的减毒疫苗株17D中(Guirakhoo，F.，Pugachev，K.，Arroyo，J.，Miller，C.，Zhang，Z.X.，Weltzin，R.，Georgakopoulos，K.，Catalan，J.，Ocran，S.，Draper，K.和Monath，T.P.(2002)Viremia andimmunogenicity in nonhuman primates of a tetravalent yellowfever-dengue chimeric vaccine：genetic reconstructions，dose adjustment，and antibody responses against wild-type dengue virus isolates.Virology.298：146-159)。目前处于临床试验(1期和2期)中的减毒的活病毒四价疫苗候选物经证明是安全的和具有免疫原性的(Edelman，R.，Wasserman，S.S.，Bodison，S.A.，Putnak，R.J.，Eckels，K.H.，Tang，D.，Kanesa-Thasan，N.，Vaughn，D.W.，Innis，B.L.和Sun，W.(2003)Phase Itrial of 16 formulations of a tetravalent live-attenuated dengue vaccine.Am J Trop.Med Hyg.69：48-60；Sabchareon，A.，Lang，J.，Chanthavanich，P.，Yoksan，S.，Forrat，R.，Attanath，P.，Sirivichayakul，C.，Pengsaa，K.，Pojjaroen-Anant，C.，Chambonneau，L.，Saluzzo，J.F.和Bhamarapravati，N.(2004)Safety and immunogenicity of a three dose regimen of twotetravalent live-attenuated dengue vaccines in five-to twelve-year-old Thaichildren.Pediatr.Infect.Dis.J.23：99-109；Sabchareon，A.，Lang，J.，Chanthavanich，P.，Yoksan，S.，Forrat，R.，Attanath，P.，Sirivichayakul，C.，Pengsaa，K.，Pojjaroen-Anant，C.，Chokejindachai，W.，Jagsudee，A.，Saluzzo，J.F.和Bhamarapravati，N.(2002)Safety and immunogenicity oftetravalent live-attenuated dengue vaccines in Thai adult volunteers：roleof serotype concentration，ratio，and multiple doses.Am J Trop.Med Hyg.66：264-272；Kanesa-Thasan，N.，Sun，W.，Kim-Ahn，G.，Van Albert，S.，Putnak，J.R.，King，A.，Raengsakulsrach，B.，Christ-Schmidt，H.，Gilson，K.，Zahradnik，J.M.，Vaughn，D.W.，Innis，B.L.，Saluzzo，J.F.和Hoke，C.H.，Jr.(2001)Safety and immunogenicity of attenuated dengue virusvaccines(Aventis Pasteur)in human  volunteers.Vaccine.19：3179-3188)，与两种嵌合的四价候选物(ChimericVax-DEN 2和rDEN4Δ30)的单价制剂一样(Guirakhoo，F.，Kitchener，S.，Morrison，D.，Forrat，R.，McCarthy，K.，Nichols，R.，Yoksan，S.，Duan，X.，Ermak，T.H.，Kanesa-Thasan，N.，Bedford，P.，Lang，J.，Quentin-Millet，M.J.和Monath，T.P.(2006)Live attenuated chimeric yellow fever dengue type 2(ChimeriVax-DEN2)vaccine：Phase I clinical trial for safety andimmunogenicity：effect of yellow fever pre-immunity in induction of crossneutralizing antibody responses to all 4 dengue serotypes.Hum.Vaccin.2：60-67；Durbin，A.P.，Whitehead，S.S.，McArthur，J.，Perreault，J.R.，Blaney，J.E.，Jr.，Thumar，B.，Murphy，B.R.和Karron，R.A.(2005)rDEN4delta30，a live attenuated dengue virus type 4 vaccine candidate，issafe，immunogenic，and highly infectious in healthy adult volunteers.JInfect.Dis.191：710-718)。通过使用不同的策略开发出了其他疫苗候选物，包括灭活病毒疫苗、蛋白质亚单位疫苗和DNA疫苗(Hombach，J.(2007)Vaccines against dengue：a review of current candidate vaccines atadvanced development stages.Rev Panam.Salud Pública.21：254-260)。这些候选者中的数种在动物模型中诱导保护性免疫应答(Eckels，K.H.和Putnak，R.(2003)Formalin-inactivated whole virus and recombinantsubunit flavivirus vaccines.Adv.Virus Res.61：395-418；Hermida，L.，Bernardo，L.，Martin，J.，Alvarez，M.，Prado，I.，Lopez，C.，Sierra，B.L.，Martinez，R.，Rodriguez，R.，Zulueta，A.，Perez，A.B.，Lazo，L.，Rosario，D.，Guillen，G.和Guzman，M.G.(2006)A recombinant fusion proteincontaining the domain III of the dengue-2 envelope protein isimmunogenic and protective in nonhuman primates.Vaccine.24：3165-3171；Raviprakash，K.，Apt，D.，Brinkman，A.，Skinner，C.，Yang，S.，Dawes，G.，Ewing，D.，Wu，S.J.，Bass，S.，Punnonen，J.和Porter，K.(2006)A chimeric tetravalent dengue DNA vaccine elicits neutralizingantibody to all four virus serotypes in rhesus macaques.Virology.353：166-173)。

减毒的活病毒疫苗是更有利的病毒疫苗，因为与非复制型疫苗不同，它诱导长期的抗体应答、需要较少次数的接种并且通常更便宜。然而，这些疫苗候选物的四价制剂的开发具有各种缺点，例如，达到每种血清型的合适的减毒水平以保证最小的反应原性和最大的免疫原性(Edelman，R.，Wasserman，S.S.，Bodison，S.A.，Putnak，R.J.，Eckels，K.H.，Tang，D.，Kanesa-Thasan，N.，Vaughn，D.W.，Innis，B.L.和Sun，W.(2003)Phase Itrial of 16 formulations of a tetravalent live-attenuated dengue vaccine.AmJ Trop.Med Hyg.69：48-60)；避免构成所述四价制剂的登革病毒的不同血清型之间的干扰(Raviprakash，K.，Apt，D.，Brinkman，A.，Skinner，C.，Yang，S.，Dawes，G.，Ewing，D.，Wu，S.J.，Bass，S.，Punnonen，J.和Porter，K.(2006)A chimeric tetravalent dengue DNA vaccine elicits neutralizingantibody to all four virus serotypes in rhesus macaques.Virology.353：166-173)以保证针对所有血清型的相似的保护水平，以及确认该疫苗在先前被其他黄病毒感染的个体中是安全的和具有免疫原性的。最近的研究表明，在具有先前的对于黄热病毒的免疫力的个体中用嵌合的单价候选物ChimericVax-DEN 2进行的免疫接种不产生干扰(Talarico，L.B.，Pujol，C.A.，Zibetti，R.G.，Faria，P.C.，Noseda，M.D.，Duarte，M.E.和Damonte，E.B.(2005) The antiviral activity of sulfated  polysaccharidesagainst dengue virus is dependent on virus serotype and host cell.AntiviralRes.66：103-110)。在开发减毒的活病毒疫苗中还存在有其他限制，因为不能排除在疫苗株和野生病毒之间出现重组从而造成具有不希望的特性的新病毒的可能性，或者出现毒力表型逆转的可能性。另一方面，这些疫苗通常对于免疫受损和被人免疫缺陷病毒感染的人是禁忌的(Edelman，R.(2007)Dengue vaccines approach the finish line.Clin Infect.Dis.45：56-60)。此外，所述四价制剂需要采用多剂量的免疫接种方案。

抗病毒疗法代表了用于登革病的好的备选方案，特别是当存在使得不可能在短期内获得有效疫苗的各种障碍时(如上所提及的)。将抑制剂对准用于阻碍病毒复制循环中的关键过程，例如病毒进入宿主细胞(Talarico，L.B.，Pujol，C.A.，Zibetti，R.G.，Faria，P.C.，Noseda，M.D.，Duarte，M.E.和Damonte，E.B.(2005)The antiviral activity of sulfatedpolysaccharides against dengue virus is dependent on virus serotype andhost cell.Antiviral Res.66：103-110；Ono，L.，Wollinger，W.，Rocco，I.M.，Coimbra，T.L.，Gorin，P.A.和Sierakowski，M.R.(2003)In vitro and in vivoantiviral properties of sulfated galactomannans against yellow fever virus(BeH111 strain)and dengue 1 virus(Hawaii strain).Antiviral Res.60：201-208；Pujol，C.A.，Estevez，J.M.，Carlucci，M.J.，Ciancia，M.，Cerezo，A.S.和Damonte，E.B.(2002)Novel DL-galactan hybrids from the redseaweed Gymnogongrus torulosus are potent inhibitors of herpes simplexvirus and dengue virus.Antivir.Chem Chemother. 13：83-89)、病毒多蛋白的加工(Chanprapaph，S.，Saparpakorn，P.，Sangma，C.，Niyomrattanakit，P..Hannongbua，S.，Angsuthanasombat，C.和Katzenmeier，G.(2005)Competitive inhibition of the dengue virus NS3 serine protease by syntheticpeptides representing polyprotein cleavage sites.Biochem Biophys ResCommun.330：1237-1246)、病毒基因组的复制(Migliaccio，G.，Tomassini，J.E.，Carrolll，S.S.，Tomei，L.，Altamura，S.，Bhat，B.，Bartholomew，L.，Bosserman，M.R.，Ceccacci，A.，Colwell，L.F.，Cortese，R.，De Francesco，R.，Eldrup，A.B.，Getty，K.L.，Hou，X.S.，LaFemina，R.L.，Ludmerer，S.W.，MacCoss，M.，McMasters，D.R.，Stahlhut，M.W.，Olsen，D.B.，Hazuda，D.J.和Flores，O.A.(2003)Characterization of resistance to non-obligatechain-terminating ribonucleoside analogs that inhibit hepatitis C virusreplication in vitro.J Biol Chem.278：49164-49170)以及病毒颗粒的装配(Courageot，M.P.，Frenkiel，M.P.，Dos Santos，C.D.，Deubel，V.和Despres，P.(2000)Alpha-glucosidase inhibitors reduce dengue virus production byaffecting the initial steps of virion morphogenis in the endoplasmicreticulum.J Virol.74：564-572；Whitby，K.，Pierson，T.C.，Geiss，B.，Lane,K.，Engle，M.，Zhou，Y.，Doms，R.W.和Diamond，M.S.(2005)Castanospermine，a potent inhibitor of dengue virus infection in vitro andin vivo.J Virol.79：8698-8706)。通过使用不同的方法鉴定出了这些抑制剂，包括高通量筛选(Novartis Institute for Tropical Diseases.(2005)Newtechnologies for high-throughput screening and lead discovery of anti-viralcompounds.Dengue Digest.2：1-2)、基于病毒蛋白质的晶体学结构的合理设计(Hrobowski，Y.M.，Garry，R.F.和Michael，S.F.(2005)Peptideinhibitors of dengue  virus and West Nile virus infectivity.Virol.J.2：49-59)、大的化学化合物文库的虚拟筛选(Yang，J.M.，Chen，Y.F.，Tu，Y.Y.，Yen，K.R.和Yang，Y.L.(2007)Combinatorial computational approaches toidentify tetracycline derivatives as flavivirus inhibitors.PLoS.ONE.2：428-437)、已知用于其他黄病毒的抑制剂的评价(Migliaccio，G.，Tomassini，J.E.，Carroll，S.S.，Tomei，L.，Altamura，S.，Bhat，B.，Bartholomew，L.，Bosserman，M.R.，Ceccacci，A.，Colwell，L.F.，Cortese，R.，De Francesco，R.，Eldrup，A.B.，Getty，K.L.，Hou，X.S.，LaFemina，R.L.，Ludmerer，S.W.，MacCoss，M.，McMasters，D.R.，Stahlhut，M.W.，Olsen，D.B.，Hazuda，D.J.和Flores，O.A.(2003)Characterization of resistance tonon-obligate chain-terminating ribonucleoside analogs that inhibit hepatitisC virus replication in vitro.J Biol Chem.278：49164-49170)、反义RNA疗法(Snapp，M.B.(1992)Occupational stress，social support，anddepression among black and white professional-managerial women.Women Health.18：41-79；Holden，K.L.，Stein，D.A.，Pierson，T.C.，Ahmed，A.A.，Clyde，K.，Iversen，P.L.和Harris，E.(2006)Inhibition of dengue virustranslation and RNA synthesis by a morpholino oligomer targeted to the topof the terminal 3′stem-loop structure.Virology.344：439-452)、被动免疫接种(Goncalvez，A.P.，Men，R.，Wernly，C.，Purcell，R.H.和Lai，C.J.(2004)Chimpanzee Fab fragments and a derived humanized immunoglobulin G1antibody that effciently cross-neutralize dengue type 1 and type 2 viruses.JVirol.78：12910-12918)和其他。在用作靶标的病毒蛋白质之中包括：结构蛋白例如包膜蛋白，以及具有蛋白酶/解旋酶活性和聚合酶/甲基转移酶活性的非结构蛋白(分别称为NS3和NS5)。

阻碍病毒进入细胞导致非常有吸引力的抗病毒策略，因为它阻止了感染的起始。在登革病毒的情况下，攻击的靶标是包膜蛋白(E蛋白)。该蛋白质是登革病毒的主要决定性抗原并且负责在病毒进入细胞的过程中所要求的必要事件，包括细胞受体的识别(Crill，W.D.和Roehrig，J.T.(2001)Monoclonal antibodies that bind to domain III of dengue virus Eglycoprotein are the most effcient blockers of virus adsorption to Vero cells.J Virol.75：7769-7773)以及病毒膜与宿主膜之间的融合(Allison，S.L.，Schalich，J.，Stiasny，K.，Mandl，C.W.和Heinz，F.X.(2001)Mutationalevidence for an internal fusion peptide in flavivirus envelope protein E.JVirol.75：4268-4275)。

E蛋白属于II类病毒融合蛋白组并且由三个结构域I、II和III形成。结构域I包含氨基末端区域(登革病毒DEN2中的残基1-51、133-192和281-295)，但是在三维结构中位于单体的中心。结构域II或二聚化结构域(残基52-132和193-280)由两个从结构域I发散出的延伸组成，其中每个延伸在其端头包含环，在一种情况下是融合肽(环“cd”，残基100-108)，和在另一种情况下是环“ij”(残基243-248)；存在于所述结构域中的其他令人感兴趣的区域称为“铰链”，并且位于结构域I-II的界面处。结构域III(残基296-395)具有类似于免疫球蛋白的折叠，并且包含用于细胞受体的结合位点。“茎”区(残基396-447)将结构域III连接至跨膜结构域。

在未成熟病毒粒子(在胞吐之前病毒的细胞内形式)中，E蛋白与前膜蛋白 (preM蛋白)相缔合从而形成异二聚体(Zhang，Y.，Corver，J.，Chipman，P.R.，Zhang，W.，Pletnev，S.V.，Sedlak，D.，Baker，T.S.，Strauss，J.H.，Kuhn，R.J.和Rossmann，M.G.(2003)Structures of immatureflavivirus particles.EMBO J.22：2604-2613)。preM蛋白的相当大的部分覆盖E蛋白，从而当通过高尔基复合体外侧网络(TGN)的酸性环境时保护其免于成熟前融合(Guirakhoo，F.，Bolin，R.A.和Roehrig，J.T.(1992)The Murray Valley encephalitis virus prM protein confers acid resistance tovirus particles and alters the expression of epitopes within the R2 domain ofE glycoprotein.Virology.191：921-931)。细胞的蛋白酶对于PreM蛋白的加工使得preM-E相互作用不稳定，并且促进在感染性成熟病毒粒子中存在的E蛋白二聚体的形成；紧接着，成熟病毒粒子被释放到细胞外介质中。在病毒通过由受体介导的胞吞作用而进入细胞后，病毒暴露于内体的酸性pH下，这引起E蛋白二聚体的可逆解离，其不可逆地转变为三聚体(Allison，S.L.，Schalich，J.，Stiasny，K.，Mandl，C.W.，Kunz，C.和Heinz，F.X.(1995)Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitisvirus envelope proteins induced by an acidic pH.J Virol.69：695-700)。用E蛋白进行实验的从二聚体到三聚体的转变与融合过程紧密相关。

登革病毒进入细胞的抑制剂的开发可以基于下列策略中的至少一种：干扰E蛋白和细胞受体之间的相互作用，或者抑制病毒膜与内体膜的融合过程。

第一种抗病毒策略很少被采用，因为缺乏关于登革病毒结合至细胞的机制的知识，尽管近年来一些分子被提出为在某些细胞类型中的可能的受体(Chen，Y.C.，Wang，S.Y.和King，C.C.(1999)Bacteriallipopolysaccharide inhibits dengue virus infection of primary humanmonocytes/macrophages by blockade of virus entry via a CD14-dependentmechanism.J Virol.73：2650-2657；Tassaneetrithep，B.，Burgess，T.H.，Granelli-Piperno，A.，Trumpfheller，C.，Finke，J.，Sun，W.，Eller，M.A.，Pattanapanyasat，K.，Sarasombath，S.，Birx，D.L.，Steinman，R.M.，Schlesinger，S.和Marovich，M.A.(2003)DC-SIGN(CD209)mediatesdengue virus infection of human dendritic cells.J Exp Med.197：823-829；Hilgard，P.和Stockert，R.(2000)Heparan sulfate proteoglycans initiatedengue virus infection of hepatocytes.Hepatology.32：1069-1077)。这些分子之一是硫酸乙酰肝素(HS)(Chen，Y.，Maguire，T.，Hileman，R.E.，Fromm，J.R.，Esko，J.D.，Linhardt，R.J.和Marks，R.M.(1997)Denguevirus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparansulfate. Nat Med. 3：866-871)，它的发现使得能够鉴定出在体外干扰病毒对细胞的识别的类似化合物(Talarico，L.B.，Pujol，C.A.，Zibetti，R.G.，Faria，P.C.，Noseda，M.D.，Duarte，M.E.和Damonte，E.B.(2005)Theantiviral activity of sulfated polysaccharides against dengue virus isdependent on virus serotype and host cell.Antiviral Res.66：103-110；Pujo，C.A.，Estevez，J.M.，Carlucci，M.J.，Ciancia，M.，Cerezo，A.S.和Damonte，E.B.(2002)Novel DL-galactan hybrids from the red seaweedGymnogongrus torulosus are potent inhibitors of herpes simplex virus anddengue virus.Antivir. Chem Chemother.13：83-89；Ono，L.，Wollinger，W.，Rocco，I.M.，Coimbra，T.L.，Gorin，P.A.和Sierakowski，M.R.(2003)In vitroand in vivo antiviral properties  of sulfated galactomannans against yellowfever virus(BeH111 strain)and dengue 1 virsu(Hawaii strain).AntiviralRes.60：201-208；Shigeta，S.，Mori，S.，Kodama，E.，Kodama，J.，Takahashi，K.和Yamase，T.(2003)Broad spectrum anti-RNA virus activities oftitanium and vanadium substituted polyoxotungstates.Antiviral Res.58：265-271)。最近表明，HS的多硫酸化模拟物之一(PI-88)在用登革病毒感染的小鼠中诱导保护性效应。然而，HS的模拟物作为抗病毒剂的体内应用大大受到限制，这是由于其抗凝活性，也由于因其与血浆蛋白质结合所导致的低的生物利用率(Lee，E.，Pavy，M.，Young，N.，Freeman，C.和Lobigs，M.(2006)Antiviral effect of the heparan sulfate mimetic，PI-88，against dengue and encephalitic flaviviruses.Antiviral Res.69：31-38)。

由于测定了在融合发生之前(Modis，Y.，Ogata，S.，Clements，D.和Harrison，S.C.(2003)A ligand-binding pocket in the dengue virus envelopeglycoprotein.Proc.Natl Acad.Sci U.S.A.100：6986-6991；Zhang，Y.，Zhang，W.，Ogata，S.，Clements，D.，Strauss，J.H.，Baker，T.S.，Kuhn，R.J.和Rossmann，M.G.(2004)Conformational changes of the flavivirus Eglycoprotein.Structure.12：1607-1618)和之后(Modis，Y.，Ogata，S.，Clements，D.和Harrison，S.C.(2004)Structure of the dengue virusenvelope protein after membrane fusio.Nature.427：313-319)登革病毒E蛋白的晶体学结构，第二种抗病毒方法在近些年期间有相当大的进展。来自其他黄病毒的结构信息对于开发融合抑制剂也具有有益的贡献(Rey，F.A.，Heinz，F.X.，Mandl，C.，Kunz，C.和Harrison，S.C.(1995)Theenvelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution.Nature.375：291-298；Bressanelli，S.，Stiasny，K.，Allison，S.L.，Stura，E.A.，Duquerroy，S.，Lescar，J.，Heinz，F.X.和Rey，F.A.(2004)Structure of aflavivirus envelope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusionconformation.EMBO J.23：728-738)。

Modis等人测定了在去污剂β-辛基葡糖苷(BOG)存在和不存在下，登革病毒DEN2的E蛋白二聚体的可溶性片段(残基1-394)的结构(Modis，Y.；Ogata，S.；Clements，D.；Harrison，S.C.(2003)Aligand-binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein.Proc.NatlAcad.Sci U.S.A.100：6986-6991)。这两个结构之间的关键差异在于β-发夹“kl”(残基268-280)的局部重排，这打开了安置BOG分子的疏水口袋。β-发夹“kl”被鉴定为重要的结构组件，其用于起始在酸性pH下构象的变化，所述构象变化导致融合后三聚体的形成。

在融合前在E蛋白中检测到的结构变化确证了由Rey等人所作的先前观察(Rey，F.A.；Heinz，F.X.；Mandl，C.；Kunz，C.；Harrison，S.C.(1995)The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 Aresolution.Nature.375：291-298)，他们首次提出结构域II的底部可以作为可能的铰链或关节起作用，它的活动可将结构域II的末端提升到病毒膜之上并使融合肽凸出。他们的假设基于蜱传脑炎病毒E蛋白的可溶性片段的晶体学结构的分析，以及影响毒力和融合pH阈值的在各种黄病毒的结构域I-II界面的残基处的突变。E蛋白-BOG复合物的结构揭示了，所述突变主要相应于其侧链形成疏水口袋的残基(Modis，Y.；Ogata，S.；Clements，D.；Harrison，S.C.(2003)A ligand-binding  pocket in the denguevirus envelope glycoprotein.Proc.Natl Acad.Sci U.S.A.100：6986-6991)。

Modis等人将β-发夹“kl”和与其相关联的口袋(其包含结构域I-II界面的残基(残基47-54、128-137和187-207))，以及位于β-发夹“kl”下面的疏水核心建议为用于开发针对登革病毒和包含II类包膜蛋白的其他病毒的性候选物的靶标(专利申请：Children’s Medical CenterCorporation Modis Y，Harrison S，Arnold B，WO/2005/002501，2003)。

最近，将在E二聚体中在结构域I-II界面处BOG分子进行结合的位点用作用于通过虚拟筛选来设计融合抑制剂的靶标(Yang，J.M.，Chen，Y.F.，Tu，Y.Y.，Yen，K.R.和Yang，Y.L.(2007)Combinatorial computationalapproaches to identify tetracycline derivatives as flavivirus inhibitors.PLoS.ONE.2：428-437)。鉴定了两种具有针对登革病毒的抑制活性的衍生自四环素的化合物(IC50值分别为67.1μM和55.6μM)。

Chinea等人描述了可以用于抑制由黄病毒引起的病毒感染的二聚体E蛋白的其他区域(专利申请：Centro de Ingeniería Genética yBiotecnología，WO/2007/059715，2005)。Chinea等人鉴定出了暴露在E蛋白的表面上和成熟病毒粒子的表面上的拓扑表位；根据E蛋白中序列保守性的计算机分析，所述拓扑表位在登革病毒的血清型之间是高度保守的。所述表位由25个残基组成，并且位于结构域II的末端。Chinea等人通过使用识别该保守表位的抗体的可变片段而设计出了中和分子。所开发出的中和分子能够同时结合两个至三个拷贝的在成熟病毒粒子表面上的所述表位。与识别该保守表位的中和抗体相比较，所述分子显示出对病毒粒子的结合亲和力增加以及强几个数量级的中和能力，并且此外还能够中和登革病毒的四种血清型和其他黄病毒。令人感兴趣的结果是，所述分子的抗病毒活性不依赖于二价，而是依赖于所述分子与该保守表位的结合，这干扰了E蛋白的生物学功能。因此，位于结构域II末端的表位可以用于设计抑制融合的小分子。

由Modis等人对融合后三聚体E蛋白的可溶性胞外域的结构的解析揭示了相对于融合前二聚体形式而言的显著差异(Rey，F.A.，Heinz，F.X.，Mandl，C.，Kunz，C.和Harrison，S.C.(1995)The envelope glycoproteinfrom tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution.Nature.375：291-298)。在二聚体中，单体水平地且反平行地排布，而在三聚体中，它们是垂直取向的并且每个亚基与其邻居处于平行状态。在三聚体蛋白质中观察到，每个单体的胞外域自我折叠，从而将C-末端区域导向融合肽，这达到了结构域II和III的取向的改变。确认了，在三聚体形成中，在结构域I-II界面处出现构象变化，其允许结构域II相对于结构域I进行旋转(大约30°)。这与由其他研究者进行的先前观察是一致的(Bressanelli，S.，Stiasny，K.，Allison，S.L.，Stura，E.A.，Duquerroy，S.，Lescar，J.，Heinz，F.X.和Rey，F.A.(2004)Structure of a flavivirus envelopeglycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation.EMBOJ.23：728-738；Zhang，Y.，Zhang，W.，Ogata，S.，Clements，D.，Strauss，J.H.，Baker，T.S.，Kuhn，R.J.和Rossmann，M.G.(2004)Conformational changesof the flavivirus E glycoprotein.Structure.12：1607-1618)，尽管β-发夹“kl”没有采取在E蛋白-BOG复合物中所观察到的开放构象。在二聚体至三聚体的转变过程中结构域III经历了更显著的位移，它旋转了大约70°并且置于(残基395)距融合肽处。

融合肽暴露在每个单体的末端，他们聚集在一起从而在三聚体的端头形成可插入膜的芳香族锚，其完全暴露在分子表面上。该芳香族锚由三个在所有黄病毒中保守的疏水残基(Trp-101、Leu-107和Phe-108)形成。Modiy等人提出，融合环穿透入宿主膜的碳氢化合物层中大约并且可以使膜的结构不稳定。融合肽看起来保持了相同的构象，无论当其在融合前在E蛋白二聚体中隐藏于寡聚体界面中时，还是当其插入脂质膜中时，还是当其在二聚体的可逆解离过程中暴露于溶剂时(Rey，F.A.，Heinz，F.X.，Mandl，C.，Kunz，C.和Harrison，S.C.(1995)The envelopeglycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution.Nature.375：291-298)。形成三聚体的单体之间的接触区域包括来自结构域II、结构域I-III的残基，以及形成与毗邻单体的结构域II相互作用的单体“茎”区的残基。Modis等人提出，“茎”区可能占据了在三聚体的界面处产生并且从结构域II的底部延伸至结构域II的末端的通道。

通过对于融合后结构的分析，所述作者提出了在E蛋白中的具有药学意义的新位点(专利申请：Children’s Medical Center Corporation ModisY，Harrison S，Arnold B，WO/2005/002501，2003)。它们包括融合肽，“茎”区或其片段，例如残基396-429和413-447；在茎区的残基396-429的结合中所牵涉的E蛋白三聚体中的区域；形成通道(其中结合了“茎”区)的在三聚体界面处的结构域II的残基；连接结构域I-III的多肽链(残基294-301)；形成结构域I-III界面的残基(残基38-40、143-147、294-296和354-365)；在三聚化中所牵涉的结构域II的残基；和一般地，在导致形成融合后结构的“茎”区构象变化中所牵涉的所有残基(专利申请：Children’s Medical Center Corporation Modis Y，Harrison S，Arnold B，WO/2005/002501，2003)。

在这点上，基于“茎”区的序列而设计出了肽抑制剂，它们看起来干扰在三聚体构象中“茎”区和区域1-395之间的相互作用。这些肽针对登革病毒的四种血清型和西尼罗病毒起作用，并且在体外不显示细胞毒性(Hrobowski，Y.M.，Garry，R.F.和Michael，S.F.(2005)Peptideinhibitors of dengue virus and West Nile virus infectivity.J.Virol 2：49-59)。

Modis等人还提出了融合的可能机制和用于在各个时间点抑制该过程的不同策略，其包括设计这样的化合物，所述化合物能够阻止(a)β-发夹“kl”的移动；(b)β-发夹“kl”与位于该发夹下面的疏水口袋的相互作用；(c)结构域I和III的区域的残基的移动；和(d)通过与在三聚体界面处每个亚基的结构域II的残基相互作用而导致的融合后构象变化的完成(专利申请：Children’s Medical Center Corporation Modis Y，HarrisonS，Arnold B，WO/2005/002501，2003)。

发明描述

定义

术语“黄病毒”是指下列病毒中的任何一种：1型登革病毒(DEN1)、2型登革病毒(DEN2)、3型登革病毒(DEN3)、4型登革病毒(DEN4)、西尼罗病毒(WNV)、圣·路易脑炎病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒、库京病毒、贾萨努尔森林热病毒、蜱传脑炎病毒(TBEV)、墨累山谷脑炎病毒、兰加特病毒、羊跳跃病病毒、玻瓦散病毒和鄂木斯克出血热病毒，通常包括对于上面提及的病毒而言具有大于70％的基因组同一性的病毒。术语“黄病毒引起的疾病”是指由黄病毒感染所引起的任何疾病或病症。术语“调节”，当应用于生物学功能时，是指特定 化学化合物和/或实验条件调整(激活/刺激或抑制/平抑)特定生物学过程或活性的能力。术语“影响”，当应用于生物学功能时，是指引起对于特定生物学过程具有负面影响的改变或修饰的作用。

术语“登革病毒的E蛋白”是指属于登革病毒的任一种血清型的包膜糖蛋白。术语“融合前二聚体E蛋白”是指在病毒融合发生之前在成熟病毒粒子中登革病毒和其他黄病毒的包膜糖蛋白的构象。术语“融合后三聚体E蛋白”是指在病毒融合发生之后在成熟病毒粒子中登革病毒和其他黄病毒的包膜糖蛋白的构象。

术语“结构域”，当应用于多肽时，是指包含特定结构或介导特定功能的在所述多肽内的特殊区域。术语“结构域II”是指由登革病毒DEN2(S1株)的E蛋白中的残基52-132和193-280以及由其他黄病毒中所述蛋白质的相应残基所确定的结构基元。术语“亚结构”是指化学化合物的部分或片段。

术语“发夹ij”是指由登革病毒DEN2(S1株)的E蛋白的结构域II中的残基237LVTFKNPHAKKQDVVV252以及由其他黄病毒中相应于所述区域的残基所确定的结构基元。术语“环ij”是指由登革病毒DEN2(S1株)的E蛋白的结构域II中的残基242NPHAKKQ248以及由其他黄病毒中相应于所述区域的残基所确定的结构基元。术语“与环“ij”相关联的穴”或“与环“ij”相关联的沟”或“与环“ij”相关联的裂隙”是指包膜蛋白的区域，其包括登革病毒DEN2(S1株)的E蛋白的结构域II中的残基68TTTDSRC74、97VDRG100、103NGC105、111GGIVT115和245AKKQDV250以及其他黄病毒中相应于所述区域的残基。术语“融合肽”是指由登革病毒DEN2(S1株)的E蛋白的结构域II中的残基100GWGNGCGLF108以及由其他黄病毒中相应于所述区域的残基所确定的结构基元。

术语“结合”或“锚定”是指在生理学条件或计算机模拟条件下，由于静电相互作用和/或疏水相互作用和/或离子相互作用和/或氢键相互作用而导致的两个分子之间的缔合。术语“结合位点”是指蛋白质中的区域，在其中可以安置特定的化合物或配体分子。可以以不同的方式来描述和表征所述区域，例如，通过某些或所有使该区域成形的氨基酸，其中考虑了每个氨基酸残基的所有原子，或者仅形成碳骨架的原子，或者仅残基侧链的原子，包括或不包括α碳。

术语“化学化合物”或“配体”是指能够在特定的结合位点中结合蛋白质或与蛋白质相互作用的任何试剂、分子、复合物或其他实体。术语“受体-配体复合物”是指在生理学条件或计算机模拟条件下，登革病毒或其他黄病毒的E蛋白和任何化学化合物之间的缔合体。术语“受体”或“靶分子”或“靶标分子”是指这样的分子，例如登革病毒的E蛋白，其中希望结合特定的化学化合物，并且所述结合或相互作用可以调节所述蛋白质的活性。例如，靶分子可以是登革病毒的E蛋白，和结合位点可以是与环“ij”相关联的裂隙。

术语“锚”或“用于锚定的结构”是指这样的化学亚结构，其包含保证化学化合物结合至或锚定于靶分子中的结合位点的原子团。

术语“安置”，当应用于化学化合物或配体时，是指由所述化学化合物或配体所采取的特殊构象在几何学上适应于受体中的结合位点。

术语“虚拟筛选”是指化学化合物的计算机鉴定和设计，所述化学化合物具有结合和调节特定靶蛋白的功能的潜力。存在两种虚拟筛选的变化形式，已知为：基于受体的虚拟筛选，当受体的三维结构可得时(RBVS)；或者基于配体的虚拟筛选(LBVS)，当关于目的靶 分子的已知配体的结构信息可得时，尽管也常常是两种变化形式的组合。

术语“分子对接”是指，通过使用计算算法将配体以一定取向置于蛋白质的结合位点中，并评价所产生的受体-配体复合物。

术语“官能团”是指亚分子结构，或者说为分子内的特殊原子团，其特征在于元素的特殊连接和组成，这赋予包含它们的分子以反应性。

术语“药效团”是指包含于分子或配体中的基本特征(例如立体的和电子的)的全体，其保证了与特定靶分子的分子间相互作用并且赋予所述分子或配体以特殊的生物学活性。在现代计算化学中，采用“药效团模型”或“药效团的模型”来定义和归类一个或多个分子的基本特征，它们负责其生物学活性，并且它们被用于鉴定共享所示特征并因此预期具有生物学活性的其他分子或配体。药效团模型使得能够归类具有不同化学基团的不同配体，其中一个或多个化学基团相应于在药效团模型中所定义的一个或多个特性，并且其中所述化学基团位于药效团模型中关于每个所述特性的固定的距离处。药效团模型可以包含某些下述特性，例如，芳香族基团和/或疏水基团和/或接受氢键的基团和/或供给氢键的基团和/或阳离子和/或阴离子的存在。

术语“无极性基团”或“非极性基团”是指这样的化学基团，其中电子电荷的密度基本上是均匀的，这不允许其经由通过氢键和/或偶极-偶极型相互作用发生联系而与其他化学基团相互作用。非极性基团或无极性基团通过范德华型的弱相互作用彼此相互作用。相反地，术语“极性基团”是指这样的化学基团，其中电子分布是不均匀的，这允许其参与静电相互作用。

术语“烷基”是指衍生自具有线性(非支化)或支化链的脂族烃的基团，其中所述烷基基团由具有指定数目的碳原子组成(例如，“C1-C10烷基”表示可以由一个至十个碳原子形成的烷基)。烷基基团可以是饱和的、单或多不饱和的，并且可以包括二价和多价基团。饱和烃基团的实例包括但不限于诸如下列的基团：甲基、乙基、n-丙基、异丙基、2，3-二甲基丁基等等。不饱和烷基基团的实例包括但不限于，乙烯基、2-丙烯基、2-丁烯基、1，4-己二烯基、1，3-戊二烯基、乙炔基、3-丙炔基、3-丁炔基、2，4-庚二炔基等等。注意：术语“烷基”包括衍生自具有线性或支化链的脂族烃的二价基团。二价烷基的实例包括但不限于，-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH＝CHCH2-、-CH2C≡CCH2-、-CH2CH2CH(CH2CH2CH3)CH2-等等。术语“杂烷基”，单独地或者与其他术语相组合地，是指衍生自具有线性(非支化)或支化链的脂族烃的基团，其由至少一个碳原子和至少一个选自下列的杂原子构成：O、N、P、Si和S。杂烷基基团中存在的杂原子可以是相同的或不同的。杂原子可以位于杂烷基基团的任何内部位置处，或者位于从其开始杂烷基基团与该分子的其余部分相连接的位置处。杂烷基可以是饱和的、单或多不饱和的，并且可以包括二价和多价基团。杂烷基基团的例子包括但不限于，-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-CH2-CH＝N-OCH3、-CH＝CH-N(CH3)-CH3、-O-CH2-CH3等等。在杂烷基基团中，可以连续布置直至两个或三个杂原子，例如-CH2-NH-OCH3和CH2-O-Si(CH3)3。注意：术语“杂烷基”包括衍生自具有线性或支化链的脂族烃的二价基团，其由至少一个碳原子和至少一个杂原子组成。二价杂烷基的实例包含但不限于，-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。

根据前面所描述的“杂烷基”的定义，包括诸如下列的基团：-C(O)R’、-C(O) NR’、-NR’R”、-OR’、-SR’和/或-SO2R’。

在本发明中，数次提及“杂烷基”并接着提及前述的特定杂烷基基团。注意，术语杂烷基和下列中的任一个：C(O)R’、-C(O)NR’、-NR’R”、-OR’、-SR’和/或-SO2R’，既不是多余的也不是相互排斥的。在所有情况下，提及特定的杂烷基基团例如-NR’R”等等以便增加清晰性。

术语“环烷基”和“杂环烷基”，单独地或与其他术语相组合地，是指衍生自脂环烃的基团，其由一个或多个稠合的或共价连接的环组成，所述环可以是饱和的、单或多不饱和的，其中在“环烷基”的情况下，所述环仅由碳和氢原子组成，而在“杂环烷基”的情况下，所述环包括至少一个下列的杂原子：O、N和S。单环环烷基的实例包括但不限于，环戊基、环己基、1-环己烯基、2-环丁炔基、1，3-环己二烯等等。由数个连结的环所形成的环烷基的实例包括但不限于，环丁基环戊基等等。由数个稠合的环所形成的环烷基的实例包括具有两个或更多个由两个或更多个环所共有的碳原子的多环化合物，例如二环[4，2，0]辛基、二环[3，1，1]庚基、二环[4，4，0]癸基等等；和只具有一个由两个环所共有的碳原子的二环化合物，称为螺烷，例如螺[3，4]辛基。杂环烷基的实例包括但不限于，四氢呋喃基、四氢吡喃基、二氧杂环己烷基、基、吗啉基、哌嗪基、吡咯烷基、硫杂环戊烷基等等。注意：术语“环烷基”和“杂环烷基”包括衍生自脂环烃的二价基团，其由一个或多个稠合的或共价连接的环组成，所述环可以是饱和的、单或多不饱和的，其中在环烷基的情况下，所述环仅由碳和氢原子组成，而在杂环烷基的情况下，所述环包括至少一个杂原子。

术语“芳基”是指多不饱和的芳香烃基团，其由一个环(例如，苯基)或者数个稠合的(例如，萘基、蒽基等等)或共价连接的(例如，联苯基)环(优选地一至三个环)组成。术语“杂芳基”是指包含至少一个选自下列原子的杂原子的芳香烃基团(优选地具有一至三个环)：N、O和S(在涉及多个环的情况下在每个单环中)。“芳基”和“杂芳基”基团的实例包括但不限于，1-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、吡嗪基、2-唑基、2-噻唑基、3-呋喃基、2-噻吩基、4-吡啶基、2-苯并噻唑基、嘌呤基、5-吲哚基、6-异喹啉基等等。术语“芳基”和“杂芳基”包括，在第一种情况下，衍生自仅由碳和氢原子组成的芳香烃的二价基团；和衍生自由一个或多个环组成的多不饱和芳香烃的二价基团，所述环由碳和氢原子以及至少一个杂原子组成。

术语“芳烷基”是指由一个或多个与一个或多个烷基基团相连接的芳基基团所形成的基团(例如，苄基、苯基、苯乙烯等等)。术语“杂芳烷基”是指由一个或多个与一个或多个芳基基团相连接的杂烷基基团所形成的基团，和/或由一个或多个与一个或多个烷基基团相连接的杂芳基基团所形成的基团(例如，2，5-二甲基呋喃)，和/或由一个或多个与一个或多个杂烷基基团相连接的杂芳基基团所形成的基团。

术语“芳基环烷基”是指由一个或多个与一个或多个环烷基基团相连接的芳基基团所形成的基团(例如，苄基、苯基、枯烯、苯乙烯、乙烯基苯等等)。术语“杂芳基环烷基”是指由一个或多个与一个或多个环烷基基团相连接的杂芳基基团所形成的基团，和/或由一个或多个与一个或多个芳基基团相连接的杂环烷基基团所形成的基团，和/或由一个或多个与一个或多个杂芳基基团相连接的杂环烷基基团所形成的基团。

术语“烷基环烷基”是指由一个或多个被一个或多个烷基基团取代的环烷基环所形成的基团。术语“杂烷基环烷基”是指由一个或多个与一个或多个环烷基环相连接的杂 烷基基团所形成的基团，和/或由一个或多个被一个或多个烷基基团取代的杂环烷基基团所形成的基团，和/或由一个或多个被一个或多个杂烷基基团取代的杂环烷基基团所形成的基。

术语“氧代”是指与例如下列原子中的任一个双键键合的氧原子：碳、氮、硫和磷。术语“卤素”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。术语“杂原子”是指除了碳或氮以外的任何原子，通常为氧、氮、硫、磷、硼、氯、溴或碘。

术语“成员”，在衍生自脂环烃的基团和芳香族基团的情形下，是指形成环的全部原子(在杂环烷基和杂芳基的情况下，包括杂原子)。

术语“任选地”意味着，所描述的事件可以发生或不发生，并且发生的事件和不发生的事件均予以考虑。

术语“构成性(的)”是指形成任选地取代或未取代的烷基和/或杂烷基类型基团的主链的部分的原子或原子团(或者表示，非取代性的原子或原子团)。也指作为任选地取代或未取代的环烷基和/或杂环烷基和/或芳基和/或杂芳基类型基团的成员的原子或原子团。

在烷基、杂烷基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基基团的情况下，既考虑它们的取代的形式也考虑它们的未取代的形式；取代的形式可以具有一个或多个相同或不同的取代基。术语“取代基”是指在烃的主链中替代氢原子的原子或原子团。取代基包括但不限于，-OH、-NH2、-SH、-CN、-NO2、＝O、卤素、-OR’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-NR’R”、＝NR’、＝N-OR’、-C(O)NR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR’R”、-NR”C(O)OR’、-NR-C(NR’R”)＝NR”’、-S(O)R’、-S(O)2R’、-SR’、-S(O)2NR’R”、-NRSO2R’、-SiR’R”R”’、烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基，其中R’、R”和R”’独立地为氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的杂烷基基团、取代或未取代的环烷基基团、取代或未取代的杂环烷基基团、取代或未取代的芳基基团、取代或未取代的杂芳基基团。术语“取代的”，当应用于基团时，是指包含一个或多个前面所提及的取代基的基团。

术语“H键”或“氢键”是指基团A-H和存在于相同或不同分子中的原子或原子团B之间的键合。官能团A-H包含电正性氢原子，并且称为“H供给体”；A相应于氧、氮或氟。原子或基团B包含至少一个非离域自由电子对，并且称为“H接受体”；B相应于氧、氮或氟。氧原子可用是单键或双键键合的，并且氮可以是单键、双键或三键键合的。单个氢原子可以同时参与两个氢键的形成。例如，基团A-H可以与两个基团B同时形成氢键，这称为“分叉氢键”或“三中心氢键”。弱的供给氢键的基团包括基团A-H，其中A可以是碳原子(C-H)或其中A可以是硫原子(S-H)。只有三种类型的C-H足够酸性以形成氢键，并且这些相应于末端炔(RC≡CH)、某些卤代烷例如氯仿(CHCl3)和HCN。弱的接受氢键的基团包括基团B，其中B等于氯原子或硫原子。

术语“携带负电荷的基团”是指不与具有形式正电荷的原子或原子团相邻的具有形式负电荷的原子或原子团。

术语“携带正电荷的基团”是指不与具有形式负电荷的原子或原子团相邻的具有形式正电荷的原子或原子团。

发明详述

本发明的合理性

本发明描述了具有根据式“[C]-[A]”的两个在功能上不同的亚结构的化学化合物的用途，所述化合物影响或抑制与病毒进入靶细胞以及子代病毒粒子装配有关的登革病毒病毒复制循环的不同事件。所述化学化合物结合至登革病毒E蛋白表面的斑片，所述斑片位于结构域II的末端处并且在本发明中被定义为“与环“ij”相关联的沟”。本发明的化学化合物的特征在于具有根据下式的两个在功能上重要的亚结构：

[C]-[A]

其中，

[A]被定义为锚，并且相应于能够结合至与E蛋白的环“ij”相关联的沟的化学亚结构；

[C]被称为头，并且相应于与亚结构[A]共价连接的由1-30个原子组成的化学亚结构，[C]优选地是体积大的，具有极性或非极性特征，具有正或负净电荷，是脂族或芳香族的，[C]有助于本发明的化学化合物干扰或调节牵涉融合肽的分子间相互作用(其在病毒复制循环的各个不同阶段中是必需的)中的一种或多种分子间相互作用的能力，例如，a)牵涉preM-E异二聚体的形成的相互作用；b)对于未成熟病毒粒子的装配-释放而言必需的这些preM-E异二聚体之间的相互作用；c)由从preM-E异二聚体至E蛋白同二聚体的四级结构变化所导致的病毒粒子的成熟过程；d)对于成熟病毒粒子而言特征性的E蛋白二聚体的缔合和/或解离；和e)E蛋白向被感染的细胞的内体膜中的锚定，其触发膜融合过程。

本发明中所描述的亚结构“锚”与形成“与环“ij”相关联的沟”的残基中的至少三个相互作用，所述“与环“ij”相关联的沟”通过下列而成形：DEN2病毒(S1株)的E蛋白的区域68TTTDSRC74、97VDRG100、103NGC105、111GGIVT115和245AKKQDV250，以及其他黄病毒中相应于所述区域的残基。特别地，所述“与环“ij”相关联的裂隙”通过下列而成形：残基Thr-68、Thr-70、Ser-72和Thr-115的具有羟基基团的侧链；残基Asp-98、Ala-245、Lys-246、Gln-248和Val-250的主链羰基基团，和残基Asn-103、Gln-248和Asp-249的侧链羰基基团；残基Gln-248的主链氨基基团；脂族基团如残基Val-97、Ile-113的侧链，残基Thr-70的甲基基团，和包含在残基Lys-246和Lys-247的丁基铵侧链中的脂族部分；残基Arg-99的胍基基团，和残基Lys-246和Lys-247的铵基团。因此，所述穴被下列所覆盖：供给和/或接受氢键的原子团；具有正和负电荷的原子团；和具有疏水特征的原子团。该异质性有助于与配体分子的各种不同相互作用的发生，例如静电相互作用、疏水相互作用、离子相互作用和氢键键合。

本发明中所描述的亚结构“锚”优选地与下列残基的侧链的下述供给体和接受体原子中的任一个：Thr-68和/或Thr-70、Ser-72、Asn-103、Thr-115、Lys-246、Gln-248和Asp-249；或者与下列残基的主链的下述供给体和接受体原子中的任一个：Asp-98、Ala-245、Lys-246、Gln-248和Val-250，形成氢键键合。另一方面，所述亚结构“锚”可以建立疏水相互作用，例如与残基Val-97、Ile-113的脂族侧链，残基Thr-70的甲基基团，和包含在残基Lys-246和Lys-247的丁基铵侧链中的脂族部分；和建立静电相互作用，与残基Asp-98、Arg-99、Asp-249、Lys-246和Lys-247的侧链。

本发明中所描述的亚结构“头”与形成融合肽的下列残基中的至少一个相互作用：Gly-100、Trp-101、Gly-102和Phe-108。本发明的一个实施方案包括这样的亚结构“头”，其与在成熟病毒粒子中存在于E蛋白二聚体结构中的毗邻单体的下列残基中的至少一个 相互作用：Arg-2、Gly-5、Ile-6、Ser-7、Asn-8、His-27、Gly-28、Glu-44和Asp-154。在本发明的另一个实施方案中，包括这样的亚结构“头”，其与存在于环“ij”中的下述残基中的至少一个：Ala-245和His-244，或者与位于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Asp-98相互作用。

在本发明中，术语“对于锚定至与环“ij”相关联的裂隙而言关键的残基”是指属于“与环“ij”相关联的穴”的下列残基：Thr-70、Ser-72、Val-97、Asp-98、Arg-99、Asn-103、Ile-113、Thr-115、Ala-245、Lys-246、Lys-247、Gln-248、Asp-249和Val-250，其构成了与本发明中所描述的亚结构“锚”的基本相互作用点。

结合位点的描述

本发明中描述的化合物的亚结构“锚”安置于登革病毒的E蛋白的“与环“ij”相关联的沟”中。在相应于血清型2和3的登革病毒的二聚体E蛋白的晶体学结构中观察到所述沟(Modis，Y.，Ogata，S.，Clements，D.和Harrison，S.C.(2003)A ligand-binding pocket in the dengue virusenvelope glycoprotein.Proc.Natl Acad.Sci U.S.A.100：6986-6991；Zhang，Y.，Zhang，W.，Ogata，S.，Clements，D.，Strauss，J.H.，Baker，T.S.，Kuhn，R.J.和Rossmann，M.H.(2004)Conformational changes of the flavivirus Eglycoprotein.Structure.12：1607-1618；Modis，Y.，Ogata，S.，Clements，D.和Harrison，S.C.(2005)Variable surface epitopes in the crystal structure ofdengue virus type 3 envelope glycoprotein.J Virol.79：1223-31)。在这些结构中，环“ij”采取开放构象，从而成形为前面所提及的裂隙。发夹“ij”的开放构象似乎通过与二聚体的毗邻单体的结构域I的残基的有利相互作用而稳定化。所描述的沟是长长的、狭窄的、不深并且占大约320的面积。然而，在登革病毒血清型2的融合后三聚体E蛋白的晶体学结构中(Modis，Y.，Ogata，S.，Clements，D.和Harrison，S.C.(2004)Structureof the dengue virus envelope protein after membrane fusion.Nature.427：313-319)，在TBEV的E蛋白的二聚体和融合后三聚体结构中(Rey，F.A.，Heinz，F.X.，Mandl，C.，Kunz，C.和Harrison，S.C.(1992)The envelopeglycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution.Nature375：291-298；Bressanelli，S.，Stiasny，K.，Allison，S.L.，Stura，E.A.，Duquerroy，S.，Pescar，J.，Heinz，F.X.，Rey，F.A.(2004)Structure of aflavivirus envelope glycoprote in in its low-pH-induced membrane fusionconformation.EMBO J.23：728-738)，和在WNV的单体E蛋白的晶体学结构中(图1)(Kanai，R.，Kar，K.，Anthony，K.，Gould，L.H.，Ledizet，M.，Fikrig，E.，Marasco，W.A.，Koski，R.A.和Modis，Y.(2006)Crystal structureof west nile virus envelope glycoprotein reveals viral surface epitopes.JVirol.80：11000-11008；Nybakken，G.E.，Nelson，C.A.，Chen，B.R.，Diamond，M.S.和Fremont，D.H.(2006)Crystal structure of the West Nile virusenvelope glycoprotein.J Virol.80：11467-74)均未观察到环“ij”的所述开放构象。在这些结构中，环“ij”采取封闭构象，其从根本上改变了该表面的这一区域的“形貌学”，从而使本发明中所描述的裂隙消失。然而，各种结构证据表明，这是一个柔韧的区域，其可以根据其涉及之中的相互作用而采取不同的构象。在病毒DEN2的E蛋白的情况下，环“ij”在二聚体中采取开放构象，和在融合后三聚体中采取封闭构象，从而在第一种情况下参与与结构域I的残基的各种分子间相互作用，和在第二种情况下参与与 结构域II的残基的各种分子间相互作用。在未成熟病毒粒子中，preM-E异二聚体彼此相互作用，从而产生在病毒粒子表面上的突出。每个突出构成病毒粒子的不对称单元并且由三个preM-E异二聚体组成，在所述preM-E异二聚体中环“ij”与邻近异二聚体的残基相互作用。所述三个异二聚体不采取C3对称取向，因而异二聚体之间的分子间接触是不相同的。因此，环“ij”，在一种情况下，与相应于在该不对称单元中的E蛋白的其他单体的自身环“ij”的残基相互作用，和在其他情况下，与融合肽的残基相互作用。因此，环“ij”参与了在病毒复制循环的各个不同阶段(从病毒粒子的形态发生或装配，包膜成熟，直到膜融合过程)中重要的各种分子间相互作用。环“ij”的固有的柔韧性是明显的，通过在由病毒DEN2的E蛋白而解析得到的各种不同晶体学结构(二聚体和三聚体结构)中所观察到的结构差异(RMS)和/或在与该蛋白质的其他区域，特别是与结构域II的区域相比而言升高的温度因子方面，如DEN3的E蛋白的二聚体结构正是这种情况(图2和图3)。因此，该区域的柔韧性看起来对于安置于各种不同结构环境中以及在病毒复制循环的整个过程中E蛋白所参与的分子间相互作用而言是必需的。因此，本发明的重大的新颖性在于鉴定出了环“ij”的开放构象，所述环“ij”作为用于开发针对登革病毒和其他黄病毒的抗病毒分子的靶区域，其中所述分子干扰环“ij”的相互作用和/或结构变化，并且所述干扰抑制或调节病毒复制循环的一个或多个阶段。

其他黄病毒的E蛋白的晶体学结构显示出环“ij”的封闭构象，然而，在所述结构中形成环“ij”的残基的温度因子的值升高了(图3)，如在WNV的单体结构和TBEV的二聚体结构中所观察到的那样，这暗示环“ij”为一个柔韧的区域，其可以经历各种不同的构象状态并且也可以采取开放构象，如对于病毒DEN2和DEN3所观察的。

亚结构“锚”的描述

本发明中所描述的用于减弱或抑制登革病毒感染的化学化合物的特征在于具有根据下式的两个在功能上不同的亚结构：

[C]-[A]

其中，

锚[A]包含下述组件中的至少三种组件：a)供给氢键的组件(D_1-4)，和/或b)接受氢键的和/或携带负电荷的组件(A_1-2-，A₃)，和/或c)疏水组件(H_1-3)，和/或d)接受和/或供给氢键的组件(D/A)，和/或e)同时接受-供给氢键的组件(D+A)，并且所述组件(a)-(e)选自构成图5中所定义的3D药效团模型的组件。药效团模型的这些组件相应于标注为：D₁、D₂、D₃、D₄、A₁^-、A₂^-、A₃、D/A、H₁、H₂、H₃和D+A的原子或原子团，其中所述组件优选地以在距离矩阵(l)中所定义的原子间距离相分开。在本发明的某些实施方案中，允许相对于在原子间距离矩阵(l)中所指明的值而言±的原子间距离的偏差。在本发明的其他实施方案中，容许相对于在原子间距离矩阵(l)中所指明的值而言±的原子间距离的偏差。

药效团模型的组件D1、D2、D3、D4、A1-、A2-、A3、D/A、H1、H2、H3和D+A描述了本发明的亚结构“锚[A]”和存在于“与环“ij”相关联的裂隙”中的残基之间的潜在相互作用，包括氢键键合、疏水相互作用和静电相互作用。

组件D1、D2、D3和D4各自相应于供给氢键的原子或原子团。

组件A1-和A2-各自相应于接受氢键和/或携带负(或部分地负)净电荷的原子或 原子团。

组件A3相应于接受氢键的原子或原子团。

组件D/A可以相应于接受氢键的原子或原子团(在该情况下，在本发明中标示为“接受体条件下的D/A”)，或者组件D/A可以相应于供给氢键的原子或原子团(在该情况下，在本发明中标示为“供给体条件下的D/A”)，或者组件D/A可以相应于同时接受和供给氢键的原子或原子团(在该情况下，在本发明中标示为“接受体-供给体条件下的D/A”)。

组件D+A相应于同时接受和供给氢键的原子或原子团。

组件H1、H2、H3相应于非极性原子或原子团。

(I)关于在图5中所定义的药效团模型之中所包含的组件的原子间距离矩阵

在本发明中，亚结构“锚[A]”的组件D1、D2、D3、D4和D/A(在该情况下，相应于“供给体条件下的D/A”)各自相应于独立地选自下列基团中任一种的供给氢键的原子或原子团：-OH、-NH、-NH2、-NH3+、＝NH和-SH；它们可以相应于：a)下列基团中任一种的取代基：烷基和/或芳基和/或环烷基和/或芳烷基和/或芳基环烷基和/或烷基环烷基；b)下列基团中任一种的构成性基团和/或取代基：杂烷基和/或杂芳基和/或杂环烷基和/或杂芳烷基和/或杂芳基环烷基和/或杂烷基环烷基；c)特别地，存在于式ROH的官能团中的-OH基团；存在于式RNH2、RR’NH、R(O)NHR’、R(O)NH2的官能团中的-NH基团；存在于式RC(＝NH)R’、RC(＝NH)H的官能团中的＝NH基团；存在于式RSH的官能团中的-SH基团，其中R、R’独立地为氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的杂烷基基团、取代或未取代的环烷基基团、取代或未取代的杂环烷基基团、取代或未取代的芳基基团、取代或未取代的杂芳基基团。本发明的一个实施方案包括亚结构“锚[A]”的组件D1、D2、D3、D4和D/A(在该情况下，相应于“供给体条件下的D/A”)，其各自独立地相应于-C≡CH基团，它们可以相应于：a)下列基团中任一种的构成性基团或取代基：烷基和/或环烷基和/或杂烷基和/或杂环烷基和/或芳烷基和/或芳基环烷基和/或烷基环烷基和/或杂芳烷基和/或杂芳基环烷基和/或杂烷基环烷基；b)芳基和/或杂芳基基团的取代基。本发明的其他实施方案包括亚结构“锚[A]”的组件D1、D2、D3、D4和D/A(在该情况下，相应于“供给体条件下的D/A”)， 其各自独立地相应于存在于HCN中的-CH基团。

在本发明中，组件D1、D2、D3、D4和D/A(在该情况下，相应于“供给体条件下的D/A”)在任何情况下均不相应于：a)存在于-C(O)OH、-S(O)OH、-P(O)OH中的-OH基团；b)存在于CF3-NH-S(O)2-中的-NH基团；c)存在于四唑中的-NH基团。

在本发明中，亚结构“锚[A]”的组件A1-、A2-、A3和D/A(在该情况下，相应于“接受体条件下的D/A”)相应于独立地选自下列基团中任一种的接受氢键的原子或原子团：-C＝O和/或-N＝O和/或-S＝O和/或-P＝O和/或-O-，它们可以相应于：a)下列基团中任一种的取代基：烷基和/或芳基和/或环烷基和/或芳烷基和/或芳基环烷基和/或烷基环烷基；b)下列基团中任一种的构成性基团或取代基：杂烷基和/或杂芳基和/或杂环烷基和/或杂芳烷基和/或杂芳基环烷基和/或杂烷基环烷基；c)特别地，存在于式RC(O)X、RC(O)R’、RC(O)H、RCOO-、RC(O)OH、RC(O)OR’、ROC(O)OR’、C(O)NR’R”的官能团中的-C＝O基团；存在于式RNO2、RNO的官能团中的-NH基团；存在于式RS(O)2OH、RS(O)2R’、RS(O)R’的官能团中的-S＝O基团；存在于式HOPO(OR)2、RP(O)(OH)2、ROP(O)(OH)2的官能团中的-P＝O基团；存在于式ROR’、RC(O)OR’、ROOR’的官能团中的-O-基团，其中X等于卤素，并且R、R’、R”独立地为氢、取代或未取代的烷基基团、取代或未取代的杂烷基基团、取代或未取代的环烷基基团、取代或未取代的杂环烷基基团、取代或未取代的芳基基团、取代或未取代的杂芳基基团。

在本发明的一个实施方案中，亚结构“锚[A]”的组件A1-和A2-相应于携带负(和/或部分地负)净电荷的原子或原子团，例如：存在于-C(O)OH、-S(O)OH、RR’P(O)(OH)、RR’OP(O)(OH)、ROP(O)(OH)2、RP(O)(OH)2、(RO)2P(O)(OH)、RS(O)2OH、ROS(O)2OH中的氧代基团和羟基基团的氧原子；存在于三氟甲基磺酰胺中的氮原子；存在于四唑基团中的未取代的氮原子。

在本发明中，亚结构“锚[A]”的组件D+A和D/A(在该情况下，相应于“接受体-供给体条件下的D/A”)相应于独立地选自下列基团中任一种的同时供给和接受氢键的原子或原子团：-OH、-CONHR、-CONH2。

在本发明中，亚结构“锚[A]”的组件H1、H2、H3各自相应于独立地选自下列基团中任一种的非极性原子或原子团：a)任选地取代或未取代的、有着线性或支化链的、具有不多于七个杂原子的C1-C15烷基或杂烷基基团；b)由一个、两个或三个稠合或连结的环组成的环烷基或杂环烷基基团，每个环具有3-7个成员和不多于三个杂原子，并且任选地是取代或未取代的；c)由一个、两个或三个稠合或连结的环组成的芳基或杂芳基基团，每个环具有5-7个成员和不多于三个杂原子，并且任选地是取代或未取代的；d)由一个、两个或三个芳基环组成的芳烷基基团，其中一个或多个取代基相应于任选地取代或未取代的、有着线性或支化链的C1-C5烷基基团；e)由一个、两个或三个稠合或连结的芳基或杂芳基环组成的杂芳烷基基团，每个环具有5-7个成员和不多于三个杂原子，其中取代基之一相应于任选地取代或未取代的、具有不多于3个杂原子的、有着线性或支化链的C1-C5烷基或C1-C5杂烷基基团；f)由一个、两个或三个稠合或连结的具有3-7个成员的环烷基环组成的烷基环烷基基团，其中一个或多个取代基相应于任选地取代或未取代的、有着线性或支化链的C1-C5烷基基团；g)由一个、两个或三个稠合或连结的环烷基或杂环烷基环组成的杂烷基环烷基基团，每个环具有3-7个成员和不多于三个杂原子，其中一个或多个取代基相应于任 选地取代或未取代的、具有不多于3个杂原子的、有着线性或支化链的C1-C5烷基或C1-C5杂烷基基团；h)由与一个或多个任选地取代或未取代的、具有3-7个成员的环烷基基团相连接的一个、两个或三个芳基环组成的芳基环烷基基团；i)由与一个或多个任选地取代或未取代的环烷基或杂环烷基环相连接的一个、两个或三个芳基或杂芳基环组成的杂芳基环烷基基团，每个环烷基或杂环烷基环具有3-7个成员和不多于三个杂原子，每个芳基或杂芳基环具有5-7个成员和不多于三个杂原子；j)选自基团(a)-(i)中的基团，其中所述基团包含药效团模型的组件H1，并且所述取代基和/或构成性杂原子包含药效团组件D1和/或D2和/或D3和/或A1-；k)选自基团(a)-(i)中的基团，其中所述基团包含药效团模型的组件H2，并且所述取代基和/或构成性杂原子包含药效团组件A3和/或D/A和/或D+A；l)选自基团(a)-(i)中的基团，其中所述基团包含药效团模型的组件H3，并且所述取代基和/或构成性杂原子包含药效团组件D3和/或A2和/或A3和/或D/A。

在“与环“ij”相关联的穴”中对于药效团模型的组件D1、D2、D3和D4的关键相互作用位点

本发明的一个实施方案包括，D1与残基Asp-98的主链羰基基团的氧原子共享一个或多个氢原子，和/或与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Asn-103的侧链甲酰胺基团的氧原子共享一个或多个氢原子。

本发明的一个实施方案包括，D2与残基Asp-98的主链羰基基团的氧原子共享一个或多个氢原子，和/或与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Ala-245的主链羰基基团的氧原子共享一个或多个氢原子，和/或与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Lys-246的主链羰基基团的氧原子共享一个或多个氢原子。

本发明的一个实施方案包括，D3与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Lys-246的主链羰基基团的氧原子共享一个或多个氢原子。

本发明的一个实施方案包括，D4与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Asp-249的侧链羧酸根基团的一个或两个氧原子共享一个或多个氢原子，和/或与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Val-250的主链羰基基团的氧原子共享一个或多个氢原子。

在“与环“ij”相关联的穴”中对于药效团模型的组件A1-和A2的关键相互作用位点

本发明的一个实施方案包括，A1-接受存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Lys-246的侧链铵基团的一个或多个氢原子，和/或A1-携带负(和/或部分地负)净电荷并且与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Lys-246的携带正电荷的铵基团建立静电相互作用。

本发明的一个实施方案包括，A2-接受存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Ser-72的侧链羟基基团的氢原子，和/或A2-携带负(和/或部分地负)净电荷并且与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Arg-99的携带正电荷的胍基基团建立静电相互作用。

在“与环“ij”相关联的穴”中对于药效团模型的组件D/A的关键相互作用位点

本发明的一个实施方案包括，D/A接受存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Ser-72的侧链羟基基团的氢原子，和/或D/A接受存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Thr-70的侧链羟基基团的氢原子。

本发明的一个实施方案包括，D/A与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Ser-72的侧链羟基基团的氧原子共享一个或多个氢原子，和/或D/A与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Thr-70的侧链羟基基团的氧原子共享一个或多个氢原子。

本发明的一个实施方案包括，D/A接受存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Ser-72的侧链羟基基团的氢原子，和/或D/A与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Thr-70的侧链羟基基团的氧原子共享一个或多个氢原子。

本发明的一个实施方案包括，D/A与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Ser-72的侧链羟基基团的氧原子共享一个或多个氢原子，和/或D/A接受存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Thr-70的侧链羟基基团的氢原子。

在“与环“ij”相关联的穴”中对于药效团模型的组件A3的关键相互作用位点

本发明的一个实施方案包括，A3接受存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Thr-115的侧链羟基基团的氢原子，和/或接受存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Gln-248的主链氨基基团的氢原子。

在“与环“ij”相关联的穴”中对于药效团模型的组件D+A的关键相互作用位点

本发明的一个实施方案包括，D+A接受存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Lys-247的侧链铵基团的一个或多个氢原子，和/或与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Asp-249的侧链羧酸根基团的一个或两个氧原子共享一个或多个氢原子。

在“与环“ij”相关联的穴”中对于药效团模型的组件H1、H2和h3的关键相互作用位点

本发明的一个实施方案包括，H1与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Lys-246的丁基铵侧链的脂族部分建立疏水相互作用。

本发明的一个实施方案包括，H1与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Lys-246和Lys-247的丁基铵侧链的脂族部分建立疏水相互作用。

本发明的一个实施方案包括，H2与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Lys-247的丁基铵侧链的脂族部分建立疏水相互作用。

本发明的一个实施方案包括，H2与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Lys-247的丁基铵侧链的脂族部分建立疏水相互作用，和/或H2与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Thr-70的侧链甲基基团建立疏水相互作用。

本发明的一个实施方案包括，H3与存在于“与环“ij”相关联的穴”中的残基Val-97和Ile-113两者的侧链建立疏水相互作用。

亚结构“头”的描述

在本发明中，亚结构“头[C]”或Rc相应于下述中的任一种：

a)氢；b)任选地取代或未取代的、具有不多于三个杂原子的C1-C10烷基或杂烷基基团；c)由一个、两个或三个稠合或连结的环组成的环烷基或杂环烷基基团，每个环具有3-7个成员和不多于三个杂原子，并且任选地是取代或未取代的；d)由一个、两个或三个环组成的芳基或杂芳基基团，每个环由5-7个成员形成和具有不多于三个杂原子，并且任选地是取代或未取代的；e)由一个、两个或三个芳基环组成的芳烷基基团，其中一个或多个取代基相应于任选地取代或未取代的、有着线性或支化链的C1-C5烷基基团；f)由一个、两个或三个稠合或连结的芳基或杂芳基环组成的杂芳烷基基团，每个环具有5-7个成员和不 多于三个杂原子，其中取代基之一相应于任选地取代或未取代的、具有不多于3个杂原子的、有着线性或支化链的C1-C5烷基或C1-C5杂烷基基团；g)由一个、两个或三个稠合或连结的环烷基环组成的烷基环烷基基团，每个环具有3-7个成员，其中一个或多个取代基相应于任选地取代或未取代的、有着线性或支化链的C1-C5烷基基团；h)由一个、两个或三个稠合或连结的环烷基或杂环烷基环组成的杂烷基环烷基基团，每个环具有3-7个成员和不多于三个杂原子，其中一个或多个取代基相应于任选地取代或未取代的、具有不多于3个杂原子的、有着线性或支化链的C1-C5烷基或C1-C5杂烷基基团；i)由与一个或多个任选地取代或未取代的、每个具有3-7个成员的环烷基基团相连接的一个、两个或三个芳基环组成的芳基环烷基基团；j)由与一个或多个任选地取代或未取代的环烷基或杂环烷基环相连接的一个、两个或三个芳基或杂芳基环组成的杂芳基环烷基基团，每个环烷基或杂环烷基环具有3-7个成员和不多于三个杂原子，每个芳基或杂芳基环具有5-7个成员和不多于三个杂原子；k)选自基团b)-j)中的基团，其中所述取代基包含一个或多个选自下列基团的携带正电荷的基团：RNH2、RNHR’、RNR’R”、RC(NRR’)＝NR”、C(NR’R”)2＝NR”’、RNHC(NR’R”)＝NR”’、C(RNH)2＝NR’、RC(R’NH)＝NR”；l)选自基团b)-j)中的基团，其中所述取代基包含一个或多个选自下列基团的携带负电荷的基团：C(O)OH、S(O)OH、RR’P(O)(OH)、RR’OP(O)(OH)、ROP(O)(OH)2、RP(O)(OH)2、(RO)2P(O)(OH)、RS(O)2OH、ROS(O)2OH、四唑基团。

抑制机制

本发明中所描述的化学化合物通过下列机制中的一种或数种来抑制登革病毒感染：

A)影响病毒粒子的形态发生和/或装配的过程，

B)干扰胞吐运输和病毒粒子的成熟过程，

C)调节成熟病毒粒子的稳定性，

D)影响膜融合过程。

本发明中所描述的化合物的亚结构“锚”的作用在于保证所述化合物锚定至“与环“ij”相关联的裂隙”，并因而允许所述化学化合物定位在E蛋白的结构域II的末端附近。结构域II的该区域牵涉作为该蛋白质的特征的各种分子间相互作用，例如preM-E相互作用，成熟病毒粒子的E蛋白二聚体的形成，以及融合过程中所必需的E蛋白与内体膜的相互作用。因此，这些化合物与E蛋白的结合干扰和/或修饰这些分子间相互作用，从而引起对于与每种特定相互作用相关联的该蛋白质的生物学功能的影响，并因此引起对于与所述功能有关的病毒复制循环的所述阶段的抑制效应。

病毒粒子的形态发生和/或装配的过程正是这种情况，这是一个以病毒粒子释放到内质网的膜中为特征的步骤，并且该步骤通过在preM蛋白与E蛋白之间建立的次要相互作用而介导。本发明的化合物和preM蛋白竞争与E蛋白的结合，由此干扰释放过程。除了亚结构“锚”外，亚结构“头”也有助于这些化合物的活性，这通过促成更大的亲和力和/或位阻干扰。它阻碍preM-E相互作用，此外还引起融合肽暴露于溶剂，而没有preM蛋白所提供的保护。因此，E蛋白经历与细胞内的膜或与病毒粒子自身的膜的过早相互作用，由此影响了通过胞吐途径的细胞内运输和病毒粒子(特别是完全感染性的病毒粒子)的成熟。亚结构“头”也可以在该步骤中作出贡献，因此，无极性和体积大的“头”通过该膜来增加E蛋白-配体复合物的亲和力，并且在空间上干扰E蛋白同二聚体(成熟病毒粒子的包膜所特 征性的)的形成。合适的亚结构“头”的选择对于调节成熟病毒粒子的稳定性也是必需的。一种可能性是通过位阻和/或经由亚结构“头”与毗邻单体的原子的不利的原子相互作用而使E蛋白同二聚体去稳定化。结果是，这些病毒粒子更不稳定并且倾向于在细胞外和细胞内的环境中过早地失活。还可能的是设计这样的亚结构“头”，其保证与毗邻单体的残基的有利相互作用，从而促成所述同二聚体的额外的稳定化。在该情况下，该生物学效应也导致病毒粒子的感染性的减弱，这通过干扰与膜融合过程相关联的四级结构的变化来实现，所述膜融合过程在内体小泡中发生从而导致病毒进入细胞。二聚体稳定性的增加降低了融合过程的pH阈值；而去稳定化提高了融合过程的pH阈值，在这两种情况下，都影响了融合过程。本发明中所描述的亚结构“头”还可以通过修饰与内体膜相互作用的能力而改变融合肽的亲水特性。如此，无极性的亚结构“头”引起与膜的结合亲和力的增加，而极性的亚结构“头”引起相反的效应。在任何情况下，亚结构“头”与融合肽的相互作用影响与内体膜的融合过程。

本发明考虑了药物组合物，其包含一种或多种所述化学化合物或其药学上可接受的盐，以及将它们包含在内的药学上可接受的赋形剂或载体。此外，本发明还包括化学化合物在制备药物中的用途，所述药物用于登革病毒或其他黄病毒的。本发明还包括所述化合物或其变体用于预防和/或在人中的由黄病毒引起的感染的用途，其中至少出现所述疾病的症状的减轻。

相对于用于开发旨在抑制和/或干扰病毒复制循环的各个阶段的抗病毒化合物的其他策略而言具有优点的本发明的一个新方面在于，设计本发明中所描述的化学化合物以用于干扰病毒复制循环的数个阶段，从而增强抗病毒效应。由于这些化合物针对在这些病毒中在进化上保守的、生物学上重要的结合位点，因而也减小了产生活的逃逸突变体的可能性。

用于鉴定亚结构“锚”的方法

所述化学化合物通过使用计算方法来鉴定，尤其是将通过分子对接进行的虚拟筛选的结果和药效团模型的使用相组合。使用了根据成熟病毒粒子结构的融合前二聚体登革病毒E蛋白的模型以及化学化合物的数据库。所述模型通过下述方式来构建：独立地将登革病毒DEN2的E蛋白(1TG8)的结构域II和结构域I+III与使用Whatif程序(Vriend，G.(1990)WHAT IF：a molecular modeling and drug design program.J Mol Graph.8：52-56)经低温电子显微术(Cryo-EM)所测定的登革病毒DEN2的成熟病毒颗粒(1THD)结构中的相应结构域相叠置，并随后进行结构域I-II界面处的能量最小化(实施例1)。在分子对接模拟中用作结合位点的E蛋白的靶区域相应于本发明中所描述的“与环“ij”相关联的穴”。使用Dock程序(Kuntz，I.D.，Blaney，J.M.，Oatley，S.J.，Langridge，R.和Ferrin，T.E.(1982)A geometric approach to macromolecule-ligandinteractions.J Mol Biol.161：269-88)用于在存在于所构建出的E蛋白模型中的“与环“ij”相关联的穴”之中对来自ZINC数据库(Irwin，J.J.和Shoichet，B.K(2005)ZINC-A Free Database of Commercially AvailableCompounds forV irtual Screening.J.Chem.Inf.Model.45：177-182)的化学化合物的数百万种构象进行定向和评价。选择具有最大的结合能值的化学化合物(例如，能量＜＝-35kjmol-1，根据用Dock程序版本4的能量函数进行的评价)，并且进行在所述受体-配体复合物的受体中的结合模式的目视分析。最后，选择出了一组 化学化合物，它们不仅导致具有升高的结合能值(能量＜＝-35kjmol-1)的受体-配体复合物，而且它们还采取可安置于“与环“ij”相关联的穴”中的构象并且与下面提及的残基中的数个建立经由氢键键合和/或疏水相互作用和/或静电相互作用的相互作用(根据计算机预测)：

a)形成所述穴的残基，例如：Thr-70、Ser-72、Val-97、Asp-98、Arg-99、Asn-103、Ile-113、Thr-115、Ala-245、Lys-246、Lys-247、Gln-248和Asp-249；

b)形成融合肽的残基：Gly-100、Trp-101、Gly-102和Phe-108；

c)相应于存在于成熟病毒粒子的二聚体结构中的毗邻单体的残基：Arg-2、Gly-5、Ile-6、Ser-7、Asn-8、His-27、Gly-28、Glu-44和Asp-154；

d)存在于环“ij”中的残基，例如：His-244。

在虚拟筛选实验中选择出的每一种化学化合物与“与环“ij”相关联的裂隙”的结合模式的计算机预测分析，使得能够检测与本发明中定义的“关于锚定至“与环“ij”相关联的裂隙”的关键残基”具有可能有利的相互作用的亚结构的存在。所鉴定出的亚结构使得能够定义与“关于锚定至“与环“ij”相关联的裂隙”的关键残基”的有利的原子间相互作用的3D药效团模型(图5)。所述药效团模型的构建用Pocket程序(ChenJ.和Lai L.(2006)Pocket v.2：Further Developments on Receptor-BasedPharmacophore Modeling.J.Chem.Inf.Model.46：2684-2691)进行补充。所述3D药效团模型用于鉴定其他亚结构“锚”和化学化合物，通过使用3DFS程序(Wang，T.和Zhou，J.(1998)3DFS：A New 3D FlexibleSearching System for Use in Drug Design.J.Chem.Inf.Comput.Sci.38：71-77)。通过虚拟筛选和通过使用3D药效团模型而获得的化学化合物显示在实施例2中。本发明中所描述的亚结构“锚”包含下列组件中的至少三种：a)供给氢键的组件(D1-4)，和/或b)接受氢键的和/或携带负电荷的组件(A1-，A2-，A3)，和/或c)疏水组件(H1-3)，和/或d)接受和/或供给氢键的组件(D/A)，和/或e)同时供给-接受氢键的组件(D+A)，并且所述组件(a)-(e)选自构成3D药效团模型的组件，它们在实施例3中进行了描述。本发明中所描述的亚结构“锚”与“关于锚定至“与环“ij”相关联的沟”的关键残基”之间的分子间相互作用在实施例4中进行了举例说明。根据实施例5中所描述的，在Vero细胞中在噬斑形成抑制测定法中体外评价了本发明中所描述的化学化合物抑制登革病毒感染的能力。

附图详述

图1.下列黄病毒的E蛋白单体之一的结构域II的结构叠置的图示：登革病毒、西尼罗病毒和蜱传脑炎病毒。在具有标识符1OKE、1TG8和1OAN的登革病毒DEN2的E蛋白和具有标识符1UZG的登革病毒DEN3的E蛋白的融合前二聚体结构中，观察到在结构域II末端处的“与环“ij”相关联的穴”，其中环“ij”采取开放构象。环“ij”的这种开放构象在西尼罗病毒的E蛋白的单体结构2HG0和2I69中未观察到，在蜱传脑炎病毒的融合前二聚体结构1SVB中也未观察到，在登革病毒DEN2的融合后三聚体结构1OK8和蜱传脑炎病毒的1URZ中也未观察到。用Chimera程序的二级结构的描绘(Pettersen，E.F.，Goddard，T.D.，Huang，C.C.，Couch，G.S.，Greenblatt，D.M.，Meng，E.C.和Ferrin，T.E.(2004)UCSF Chimera-A Visualization System for Exploratory Researchand Analysis.J.Comput.Chem.25：1605-1612)。

图2.登革病毒DEN2的融合前二聚体E蛋白1TG8、1OAN、1OKE，登革病毒DEN2的融 合后三聚体E蛋白1OK8，和登革病毒DEN3的融合前二聚体E蛋白1UZG的发夹“ij”之间的结构差异。使用具有标识符1TG8的登革病毒DEN2的融合前二聚体E蛋白的3D结构作为用于进行叠置的模子。

图3.登革病毒、西尼罗病毒和蜱传脑炎病毒的结构域II的序列比对以及对于下列结构中的每一个所报告的残基的温度因子值：登革病毒DEN2的二聚体E蛋白(1TG8、1OAN、1OKE)、登革病毒DEN3的二聚体E蛋白(1UGZ)、登革病毒DEN2的融合后三聚体E蛋白(1OK8)、蜱传脑炎病毒的二聚体E蛋白(1SVB)和融合后三聚体E蛋白(1URG)以及西尼罗病毒的单体E蛋白(2HG0和2I69)。构成发夹“ij”的残基的温度因子值加有阴影，并且包含发夹“ij”的氨基酸序列加有下划线。

图4.与成熟病毒粒子相符的登革病毒血清型2的二聚体E蛋白模型以及在虚拟筛选计算机实验中用作靶标的结合位点(“与环“ij”相关联的穴”)的图示。显示了用于决定配体在结合位点中的取向的球体的全体，并且被考虑用于评价受体-配体分子间能量的E蛋白的残基显示为包含在盒中。使用Chimera软件(Pettersen，E.F.，Goddard，T.D.，Huang，C.C.，Couch，G.S.，Greenblatt，D.M.，Meng，E.C.和Ferrin，T.E.(2004)UCSF Chimera-A Visualization System for Exploratory Research andAnalysis.J.Comput.Chem.25：1605-1612)。

图5.在“与环“ij”相关联的沟”处，本发明中所描述的3D药效团模型的图解描绘。

图6.包含在亚结构“锚”A-SIJ023、A-SIJ118和A-SIJ121中的药效团模型的组件的描绘，以及结合模式的描绘。

实施例

实施例1.与成熟病毒粒子相符的E蛋白模型的构建。

为了选择作为用于进行计算机实验的靶分子的登革病毒E蛋白的3D结构，分析了通过X-射线晶体学和Cryo-EM测定的在蛋白质三维结构数据库PDB(Berman，H.M.，Westbrook，J.，Feng，Z.，Gilliland，G.，Bhat，T.N.，Weissig，H.，Shindyalov，I.N.和Bourne，V(2000)The Protein DataBank.Nucleic Acids Research.28：235-242)中的经注释的所述蛋白质的晶体学结构。尽管通过Cryo-EM测定的登革病毒E蛋白的结构具有低的分辨率，但它是有用的，因为提供了关于不同结构域之间的取向、二聚体中单体之间的分开以及暴露在成熟病毒粒子表面上的E蛋白的区域的信息。为了比较在成熟病毒粒子情形之内和之外E蛋白的结构，进行了通过Cryo-EM测定的成熟病毒粒子结构(1THD)的结构域II与二聚体E蛋白的晶体学结构1OAN、1OKE和1TG8的叠置。结构叠置用WhatIF程序的motif选项来进行，其基于取所述蛋白质之一的一定长度的片段并将其叠置于另一个片段(模子)上，同时以最小的均方根偏差(root meansquare deviation，RMSD)值在这两个结构之间寻最大数量的等价氨基酸。结构叠置显示，结构域II的结构和“与环“ij”相关联的沟”的结构在所有经分析的结构(1OAN、1OKE、1TG8)之间是保守的，其中α碳原子的RMSD小于然而，在通过X-射线晶体学和通过Cryo-EM获得的E蛋白二聚体的3D结构中观察到差异。相对于在成熟病毒粒子表面上通过Cryo-EM获得的E二聚体而言，晶体学二聚体更加紧凑，其中单体之间的分开更小。因此，决定不使用任何在数据库PDB中的经注释的 登革病毒二聚体E蛋白的晶体学结构作为用于计算机分子对接模拟的受体。相反地，采用与通过Cryo-EM测定的成熟病毒粒子的假原子结构相符的登革病毒E蛋白的原子模型作为受体。所述模型通过将二聚体E蛋白的通过Cryo-EM(1THD)和通过X-射线晶体学(1TG8)测定的可用的结构信息相组合来构建。将二聚体E蛋白的结构1TG8分成两个部分：结构域II和结构域I+III，通过使用Whatif程序，将它们独立地与其在结构1THD中的相应结构域相叠置。然后，进行能量最小化以优化相应于结构域I和II之间的联系的键长和键角的几何学；最后，用Whatif程序的fulchk选项检查所获得的模型。在图4中，显示了在本发明中所使用的与成熟病毒粒子相符的所构建出的二聚体E蛋白的3D模型，并且还显示了在虚拟筛选实验中用作结合位点(相应于本发明中所描述的“与环“ij”相关联的穴”)和用于获得关于构建3D药效团模型的额外信息的靶区域。

实施例2.通过分子对接模拟来进行的化学化合物文库的虚拟筛选。3D药学团模型的构建和使用。

采用虚拟筛选方法来计算机鉴定与DEN2病毒E蛋白的“与环“ij”相关联的穴”的残基具有可能有利的相互作用的化学化合物。所述分子对接模拟在于使用Dock程序(版本4.01和6.1)在DEN2病毒E蛋白的“与环“ij”相关联的穴”中对于在ZINC数据库(版本5)中所包括的化学化合物的不同构象进行定向和能量评价。受体的坐标获自实施例1中所描述的与成熟病毒粒子的结构相符的DEN2病毒二聚体E蛋白的原子模型。结合位点相应于由下列残基形成的“与环“ij”相关联的沟”：实施例1中所描述的DEN2病毒(S1株)的E蛋白的原子模型的68TTTDSRC74、97VDRG100、103NGC105、111GGIVT115和245AKKQDV250。化学化合物在“与环“ij”相关联的穴”中的取向由球体的全体决定；关于“与环“ij”相关联的穴”的情况的那些球体显示在图4中。

在所产生的受体-配体复合物的能量评价中考虑了最大位于离上面所提及的球体的全体距离处的受体的任何残基的能量贡献。用Grid程序(Dock程序的附属工具)在分子对接模拟之前进行受体的能量评价。将配体考虑为柔韧的分子，由此发展出两种主动行动：第一，用Corina和Rotate程序(Sadowski，J.(1997)A hybrid approach for addressing ringflexibility in 3D database searching.J Comput Aided Mol Des.11：53-60)产生存在于ZINC数据库中的每一种化学化合物的各种构象；和第二，采用Dock程序(版本4.01和6.1)的flexible选项。在第一种情况下，使用Dock程序(版本4.01和6.1)的刚性变体，使对于每种化合物而获得的构象在与成熟病毒粒子的结构相符的E蛋白原子模型中定向。在这两种情况下，都评价所产生的每种受体-配体复合物的结合模式，其中采用Dock程序的不同评分函数(例如，化学函数、能量函数和接触函数)，以及其他评分函数，例如AutoDock程序的评分函数(Morris，G.M.，Goodsell，D.S.，Halliday，R.S.，Huey，R.，Hart，W.E.，Belew，R.K.和Olson，A.J.(1998)Automated Docking Using a Lamarckian GeneticAlgorithm and and Empirical Binding Free Energy Function.J ComputChem.19：1639-1662)和评分函数X-Score(Wang，R.；Lai，L.；Wang，S.Further(2002)Development and Validation of Empirical ScoringFunctions for Structure-Based Binding Affinity Prediction.J.ComputAided Mol.Des.16：11-26)。只选择对接在结合位点中的每种化学化合物的最佳构象(例如，能量＞＝-35kjmol^-1，在Dock程序版本4.01的情况下)。对于所选化合物的构象中的每一种进行结合模式的目视分析。

最后，所述目视分析使得能够区分出具有从能量角度看有利的结合的化学化合物，即那些可安置于“与环“ij”相关联的穴”中并且还与下述残基相互作用的化学化合物：

a)形成所述穴的残基，例如：Thr-70、Ser-72、Val-97、Asp-98、Arg-99、Asn-103、Ile-113、Thr-115、Ala-245、Lys-246、Lys-247、Gln-248和Asp-249；

b)形成融合肽的残基：Gly-100、Trp-101、Gly-102和Phe-108；

c)相应于存在于成熟病毒粒子的二聚体结构中的毗邻单体的残基：Arg-2、Gly-5、Ile-6、Ser-7、Asn-8、His-27、Gly-28、Glu-44和Asp-154；

d)存在于环“ij”中的残基，例如：His-244。

下面(表1)显示了通过虚拟筛选和采用3D药效团模型而选择出的化学化合物。所述化学化合物通过前面所描述的原子相互作用而结合至“与环“ij”相关联的穴”，根据计算机预测。

表1.具有可能有利的结合的化学化合物的2D结构和结合能值，根据用Dock(版本4.01和6.1)和AutoDock程序的评分函数以及用以形成结合位点的原子团的几何学和化学组成进行补充的结合模式而获得的能量评价。所报告的能量值用Dock程序4.01的能量函数来获取。

实施例3.亚结构“锚”的描述

具有最高结合能值的化学化合物与“与环“ij”相关联的裂隙”的结合模式的计算机预测的目视分析，使得能够检测与“关于锚定至“与环“ij”相关联的裂隙”的关键残基”具有可能有利的相互作用的亚结构的存在，所述关键残基包括：Thr-70、Ser-72、Val-97、Asp-98、Arg-99、Asn-103、Ile-113、Thr-115、Ala-245、Lys-246、Lys-247、Gln-248、Asp-249和Val-250。所述亚结构在本发明中称为亚结构“锚”。所述亚结构“锚”使得能够定义与“关于锚定至“与环“ij”相关联的裂隙”的关键残基”的有利的原子间相互作用的3D药效团模型(图5)。本发明中所描述的3D药效团模型的构建用3DFS程序(Wang，T.和Zhou，J.(1998)3DFS：ANew 3D Flexible Searching System for Use in Drug Design.J.Chem.Inf.Comput.Sci.38：71-77)进行补充。所述3D药效团模型用于计算机鉴定新的亚结构“锚”，随后以与实施例2中所描述的类似的方式，通过使用Dock程序使所述新的亚结构“锚”在受体的结合位点中进行定向和评价。所述亚结构“锚”根据化学相似性以及在“与环“ij”相关联的沟”中的结合模式进行归类。本发明中所描述的亚结构“锚”包含下列组件中的至少三种：a)供给氢键的组件(D1-4)，和/或b)接受氢键的和/或携带负电荷的组件(A1-，A2-，A3)，和/或c)疏水组件(H1-3)，和/或d)接受和/或供给氢键的组件(D/A)，和/或e)同时供给-接受氢键的组件(D+A)，并且所述组件(a)-(e)选自构成3D药效团模型的组件，它们描述在下面：

实施例4.药效团模型-亚结构“锚”的关系

本发明中所描述的药效团模型的组件中的每一个与“关于锚定至“与环“ij”相关联的裂隙”的关键残基”中的至少三个相互作用。本发明中所描述的亚结构“锚”包含存在于药效团模型中的组件中的至少三个。下面描述了一些亚结构“锚”的结合模式。

锚A-SIJ023

亚结构“锚”A-SIJ023包含下列的药效团模型的组件：D1、A1-、A2-、D/A、H3和H2，如图6(a)中所显示的。相应于组件D1的NH基团与残基Asn-103的侧链羰基基团的氧原子共享氢原子。相应于组件A1-的磺酰基基团(更接近于亚结构“头”(Rc))的氧原子与残基Lys-246的侧链铵基团建立静电相互作用。存在于亚结构“锚”中的其余磺酰基基团的氧原子相应于组件A2-，并且接受残基Ser-72的侧链羟基基团的氢原子。相应于组件D/A的氧代基团通过氢键与残基Gln-248的主链NH基团相互作用。哌嗪基基团的两个CH2基团相应于组件H3，并且与残基Val-97和Ile-113的侧链建立疏水相互作用。相应于组件H2的CH3基团与残基Lys-246的丁基铵侧链的脂族部分，特别是与Cβ和Cδ碳维持疏水相互作用。

锚A-SIJ118

亚结构“锚”A-SIJ118包含下列的药效团模型的组件：D1、A1-、A2-、H3和H2，如图6(b)中所显示的。相应于组件D1的NH基团与残基Asp-98的主链羰基基团的氧原子共享氢原子。相应于组件A1-的氧原子与残基Lys-246的侧链铵基团形成氢键和静电相互作用。磺酰基基团的氧原子相应于组件A2-，并通过接受残基Ser-72的侧链羟基基团的氢原子而建立氢键。相应于组件H3的吡咯基团的碳原子与残基Val-97和Ile-113的侧链建立疏水相互作用，而相应于组件H2的那些与残基Lys-246的丁基铵侧链的脂族部分，特别是与Cβ和Cδ碳维持疏水相互作用。

锚A-SIJ121

亚结构“锚”A-SIJ121包含下列的药效团模型的组件：D2、A1-、A2-和H2，如图6(c)中所显示的。相应于组件D2的NH基团与残基Lys-246的主链羰基基团的氧原子共享氢原子。相应于组件A1-的磺酰基基团的氧原子与残基Lys-246的侧链铵基团建立静电相互作用和氢键。相应于组件A2-的氧原子和/或硫原子与残基Ser-72的侧链羟基基团形成氢键。相应于组件H2的碳原子与残基Lys-246的丁基铵侧链的脂族部分，特别是与Cβ和Cδ碳 建立疏水相互作用。

实施例5.实验检定

在Vero细胞中病毒感染的抑制

为了证明本发明中所描述的化合物在体外抑制登革病毒感染的能力，在Vero细胞中在噬斑形成抑制测定法中评价了这些化合物。

使Vero细胞在24-孔平板中生长直至单层达到大约90％的汇合，并用没有FBS的MEM培养基洗涤单层两次。将相当于0.1的感染复数的DENV2的制备物在环境温度下在有和没有化学化合物(100uM)存在的MEM培养基中预温育1小时。然后，将“病毒/化合物”混合物以及“病毒/对照”混合物与单层一起在37℃下温育1小时。在完成温育时，再次洗涤细胞，并且在高密度培养基(补充有非必需氨基酸、1％FBS、1％羧甲基纤维素的MEM)中在37℃下温育5天，以促进裂解噬斑的形成。使用在0.15mol/L乙酸钠中的0.1％萘酚蓝黑进行染。在每个实验中对于每个点测试两次重复，并进行三次独立的测定。根据下式来计算感染抑制百分比：

I＝100×[1-噬斑数目/对照病毒的噬斑数目]。

如在表3中所观察到的，本发明中所描述的化合物在所测试的浓度下显示出针对登革病毒DEN2的抗病毒活性(I)。对于80％的所述化合物所观察到的抗病毒效应是中等的(30％≤I＜70％))或强的(70％≤I≤100％)。活性化合物的全体包括这样的化合物，其包含不同的亚结构“锚”，以及对于各亚结构“锚”的不同的亚结构“头”，这表明从各种不同化学“核心”开始进行本发明中所描述的抗病毒剂的设计的可行性。

表3.本发明中所描述的数种化学化合物针对登革病毒DEN2的体外抗病毒效应的测量。

++表明70％≤I≤100％

+表明30％≤I＜70％

-表明30％＜I≤0％

化学化合物的毒性的评价

为了排除所观察到的抗病毒活性可能是由于由所述化合物诱导的细胞改变和细胞毒性而产生的，将Vero细胞单层暴露于以500uM的浓度制备的这些化合物的溶液24小时，并通过MTT测定法(细胞增殖测定法TACSTM，R&D systems，Minneapilis，MN)来测定细胞生存力。在用化合物处理的细胞的生存力和未处理或用DMSO处理的对照细胞的生存力之间没有观察到显著的差异。

抑制活性的特异性

为了确定所述化合物是否特异性地抑制登革病毒(和其他相关的黄病毒)对于细胞的感染，测试了这些化合物针对不相关的病毒例如痘苗病毒和曼哥病毒的抑制效应。这些化合物中没有一种显示出显著的针对这些病毒的抑制效应。