检测和预测对β激动剂的支气管扩张反应的方法

技术领域

本发明涉及，用于预测个体对β激动剂的支气管扩张反应的方法。具体 的，本发明涉及，β2AR基因的特定等位基因变异体的检测和它们作为β激动 剂的药物遗传学标记物的用途。

背景技术

哮喘是气道的慢性炎症疾病，其症状是喘鸣、胸闷和咳嗽的反复发作， 其严重程度和发生频率因人而异(Suki等人，2003)。该病症是肺部气道变 狭窄或完全堵塞，阻止正常呼吸。但是，自发地或者借助药物，哮喘中的这 种肺部阻塞是可逆的。目前，主要有三种方法(Jeffrey等人，2000)：(a) 吸入糖固醇(Martin，2003；Settipane等人，2003)(b)β2激动剂(Eh等人， 2003)和(c)白三烯抑制剂(Biermer等人，2002)。在患有表观相同表型哮喘的病 人中，对药物的反应可能有显著差异(Drysdale等人，2000)。β2AR受体激动 剂作为支气管扩张药被推荐为哮喘的一线药物(National Asthma Education and Prevention Program(1997)Expert Panel Report II)。短效和长效的β2激动剂显示出对 抗多种直接和间接的支气管收缩刺激物的保护作用(Cockcroft等人，1996)。β肾上 腺素能受体传统地分为至少三个不同的亚型：β1，β2，β3，被确定分别在心脏、气 道平滑肌和脂肪组织中(JohnsonM，1998)。在β1，β2和β3受体之间有65-70％的 同源性。β肾上腺素能受体以激活和失活两种形式存在，在平常状态下这两种形式 平衡存在，失活状态占绝大多数(Johnson M，1998)。当β2AR和一分子鸟苷三磷 酸(GTP)与G蛋白α亚单元连结时，它以激活的形式存在，并且通过该α亚单元， 该受体与腺苷酸环化酶偶合。GTP被GDP地替换催化了ATP借助酶向cAMP的转 化，并大大降低α亚单元和该受体的亲和力，导致分裂和该受体返回低能量的失活 形式(Johnson M，1998)。对于用于哮喘的支气管扩张的β2受体激动药，该β2肾 上腺素能受体是关键的靶体。β2AR是与G蛋白偶合的，并且具有细胞外的氨基末 端，七个跨膜结构域，三个细胞内和三个细胞外环，和一个细胞内羧基末端，广泛 分布于全身特别是支气管的平滑肌细胞，在多种组织和器官中调节儿茶酚胺的作用。 β2AR包括约46500 Dalton(Da)的413个氨基酸残基(Drysdale等人，2000)。

β2AR被染体上的5q31-32非内含子基因编码(Kobilka等人，1987)。Johnson M.，(1998)报道了β2AR基因编码区的几种单核苷酸多态性(SNP)，其导致人类 种中的β2AR蛋白结构的显著遗传多态性(GenBank登记号AF022953.1 GI：2570526；AF022954.1 GI：2570528和AF022956.1 GI：2570532)。这些SNP位于 β2AR编码序列的46(A或G)，79(C或G)，491(C或T)的核苷酸，结果导致 受体在氨基酸16(Arg或Gly)和27(Gln或Glu)的氨基末端和第四个跨膜结构域 的氨基酸164(thr或Ile)分别发生变异。这些氨基酸变异体具有清楚的表型差异， 正如重组细胞实验所证实(Green等人，1994)，细胞(CHW-12)的原代培养内源 性地表达了这些变异体(Green等人，1995)，并且转基因小鼠在心脏中过表达了 Thr164或Ile164(Turki等人)。除此之外，已经报道，编码区的523核苷酸的C和 A的同义多态性与日本人种族对于沙丁胺醇(salbutamol)的反应性变化有关(Ohe 等人，1995)。除上述编码区的多态性外，5′启动子区的几种SNP最近已经被确定 并被定位于核苷酸-1023(A或G)，-654(G或A)，-468(C或G)，-367(T或C)， -47(C或T)和-20(T或C)(Scott等人，1999)。最近，Drysdale(2000)等人报道 了-709(C或A)和-406(C或T)的另外两种SNP。因此，已经确定13个多态性 位点位于GenBank登记号M15169.1的565和2110核苷酸之间的β2AR基因区域中。 不同的小组已经表明某些上述β2AR氨基酸变异体和对多种病症的易感性增加的关 系，包括：高血压(Gly16变异体，Hoit等人，2000)；过敏症(Gly16变异体，Dewar 等人，1998)；夜间哮喘(Gly16变异体，Turki等人，1995)；对肥胖的反应(Gly16 变异体，Sakane等人，1999)；重症肌无力(Arg16变异体，Xu等人，2000)；儿童 期哮喘(Gln27变异体，Dewar等人，1997)；肥胖症(Glu27变异体，Large等人， 1997)和充血性心力衰竭的死亡率(Ile164变异体，Liggett等人，1998)。

还表明，上述讨论的某些β2AR基因多态性可能作为哮喘中的疾病修饰剂发挥 作用或者可能是已知的对于β激动剂的支气管扩张反应的个体差异的基础(Drysdale 等人，2000)。事实上，Martinez等人(1997)已经报道，个体的Arg16变异体的纯 合子和杂合子与个体的Gly16变异体的纯合子相比，更可能对沙丁胺醇(albuterol) 产生反应。有趣的是，另一个小组报道了，在Gly16变异体的哮喘症纯合子中，在 连续使用β激动剂福莫特罗(formoterol)后的支气管扩张药的脱敏作用(Tan 等人，1997)。但同时，其他的研究没有证明不良药物反应和使用β激动剂的常规治 疗之间的关联(Lipworth等人，1999)。

哮喘是世界上最普遍的疾病之一。印度有1.5-2千万的哮喘病人，并且在印度有 6％的孩子患有哮喘(Chabra S.K.，1998)。哮喘是一种复杂的、多因素疾病，涉及 很多基因和一些环境因素(Suki等人，2003)。印度人种的遗传因子已经被充分阐明。 许多导致错误的不合理药物处方的产生是由于，缺乏个体和种族在对目前用于 哮喘的多数药品的药物反应差异的知识。在一些急性病例中这可能是致命的。通过 使用以前对于根据药物遗传学基本理论开出的药物的个体反应知识，可以避免这些 情况。存在多种由于不合理药物处方而产生的副作用，如发抖、心悸、疼痛和耐药 性(O′Connor等人，1992，Dennis等人，2000)。已经发现，特别是在印度人种中， 本发明中公开的β2AR基因核苷酸46(A/G)位的等位基因变异体是用于β激动药 的支气管扩张反应的指示标记物(dicatator)。已经观察到，患有哮喘的病人有时对 沙丁胺醇没有反应，并且需要很长时间(几天至几个月)来确定特殊患者对该药物 没有反应。在此期间，很难为患者提供病症的缓解。如果该医生在一开始就能 确定反应者和非反应者，那么将节省剂量效价时间(dose titration time)，而且病人 将能得到使用其他方法的及时。在急诊病例中能够给非反应者提供及时准 确的，而这将挽救生命。

Drysdale等人(2000)在美国专利申请811286号中公开了一种方法，其中，在 β2AR基因-654(G/A)，46(A/G)和252(G/A)位的三种SNP决定了高加索人种 的β激动药反应。Drysdale等人(2000)要求保护的该方法和诊断试剂盒耗费更多 时间，而且昂贵(由于使用三套探针和引物以及相关的生物化学试剂)。进一步，他 们的方法严格限用于高加索人。因此，由于印度有1.5-2千万哮喘病人并且印度有 6％的孩子患有哮喘，所以需要开发一种不昂贵，快速且特定用于筛选印度人种对β 激动剂的药物反应的诊断方法和试剂盒。本发明中公开的SNP具有作为个体患者的 药物反应的指示剂的很强的预测能力。

哮喘是一种复杂的疾病，具有临床很难定义的表型。用于哮喘的最普遍的 药物是吸入式β肾上腺素能激动剂。β2AR多态性可能会影响受体的调节。本发明 的新颖性在于，提供了单核苷酸多态性作为药物反应的药物遗传学基因座决定印度 哮喘患者对β激动剂的有力关联。本发明的新颖性还在于，提供了一种通过检测 β2AR基因46位(A/G)的等位基因变异体，预测支气管扩张反应的方法。该单核 苷酸多态性已经被发现其独自与印度哮喘患者的药物反应有关。而且，已经发现该 SNP是印度人种药物反应的dictator标记物。Drysdale等人发现，三种SNP一起为 高加索人中的药物反应做出贡献，但是在印度人种中发现，这三种SNP是没有关联 的，并且因此我们观察到在印度人种中采用这三种SNP效果不如只使用一种SNP (A→G)。

本发明还提供了新颖的用于筛选印度人种中对于β2激动剂的反应者的特定探 针和引物以及诊断试剂盒。

本发明进一步提供了一种用于预测印度哮喘患者对于β2激动剂的药物反应的 廉价快速的方法。该β2AR基因多态性作为一种廉价的诊断试剂和在开发该疾病的 新方法方面，都具有很大的商业价值。

发明的目的

本发明的主要目的是，提供一种用于检测和预测对β2激动剂的支气管扩张反应 的方法。

本发明的另一个目的是，提供一种检测和预测β2AR基因的特定等位基因变异 体或单核苷酸多态性的方法。

本发明的另一个目的是，提供一种制备用于检测和预测对β2激动剂的支气管扩 张反应的药物遗传学标记物的方法。

本发明的另一个目的是，提供一种用于检测和预测对β2激动剂的支气管扩张反 应的诊断试剂盒。

本发明的另一个目的是，提供用于检测和预测对β2激动剂的支气管扩张反应的 新颖的药物遗传学标记物。

本发明的另一个目的是，提供一种快速和特定的方法，用于筛选哮喘病人中对 于β2激动剂的反应者和非反应者。

本发明的另一个目的是，提供用于预测该药物反应的β2AR基因中药物遗传学 基因座位的基因型。

本发明的另一个目的是，提供用于检测β2AR基因编码区核苷酸46位的非同义 等位基因变异体(A/G)的探针和引物，其用于筛选印度人种哮喘病人的该药物反 应。

本发明的另一个目的是研究β2AR基因多态性和哮喘之间的关系。

发明概要

本发明公开了印度人种中肾上腺素能受体基因(β2AR基因)，亚型β2中的十 个多态基因座的基因型和单元型。本发明涉及用于预测对于β激动剂(β激动剂) 的支气管扩张反应的方法。本发明对于印度人种是特别有益的。本发明提供了一种 用于检测β2AR基因中的等位基因变异体(基因型)的方法，其对于用于支气管扩 张的β2激动剂的关键靶体是可靠的。本发明对于开发一种用于预测个体药物反应的 诊断试剂盒是有用的。已经确定了人类染体5q31上β2AR基因编码区中的几种错 义多态性。本发明还公开了对药物反应有效的、用于检测β2AR基因中特定等位基 因变异体的特定引物和探针。

发明的详细说明

β2AR是哮喘病中用于支气管扩张的β2激动剂的关键靶体。反应者和非 反应者病人样本的该基因编码区(只有一个外显子)的直接测序导致发现了 与药物反应有关的非同义多态性。在个体中，编码精氨酸的密码子AGA变 成编码甘氨酸的GGA。如果非同义多态性存在于反应者/非反应者个体纯合 子状态中，则可能导致支气管扩张的变化。因为β2AR基因的外显子区的非 同义多态性与哮喘病中的支气管扩张有关，所以这导致发现了与易感性变化 有关的哮喘病人中的非同义多态性。已经发现，这一多态性预测体内易感性 的变化。进一步，几个哮喘病人(反应者和非反应者)的基因分型表现了与 对β2激动剂反应变化的显著相关。这些结果构成了单核苷酸多态性与对β2 激动剂反应变化的相关性的例证。

本发明还提供了适用于检测与药物反应有关的β2AR基因多态性的寡核 苷酸序列(如SEQ ID NO：2，3，4，5，6，7，8和9)。

本发明还包括预测对于β激动剂的个体反应的诊断试剂盒，该试剂盒包 括一套特定引物或探针，以及需要的缓冲液和适于鉴定β2AR基因多态性的 附属品，用以估测对于β2激动剂的个体反应。

另外，本发明的主要实施方式涉及，一种用于预测和检测哮喘病患者对 于β2激动剂的支气管扩张反应的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)通过适当途径给予患者药学活性剂量的已知和速效的β2激动剂，

(b)对哮喘患者对于β2激动剂的表型良好反应者和不良反应者进行鉴 定和归类，

(c)从患有哮喘的反应者、非反应者和正常个体的血液样品中分离基 因组DNA，

(d)设计并合成能够扩增与哮喘有关的β2AR基因或基因座编码区的、 具有SEQ ID No.2和3的寡核苷酸引物，

(e)使用SEQ ID No.2和3，扩增表型上属于反应者和非反应者哮喘病 人的基因组DNA，

(f)对步骤(e)中获得的扩增的PCR产物进行测序，并通过与β2AR 基因或基因座的已知序列的计算比较，对经测序的、步骤(e)中 获得的PCR产物的非同义多态性或单核苷酸多态性(SNP)进行 鉴定，来检测特定β2AR等位基因变异体，

(g)设计具有SEQ ID No.4和5的寡核苷酸引物，直至步骤(f)中鉴 定的非同义多态性或单核苷酸多态性(SNP)的倒数第二位，筛选 反应者和非反应者哮喘个体的46位多态性(其与本发明公开的每 个SEQ ID No.1的碱基位置857相同)，来检测β2AR基因座或基 因的特定SNP，所述过程包括下述PCR条件：

(i)96℃，分离得到的DNA变性10秒，

(ii)55℃，使用SEQ ID No.4和5的引物对步骤(i)中 变性的DNA退火5秒，

(iii)60℃，将步骤(ii)中退火后的DNA延伸30秒，

(h)使用具有SEQ ID No.6，7，8和9的等位基因特定寡核苷酸引物， 验证正常对照个体和步骤(g)中获得的哮喘病人(包括反应者和 非反应者)中SNP或特定β2AR等位基因变异体的存在，其中所 述寡核苷酸引物特异性地与靶SNP或特定β2AR等位基因变异体 杂交，其中哮喘病人中，该靶SNP或特定β2AR等位基因变异体 具有β2AR基因或基因座的46位(其与本发明公开的每个SEQ ID No.1的碱基位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替换。

本发明的另一个实施方式涉及，一种检测和预测哮喘患者的β2AR基因 的特定等位基因变异体或单核苷酸多态性(SNP)的方法，所述方法包括以 下步骤：

a.通过适当途径给予患者药学活性剂量的已知的而非速效的β2激 动剂，

b.对哮喘患者对于β2激动剂的表型良好反应者和不良反应者进行 鉴定和归类，

c.从患有哮喘的反应者、非反应者和正常个体的血液样品中分离基 因组DNA，

d.设计并合成能够扩增与哮喘有关的β2AR基因编码区的、具有SEQ ID No.2和3的寡核苷酸引物，

e.使用SEQ ID No.2和3，扩增表型上属于反应者和非反应者哮喘病 人的基因组DNA，

f.对步骤(e)中获得的扩增的PCR产物进行测序，并通过与β2AR 基因或基因座的已知序列计算比较，对经测序的步骤(e)中获得 的PCR产物的非同义多态性或SNP进行鉴定，来检测特定β2AR 等位基因变异体，

g.设计具有SEQ ID No.4和5的寡核苷酸引物，直至步骤(f)中鉴 定的非同义多态性或单核苷酸多态性(SNP)的倒数第二位，筛 选反应者和非反应者哮喘个体的46位多态性(其与本发明公开的 每个SEQ ID No.1的碱基位置857相同)，来检测β2AR基因座或 基因的特定SNP，所述过程包括下述PCR条件：

(i)96℃，将分离得到的DNA变性10秒，

(ii)55℃，使用SEQ ID No.4和5的引物对步骤(i)中 变性的DNA退火5秒，

(iii)60℃，将步骤(ii)中退火后的DNA延伸30秒，

h.使用具有SEQ ID No.6，7，8和9的等位基因特定寡核苷酸引物， 验证正常对照个体和步骤(g)中获得的哮喘病人(包括反应者和 非反应者)中SNP或特定β2AR等位基因变异体的存在，其中哮 喘病人中，该靶SNP或特定β2AR等位基因变异体具有β2AR基 因或基因座的46位(其与本发明公开的每个SEQ ID No.1的碱基 位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替换。

本发明的另一个实施方式涉及，一种制备用于检测和预测哮喘病患者对 于β2激动剂的支气管扩张反应的药物遗传学标记物的方法，所述方法包括 以下步骤：

(a)通过适当途径给予患者药学活性剂量的已知和速效的β2激动剂，

(b)对哮喘患者对于β2激动剂的表型良好反应者和不良反应者进行鉴 定和归类，

(c)从患有哮喘的反应者、非反应者和正常个体的血液样品中分离基 因组DNA，

(d)设计并合成能够扩增与哮喘有关的β2AR基因或基因座编码区的、 具有SEQ ID No.2和3的寡核苷酸引物，

(e)使用SEQ ID No.2和3，扩增表型上属于反应者和非反应者哮喘病 人的基因组DNA，

(f)对步骤(e)中获得的扩增的PCR产物进行测序，并通过与β2AR 基因或基因座的已知序列计算比较，对经测序的步骤(e)中获得 的PCR产物的非同义多态性或单核苷酸多态性(SNP)进行鉴定， 来检测特定β2AR等位基因变异体，

(g)设计具有SEQ ID No.4和5的寡核苷酸引物，直至步骤(f)中鉴 定的非同义多态性或单核苷酸多态性(SNP)的倒数第二位，筛选 反应者和非反应者哮喘个体的46位多态性(其与本发明公开的每 个SEQ ID No.1的碱基位置857相同)，来检测β2AR基因座或基 因的特定SNP，所述过程包括下述PCR条件：

(i)96℃，将分离得到的DNA变性10秒，

(ii)55℃，使用SEQ ID No.4和5的引物对步骤(i)中 变性的DNA退火5秒，

(iii)60℃，将步骤(ii)中退火后的DNA延伸30秒，

(h)使用具有SEQ ID No.6，7，8和9的等位基因特定寡核苷酸引物， 验证正常对照个体和步骤(g)中获得的哮喘病人(包括反应者和 非反应者)中SNP或特定β2AR等位基因变异体的存在，其中哮 喘病人中，该靶SNP或特定β2AR等位基因变异体具有β2AR基 因或基因座的46位(其与本发明公开的每个SEQ ID No.1的碱基 位置857相同)核苷酸A至G(A→G)的替换和作为药物遗传学 标记物的作用。

本发明的另一个实施方式涉及，用于检测和预测哮喘患者对β激动剂的 支气管扩张反应的新颖的药物遗传学标记物，所述标记物由以下组成：

a)具有SEQ ID No.2和3的寡核苷酸引物

b)具有SEQ ID No.4和5的寡核苷酸引物

c)具有SEQ ID No.6，7，8和9的寡核苷酸引物

本发明的另一个实施方式涉及，一种用于预测和检测哮喘病人对β激动 剂的支气管扩张反应的诊断试剂盒，所述试剂盒包括：

(a)用于β2AR基因标记物区扩增的、具有SEQ ID No.2和3的第一套 寡核苷酸引物，

(b)用于非同义多态性或单核苷酸多态性(AGA至GGA)基因分型的、

具有SEQ ID No.4和5的第二套引物，所述过程包括下述PCR条件：

a)(i)96℃，将分离得到的DNA变性10秒，

b)(ii)55℃，使用SEQ ID No.4和5的引物对步骤(i)中 变性的DNA退火5秒，

c)(iii)60℃，步骤(ii)中的退火DNA延伸30秒，

(c)用于验证正常对照个体和步骤(g)中获得的哮喘病人(包括反应 者和非反应者)存在SNP或特定β2AR等位基因变异体的、具有 SEQ ID No.6，7，8和9的第三套引物，其中该靶SNP或特定β2AR 等位基因变异体具有哮喘病人β2AR基因或基因座的46位(其与本 发明公开的每个SEQ ID No.1的碱基位置857相同)核苷酸A至G (A→G)的替换和作为药物遗传学标记物的作用。

本发明的另一个实施方式涉及患者，其中该患者是人类。

本发明的另一个实施方式涉及β2激动剂，其中该β2激动剂是沙丁胺醇。

本发明的另一个实施方式涉及药学活性剂量的β2激动剂，沙丁胺醇， 其中该药学活性剂量的β2激动剂，沙丁胺醇在约100到约250μg的范围内。

本发明的另一个实施方式涉及药学活性剂量的β2激动剂，沙丁胺醇， 其中该药学活性剂量的β2激动剂，沙丁胺醇为约200μg。

本发明的另一个实施方式涉及药学活性剂量的β2激动剂，沙丁胺醇， 其中该药学活性剂量的β2激动剂，沙丁胺醇为通过吸入剂释药。

本发明的另一个实施方式涉及寡核苷酸引物，其中适于扩增β2AR编码 区的该寡核苷酸引物选自组成如下的组：

(a)5’TCTGGGTGCTTCTGTGTTTGTTTC3’(SEQ ID No：2正向引物)

(b)5’ACGATGGCCAGGACGATGAGA3(SEQ ID NO：3反向引物)。

本发明的另一个实施方式涉及寡核苷酸引物，其中适于扩增被检测的非 同义多态性或SNP的该寡核苷酸引物选自组成如下的组：

(a)5’GCC TTC TTG CTG GCA CCC AAT 3’(SEQ ID NO：4)正向引 物

(b)5’CGTGGTCCGGCGCATGGCTTC 3’(SEQ ID NO：5)反向引物。

本发明的另一个实施方式涉及PCR循环的次数，其中进行PCR的次数 为37。

本发明的另一个实施方式涉及寡核苷酸引物，其中适于验证β2AR基因 或基因座的SNP或等位基因变异体的寡核苷酸引物选自组成如下的组：

(a)5’GCACCCAATAGAAGCCATG 3’(SEQ ID NO：6)正向引物

(b)5’CATGGCTTCTATTGGGTG C 3’(SEQ ID NO：7)反向引物

(c)5’GCACCCAATGGAAGCCATG 3’(SEQ ID NO：8)正向引物

(d)5’CATGGCTTCCATTGGGTG C 3’(SEQ ID NO：9)反向引物。

本发明的另一个实施方式涉及合成的寡核苷酸引物的长度，其中，合成 的寡核苷酸引物和探针的长度在5～100碱基的范围。

本发明的另一个实施方式涉及合成的寡核苷酸引物的长度，其中，合成 的寡核苷酸引物和探针的长度在8～24碱基的范围。

本发明的另一个实施方式涉及基因型，其中基因型GG与对沙丁胺醇的 良好反应者有关，基因型AA与对沙丁胺醇的不良反应者有关。

本发明的另一个实施方式对于开发适合非反应者哮喘病人的、用于引发 支气管扩张的剂是有用的。

本发明的另一个实施方式涉及先进方法，其中该先进方法提供了用于预 测和检测人类β2AR基因或基因座的单个等位基因变异体的标记物、引物和 探针。

本发明的另一个实施方式涉及药物遗传学标记物，其中该药物遗传学标 记物与β2AR基因或基因座的单个特定等位基因变异体或单核苷酸多态性 (SNP)有关。

本发明的另一个实施方式涉及非同义多态性或SNP，其中被鉴定的非同 义多态性或SNP或特定的单个β2AR等位基因变异体作为药物遗传学标记物 发挥作用。

本发明的另一个实施方式涉及标记物，其中标记物/具有SEQ ID No.2和 3的寡核苷酸引物能够扩增β2AR基因的编码区。

本发明的另一个实施方式涉及标记物，其中标记物/具有SEQ ID No.4和 5的寡核苷酸引物能够筛选和鉴定反应者和非反应者哮喘个体的46位多态性 (其与本发明公开的每个SEQ ID No.1的碱基位置857相同)，从而检测β2AR 基因的特定SNP。

本发明的另一个实施方式涉及标记物，其中标记物/具有SEQ ID No.6，7， 8和9的寡核苷酸引物能够验证正常对照个体和哮喘病人(包括反应者和非 反应者)存在SNP或特定等位基因β2AR或基因座变异体。

本发明的另一个实施方式涉及试剂盒，其中所述试剂盒用于鉴定适合非 反应者哮喘病人的、用于引发支气管扩张的剂。

本发明的另一个实施方式涉及试剂盒，其中该试剂盒方法提供了用于预 测和检测人类β2AR基因座单个等位基因变异体的标记物、引物和探针。

本发明的另一个实施方式涉及试剂盒，其中被鉴定的非同义多态性或 SNP或特定单个β2AR等位基因变异体作为药物遗传学标记物发挥作用。

本发明的另一个实施方式涉及试剂盒，其中，该试剂盒为特定的单个 β2AR等位基因变异体或SNP或非同义多态性，其作为对于β2激动剂的药物 遗传学标记物发挥作用。

本发明的另一个实施方式涉及试剂盒，该试剂盒进一步包括使用该寡核 苷酸和基于β2AR基因变异体AA或GG基因型的反应类型归属的用法说明 书。

附图说明

图1a：表示β2AR基因中包括非同义多态性的全部SNP的示意图。

图1b：用于整个β2AR基因区域的PCR扩增的引物。

图1c：SNP的定位和印度人种中β2AR基因区域的连锁不平衡的鉴定。

图1d：表示46位核苷酸的A/G的多态性(基因型)的分布。

图2a：与具有SEQ ID No.6的等位基因特定引物杂交表示存在A。

图2b：与具有SEQ ID No.7的等位基因特定引物杂交表示存在A。

图2c：与具有SEQ ID No.8的等位基因特定引物杂交表示存在G。

图2d：与具有SEQ ID No.9的等位基因特定引物杂交表示存在G。

以说明本发明的方式给出以下实施例，其不限制本发明的范围。

实施例

实施例1

种研究：吸入的β2激动剂引起的气道反应的测量

作为本发明的第一步，申请人通过为病人施加短效β激动剂如沙丁胺醇 进行研究，其表现多种程度的反应，为了进行更多的分类研究，我们根据病 人对沙丁胺醇的反应程度把病人分为良好反应者和不良反应者。沙丁胺醇可 以口服，或者更普遍地使用吸入装置。吸入剂保证很小剂量的药物被直接传 递到肺部。哮喘的诊断是根据与该疾病相符的迹象和症状的阳性历史和通过 可逆的气道阻塞物的存在而做出的。所有病人都接受了常规的实验室诊断试 验和肺功能试验(PFT)，以排除其他可能的胸部疾病。在肺活量试验中，进 行最少三种可接受的方案并选择“最佳-试验(best-test)”曲线(“最佳-试验” 曲线定义为符合美国胸科协会(American Thoracic Society)规定的可接受标 准并给出FVC和FEV1的最大和的试验)。表现气道阻塞迹象的病人被给予 200mg沙丁胺醇(β2肾上腺素能激动剂)，并且在20分钟后重复该试验。该 做法用来评定气道阻塞可逆性的程度。同样的程序在两周多的期间内重复2-3 次，并且选择FEV1中年龄变化百分比的最佳值，用于将哮喘病人分为对沙 丁胺醇的良好、不良或非反应者。

实施例2

II.β2AR基因多态性的鉴定：

本发明人等在印度人种中鉴定了β2AR基因的5′上游和编码序列的邻近 区域的10个多态性位点(表2)。该发现与Drysdale等人(2000)报道发现 的13个多态性位点是不同的。

表3表示的7个单元型对是由使用了Clark运算法则(Clark，1990)范 围的非定相基因型(unphased genotype)评估的，其中单元型是直接指所有 位点均为纯合子或最多一个可用位点为杂合子的个体。

实施例3

III.作为药物反应指示(dicatator)的本发明的单个多态性：

本申请人等使用寡核苷酸引物进行了人类β2AR基因外显子区的PCR扩 增。这些引物是根据美国能源部联合基因组研究所(DOE Joint Genome Institute)和斯坦福人类基因组中心(Stanford Human Genome Center) (1999-10-6)(GenBank accession number-AC011354)提出的人类β2AR基因 序列设计的。纯化的PCR产物的测序表明，人类β2AR基因外显子区域的纯 合子非同义多态性与支气管扩张有关。

本发明提供了人类β2AR基因的等位基因变异体的序列，其包括数据库 中(GenBank Accession No.-AC011354)与药物反应有关的人类β2AR基因的 外显子区域的纯合子非同义多态性。

表1

位点的变化与使用人类β2AR基因邻接外显子区域(GenBank accession number-AC011354)的引物(SEQ ID No.2和3)获得的PCR产物序列是一 致的。

A→G的替换使精氨酸变为甘氨酸，结果导致了人类β2AR基因外显子 区域的等位基因变异体的核苷酸序列。使用邻接SEQ ID No.1的人类β2AR 基因外显子区的非同义多态性的SEQ ID No.2和3引物，获得了包括该非同 义多态性的PCR产物序列。

上述序列中核苷酸857位的多态性位点(A*)与数据库GenBank accession number-AC011354)中核苷酸46位相当。根据使用邻接人类β2AR 基因外显子区的引物(SEQ ID No.2和3)得到的PCR产物，使用引物检测 857位多态性(表1)。

实施例4

IV.药物反应的相关性分析

本发明人等发现，通过对β2AR基因核苷酸46位的唯一多态性位点的基 因分型，可以高可信度地预测印度人种中病人对沙丁胺醇的支气管扩张反应。 几个哮喘病人(反应者和非反应者)的进一步基因分型显示，其具有与对β 激动剂的反应变化的显著相关性。这些结果组成了单个多态性与对β激动剂 的易感性变化有关的第一个示例。纯合子Arg16和纯合子Gly16表现出与印 度人种中不良和良好反应的关系(图1d)。此外，由于其他(Martinez等人， 1997)研究中，使用了很少数的有阳性支气管扩张反应的Arg16纯合子哮喘 病人和有负性支气管扩张反应的哮喘病人，潜在的人种混淆，轻度的儿科哮 喘病人，而使其与这里描述的本发明人的研究之间是没有可比性的，本发明 利用的是具体的印度哮喘病人，更大数量的哮喘病人和具有一定哮喘严重程 度的成年印度患者。这些申请人没有发现与印度人种哮喘有关的β2AR基因 SNP。

实施例5

V.诊断试剂盒：

本发明进一步提供了用于预测对β激动剂的个体反应的诊断试剂盒，其 包括：

SEQ ID No.2和3的PCR扩增引物，

SEQ ID No.4和5的快照(snapshot)引物，

选自SEQ ID No.6，7，8和9寡核苷酸的至少一种等位基因特定寡核苷 酸。

适合PCR或杂交反应的缓冲液。

等位基因特定寡核苷酸可被选择性地提供作为固定的底物，其能够用于 检测β2AR基因多态性。试剂盒的随意附加组成包括，例如，限制性酶，聚 合酶，底物核苷三磷酸，用于标记的工具(例如，如果标记为生物素时的抗 生物素蛋白酶结合和酶底物和原体)。

实施例6

吸入的β2激动剂引起的气道反应的测量

哮喘的诊断是根据与该疾病相符的迹象和症状的阳性历史和通过可逆 的气道阻塞物的存在而做出的。所有病人都接受了常规的实验室诊断试验和 肺功能试验(PFT)，以排除其他可能的胸部疾病。在肺活量试验中，进行最 少三种可接受的方案，选择“最佳-试验”曲线(“最佳-试验”曲线定义为符 合美国胸腔协会(American Thoracic Society)规定的可接受标准并给出最大 总和的FVC和FEV1的试验)。表现气道阻塞迹象的病人被给予200mg沙丁 胺醇(β2肾上腺素能激动剂)，并且在20分钟后重复该试验。该做法用于评 定气道阻塞可逆性的程度。同样的程序在两周多的期间内重复2-3次，并且 FEV1中％年龄最佳值的变化被选择用于，将哮喘病人分为对沙丁胺醇的良 好、不良或非反应者。

实施例7

β2AR基因多态性的鉴定：

本发明人等在印度人种中鉴定了β2AR基因的5′上游和编码序列的邻近 区域的10个多态性位点(表2)。举例说明了从ATG起始位点上游的1581 碱基对至ATG起始位点下游的750碱基对的10个多态性位点。Drysdale等 人(2000)发现的13个多态性位点与我们发现的在印度人种中仅10个位点 是不同的。表3中表示的7个单元型对是由使用了Clark运算法则(Clark， 1990)范围的非定相基因型评估的，其中单元型是直接指所有位点均为纯合 子或最多一个可用位点为杂合子的个体。

β2AR基因的重叠部分是使用以下引物从哮喘病人和正常印度个体的基 因组DNA中扩增的，具有与GeneBank Accession No.AC011354相应的指示 位置。

部分1

引物位置是以起始密码子为+1的第一核苷酸为基础的。

正向引物：nt-1472至-1448

反向引物：nt-530至-548的补体

942 nt产物(-1472至-530)

部分2

正向引物(SEQ ID No.2)：nt-811至-787

反向引物(SEQ ID No.3)：nt+143至+122的补体

954 nt产物(-811至+143)

部分3

正向引物(5)：nt+126至+148

反向引物(6)：nt+721至+699的补体

595 nt产物(+721至+126)

表2：印度人种β2AR基因中鉴定的多态性

表3：此表中表示的7个单元型对是由使用了Clark运算法则(Clark， 1990)范围的非定相基因型评估的，其中单元型是直接指所有位点均为纯合 子或最多一个可用位点为杂合子的个体。

    -1023  -6.54 -468 -367 -47 -20   46   79   252  523

1.  A     G     G    C    C    C    G    G    G    C

2.  G     A     C    T    T    T    A    C    G    C

3.  G     A     C    T    T    T    G    C    G    C

4.  G     G     C    T    T    T    G    C    A    A

5.  G     A     C    T    T    T    A    C    A    A

6.  G     G     C    T    T    T    G    C    A    C

7.  G     G     C    T    T    T    G    C    G    C

实施例8

β2AR基因非同义多态性的鉴定：

本实施例描述，通过根据本发明的PCR及测序，使用一定寡核苷酸引物 对β2AR基因外显子区域的非同义多态性进行鉴定。

使用盐析方法(Miller等人，1988)从外周血液中分离基因组DNA。通 过测量样品在160nm波长下的吸光度来确定该DNA的浓度。然后使用寡核 苷酸引物2和3(SEQ ID No.2和3)通过聚合酶链反应对来自哮喘病人的 DNA进行扩增。每50μl PCR反应包括10x PCR缓冲液(含有100mM Tris(pH9.0)，500mM KCl，和0.1％明胶)中的DNA 200ng，寡核苷酸引物2 和3(SEQ ID No.2和3)各20pmol，1.8单位的Taq聚合酶(Bangalore Genei)， 和200mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。

样品在94℃变性5分钟，37个变性(94℃，45秒)，退火(56℃，1分 钟)，延伸(72℃，1.2分钟)循环，并最后在Perkin Elmer GeneAmp PCR System 9600中于72℃延伸10分钟。该反应产生954个碱基的DNA片段。利用聚 乙二醇/醋酸钠溶液(含有PEG8000，1M氯化镁和3M无水醋酸钠，pH-4.8) 纯化该PCR产物，并且在使用末端标记化学(dye terminator chemistry)的 ABI Prism 3100 DNA自动测序仪上可以直接对该PCR产物进行测序。发现 该PCR产物与数据库(Accession Number-AL022326)中的β2AR基因外显 子的序列是相同的。使用Factura and Sequence Navigator软件程序将序列归 为相应的野生型序列。

实施例9

筛选种中的多态性：

本实施例描述用于筛选单核苷酸变异体的引物的延伸反应。如实施例2 所述，通过PCR对来自几个哮喘病人(反应者/非反应者)和几个正常受试 者的DNA样品进行扩增，并将PCR产物纯化。该引物延伸反应是使用寡核 苷酸引物和快照(snapshot)ddNTP引物延伸试剂盒(PE生物系统)对纯 化后的PCR产物进行的。该快照(snapshot)设备广泛用于分子研究，而且 在多态基因座的确切的碱基特性确定中是很有用的。虽然，所有研究中的全 部快照(snapshot)方案的基础方法学都是相同的。但是，每个快照(snapshot) 草案本身是唯一的。这是因为每个草案是基因座特定的。因此，必须开发和 发明用于鉴定特定基因座的特定工作草案。换言之，本发明中开发的使用快 照(snapshot)设备的该反应和PCR条件与其他任何用于其他任何疾病基因 座的快照(snapshot)设备是不同的。这意味着，已经建立了本发明中给出 的快照(snapshot)设备的新颖的特定草案，其用于特定基因座即β2AR基因 座。只有使用特殊设计和开发的具有SEQ ID No.4和5的引物时，该草案才 发挥作用。该寡核苷酸引物被设计直至突变的倒数第二位，并且通过一个 ssNTP延伸该引物，其与现存的等位基因变异体是一致的。该反应为在Perkin Elmer Gene Amp PCR System 9600中，使用SEQ ID No.4和5的引物进行的 30个(96℃，10秒)，退火(55℃，5秒)，延伸(60℃，30秒)的变性循环。 用牛肠碱性磷酸酶(新英格兰生物实验室(New Ingland Biolabs))处理该引 物延伸产物，除去未结合的二脱氧核苷酸。在ABI Prism 3100 DNA自动测序 仪上对该产物测序。凭借荧光标记的已结合的二脱氧核苷酸的颜，检测 β2AR基因的野生型和多态性等位基因。

实施例10

β2AR基因等位基因变异体的核苷酸序列：

该β2AR基因等位基因变异体的核苷酸序列是使用实施例2所述的方法 得到的。

(SEQ ID No.1)

5’ GTT CGG AGT ACC CAG ATG GAG ACA TCC GTG TCT GTG TCG

CTC TGG ATG CCT CCA AGC CAG CGT GTG TTT ACT TTC TGT GTG TGT

CAC CAT GTC TTT GTG CTT CTG GGT GCT TCT GTG TTT GTT TCT GGC

CGC GTT TCT GTG TTG GAC AGG GGT GAC TTT GTG CCG GAT GGC

TTC TGT GTG AGA GCG CGC GCG AGT GTG CAT GTC GGT GAG CTG

GGA GGG TGT GTC TCA GTG TCT ATG GCT GTG GTT CGG TAT AAG

TCT GAG CAT GTC TGC CAG GGT GTA TTT GTG CCT GTA TGT GCG

TGC CTC GGT GGG CAC TCT CGT TTC CTT CCG AAT GTG GGG CAG

TGC CGG TGT GCT GCC CTC TGC CTT GAG ACC TCA AGC CGC GCA

GGC GCC CAG GGC AGG CAG GTA GCG GCC ACA GAA GAG CCA AAA

GCT CCC GGG TTG GCT GGT AAG GAC ACC ACC TCC AGC TTT AGC

CCT CTG GGG CCA GCC AGG GTA GCC GGG AAG CAG TGG TGG CCC

GCC CTC CAG GGA GCA GTT GGG CCC CGC CCG GGC CAG CCC CAG

GAG AAG GAG GGC GAG GGG AGG GGA GGG AAA GGG GAG GAG

TGC CTC GCC CCT TCG CGG CTG CCG GCG TGC CAT TGG CCG AAA

GTT CCC GTA CGT CAC GGC GAG GGC AGT TCC CCT AAA GTC CTG

TGC ACA TAA CGG GCA GAA CGC ACT GCG AAG CGG CTT CTT CAG

AGC ACG GGC TGG AAC TGG CAG GCA CCG CGA GCC CCT AGC ACC

CGA CAA GCT GAG TGT GCA GGA CGA GTC CCC ACC ACA CCC ACA

CCA CAG CCG CTG AAT GAG GCT TCC AGG CGT CCG CTC GCG GCC

CGC AGA GCC CCG CCG TGG GTC CGC CCG CTG AGG CGC CCC CAG

CCA GTG CGC TTA CCT GCC AGA CTG CGC GCC ATG GGG CAA CCC

GGG AAC GGC AGC GCC TTC TTG CTG GCA CCC AAT A*GA AGC CAT

GCG CCG GAC CAC GAC GTC ACG CAG CAA AGG GAC GAG GTG TGG

GTG GTG GGC ATG GGC ATC GTC ATG TCT CTC ATC GTC CTG GCC ATC

GTG TTT GGC AAT GTG CTG GTC ATC ACA GCC ATT GCC AAG TTC

GAG CGT CTG CAG ACG GTC ACC AAC TAC TTC ATC ACT TCA CTG

GCC TGT GCT GAT CTG GTC 3’

实施例11

非同义多态性与药物反应的相关性

非同义SNP或多态性定义为“改变的编码并不相当于野生型序列的氨基 酸，即导致了不同氨基酸的编码区的替换”。

这里本发明人等发现，通过对β2AR基因核苷酸46位的唯一多态性位点 的基因分型，可以高可信度地预测印度人种中病人对沙丁胺醇的支气管扩张 反应。几个哮喘病人(反应者和非反应者)的进一步基因分型显示出具有与 对β2激动剂的变化的反应的显著关联性。这些结果组成了单个多态性单独 与对β2激动剂的变化的易感性有关的第一个示例。纯合子Arg16和纯合子 Gly16表现出与印度人种中不良和良好反应的关系(图1d)。此外，由于其他 (Martinez等人，1997)研究使用了很少数的有阳性支气管扩张反应的ARG16 纯合子哮喘病人和有负性支气管扩张反应的哮喘病人，潜在的人种混淆，轻 度的儿科哮喘病人，而使其与这里描述的本发明人的研究之间是没有可比性 的，本发明利用的是具体的印度哮喘病人，更大数量的哮喘病人和具有一定 哮喘严重程度的成年印度患者。这些申请人没有发现与印度人种哮喘有关的 β2AR基因的SNP。

具有AA基因型的病人有0.76的可能性是不良反应者，具有GG基因型 的病人有0.72的可能性是良好反应者。

印度人种中，反应者对沙丁胺醇的状况和哮喘病人的β2AR基因基因型 密切相关(x2＝11.28，df＝2，p＝0.004)。

实施例12

为了验证核苷酸46位的多态性，建立了特定序列寡核苷酸(SSO)的杂 交实验。该实验基于，通过聚合酶链反应(PCR)扩增关注的区域，将该PCR 产物印迹在尼龙薄膜上，随后与放射标记的SEQ ID No.6，7，8和9的引物 杂交。使用寡核苷酸引物2和3(SEQ ID No.2和3)通过聚合酶链反应扩增 来自哮喘病人的DNA。每50μl PCR反应包括在10x PCR缓冲液(含有100mM Tris(pH9.0)，500mM KCl，和0.1％明胶)中的DNA 200ng，寡核苷酸引物2 和3(SEQ ID No.2和3)各20pmol，1.8单位的Taq聚合酶(Bangalore Genei)， 和200mM脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)。

如上产生的PCR产物各1微升在1％琼脂糖凝胶上电泳，并转移到尼龙 薄膜上，并且在6X SSPE(NaCl 0.9M；NaH2PO4 70mM；EDTA 6mM)，0.5％ 十二烷基硫酸钠(SDS)，5X Denhardt’s，和100μg/ml鲑鱼精DNA中与核 苷酸46位特异性寡核苷酸引物(SEQ ID No.6，7，8和9的放射标记引物)杂 交。杂交是在每个寡核苷酸的严格的熔解温度条件下进行的，其由每个标准 草案确定。过滤器在室温下2X SSPE，0.1％SDS中清洗两次，每次10分钟， 在高于溶解温度2℃，6X SSPE，1％SDS中清洗一次，并暴露于射线自显影 装置下。分析曝光的射线照片的杂交点，其由包括46位SNP的序列的PCR 产物与放射标记的SEQ ID No.6，7，8和9等位基因特定引物的杂交产生。

放射标记的SEQ ID No.6，7，8和9等位基因特定引物的这些结果分别 显示在图2a，2b，2c，2d中。

图2a和2b中，两个产物带(lane)，每幅图中一个产物带，表示与SEQ ID No.6和7的等位基因特定引物的杂交点，其证实了核苷酸46位等位基因 A的存在，而图2a和2b中，与SEQ ID No.8和9的等位基因特定引物的杂 交点证实了核苷酸46位等位基因G的存在。