一种腰痛宁胶囊的质量控制方法

技术领域

本发明涉及一种中药的质量控制方法，特别涉及一种腰痛宁胶囊的质量控制方法。

背景技术

腰痛宁胶囊收载于《腰痛宁胶囊国家药品标准(修订)颁布件》(标准号WS3-B-3515-2006)，2006年3月在“卫生部药品标准中药成方制剂第十八册366页”标准的基础上修订经国家药监局批准的质量标准，现行的质量控制方法包括了5项鉴别(包括显微鉴别，马钱子，苍术、川牛膝、甘草的鉴别)；与的含量测定；的含量测定。

发明内容

本发明目的在于一种腰痛宁胶囊的指纹图谱质量控制方法。

本发明目的是通过如下技术方案实现的：

腰痛宁胶囊的指纹图谱为(如图8)：

腰痛宁胶囊的指纹图谱为：供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内，将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；标准指纹图谱为：以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对保留时间为：

1号峰：0.389±0.162；2号：0.575±0.253；3号峰：1；

4号峰：1.059±0.131；5号峰：1.151±0.268；6号峰：1.315±0.813；

7号峰：1.405±0.392；8号峰：1.987±0.248；9号峰：2.204±0.439；

10号峰：2.922±0.137；

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对峰面积为：

1号：0.063±0.047；2号：0.366±0.183；3号峰：1；

4号峰：0.416±0.101；5号峰：0.063±0.057；6号峰：0.153±0.074；

7号峰：0.131±0.086；8号峰：0.191±0.065；9号峰：0.090±0.036；

10号峰：0.305±0.138

腰痛宁胶囊的指纹图谱测定方法为如下方法中的一种：

A方法：

取本品内含物，混匀，取2.0g，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇25mL，再加入浓盐酸0.63mL，密塞，摇匀，称定重量，以功率450W，频率40kHz进行超声处理45分钟取出，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液10μl注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法(药典一部附录VI D)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的谱柱，以乙腈为流动相A，以含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分 钟，流动相A(乙腈)由8％～18％～98％～98％，流动相B(含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液)由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000。

对照品溶液的配制精密称取对照品适量，加制成每1ml含0.5mg的溶液，精密量取上述对照品溶液2ml，置10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，每1ml中含0.1mg；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得。

B方法：

取本品内含物，混匀，取2.0g，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇25mL，再加入0.63mL浓盐酸，称重，摇匀，超声提取，取出，放冷至室温，称重，加甲醇补足失重；取续滤液10ul注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法测定，HC-C18谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以0.2％甲酸和0.2％三乙胺混合溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A为：乙腈由8％～18％～98％～98％，流动相B为：0.2％甲酸和0.2％三乙胺混合溶液，由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000；

对照品溶液的配制精密称取对照品5mg，置50ml量瓶中，加10ml使溶解，加入甲醇至刻度，摇匀；用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得(每1ml中含0.1mg)；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得。

C方法：

取本品内含物，混匀，取2.0g，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇25mL，再加入0.63mL浓盐酸，称重，摇匀，450W，40KH超声提取45min，取出，放冷至室温，称重，加甲醇补足失重；取续滤液10ul注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法测定，4.6×250mm，5μ的HC-C18谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2％甲酸的0.2％三乙胺混合溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A为乙腈，由8％～18％～98％～98％，流动相B为0.2％甲酸和0.2％三乙胺的混合溶液，由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000；

对照品溶液的配制精密称取对照品5mg，置50ml量瓶中，加10ml使溶解，加入甲醇至刻度，摇匀；用0.45μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得每1ml中含0.1mg的对照品溶液；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得。

本发明腰痛宁胶囊配方原料药加入常规辅料，按照常规工艺，可以制成药学上可接受的胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液体制剂、散剂等各种制剂。

本发明药物组合物制剂的指纹图谱为：供试品谱图应与标准指纹图谱基本一 致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内，将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；标准指纹图谱为：以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对保留时间为：

1号峰：0.389±0.162；2号：0.575±0.253；3号峰：1；

4号峰：1.059±0.131；5号峰：1.151±0.268；6号峰：1.315±0.813；

7号峰：1.405±0.392；8号峰：1.987±0.248；9号峰：2.204±0.439；

10号峰：2.922±0.137；

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对峰面积为：

1号：0.063±0.047；2号：0.366±0.183；3号峰：1；

4号峰：0.416±0.101；5号峰：0.063±0.057；6号峰：0.153±0.074；

7号峰：0.131±0.086；8号峰：0.191±0.065；9号峰：0.090±0.036；

10号峰：0.305±0.138

本发明药物组合物制剂的指纹图谱测定方法为如下方法中的一种：

A方法：

取本发明药物组合物制剂1-4重量份，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇15-35体积份，再加入浓盐酸0.5-0.7体积份，密塞，摇匀，称定重量，以功率250-550W，频率30-50kHz进行超声处理30-80分钟，取出，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；取续滤液0.005-0.020体积份注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法(药典一部附录VI D)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A为：乙腈由8％～18％～98％～98％，流动相B为：0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液，由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000；对照品溶液的配制精密称取对照品适量，加制成每1ml含0.5mg的溶液；精密量取上述对照品溶液1-4体积份，置5-20ml的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，每1ml中含0.1mg；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.005-0.020体积份，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得；

B方法：

取本发明药物组合物制剂1-4重量份，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇15-35体积份，再加入浓盐酸0.5-0.7体积份，称重，摇匀，超声提取，取出，放冷至室温，称重，用甲醇补足失重；取续滤液0.005-0.020体积份注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法测定，HC-C18谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以0.2％甲酸和0.2％三乙胺混合溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A为：乙腈由8％～18％～98％～98％，流动相B为：0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液，由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000；

对照品溶液的配制精密称取对照品5mg，置50ml量瓶中，加10ml使溶解，加入甲醇至刻度，摇匀；用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得(每1ml中含 0.1mg)；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.005-0.020体积份，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得。

本发明药物组合物制剂的指纹图谱测定方法优选为如下方法中的一种：

A方法：

取本发明药物组合物制剂2重量份，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇25体积份，再加入浓盐酸0.63体积份，密塞，摇匀，称定重量，以功率450W，频率40kHz进行超声处理45分钟，取出，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过；取续滤液0.010体积份注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法(药典一部附录VID)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的谱柱，以乙腈为流动相A，以0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A为：乙腈由8％～18％～98％～98％，流动相B为：0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液，由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000；

对照品溶液的配制精密称取对照品适量，加制成每1ml含0.5mg的溶液。精密量取上述对照品溶液2体积份，置10体积份的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，其中每1ml中含0.1mg；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.010体积份，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得；

B方法：

取本发明药物组合物制剂2.0重量份，精密称定，置50体积份具塞三角瓶中，精密加入甲醇25体积份，再加入0.63体积份浓盐酸，称重，摇匀，超声提取，取出，放冷至室温，称重，加甲醇补足失重；取续滤液0.01体积份注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法测定，HC-C18谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，以乙腈为流动相A，以0.2％甲酸和0.2％三乙胺混合溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A为：乙腈由8％～18％～98％～98％，流动相B为：0.2％甲酸和0.2％三乙胺混合溶液，由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000；

对照品溶液的配制精密称取对照品0.005重量份，置50体积份量瓶中，加10体积份使溶解，加入甲醇至刻度，摇匀；用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得(每1ml中含0.1mg)。

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.01体积份，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得。

本发明所述的腰痛宁胶囊配方原料药组成为：

调制马钱子粉80-160重量份     土鳖虫15-32重量份

川牛膝15-32重量份            麻  黄15-32重量份

乳  香15-32重量份            没  药15-32重量份

僵  蚕15-32重量份            苍  术15-32重量份

全  蝎15-32重量份            甘  草15-32重量份。

本发明所述的腰痛宁胶囊配方原料药组成优选为：

调制马钱子粉160重量份  土鳖虫17.5重量份

川牛膝19重量份         麻  黄25重量份

乳  香26重量份         没  药18重量份

僵  蚕20重量份         苍  术27重量份

全  蝎28重量份         甘  草17重量份。

本发明所述的腰痛宁胶囊配方原料药组成优选为：

调制马钱子粉80重量份  土鳖虫23重量份

川牛膝24.5重量份      麻  黄17.5重量份

乳  香15重量份        没  药31重量份

僵  蚕29重量份        苍  术19重量份

全  蝎18重量份        甘  草26重量份。

本发明所述的腰痛宁胶囊配方原料药组成优选为：

调制马钱子粉120重量份 土鳖虫21重量份

川牛膝21重量份        麻  黄21重量份

乳  香21重量份        没  药21重量份

僵  蚕21重量份        苍  术21重量份

全  蝎21重量份        甘  草21重量份。

按药剂学方法，可以将上述原料药制备成各种临床或药学上可接受的剂型，包括但不限于如下剂型当中的一种如：胶囊剂、片剂、缓释片、控释片、口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂、胶浆剂、口服液、乳剂、胶体溶液、合剂、酊剂、滴剂、混悬滴剂、丸剂、滴丸、颗粒剂、肠溶颗粒剂、散剂、巴布膏剂或橡胶膏剂等。

其中，本发明的调制马钱子粉按照药典中的常规方法，或如下方法制备：每取制马钱子100重量份，粉碎成细粉，照中华人民共和国药典马钱子的含量测定项下方法测定含量后，加淀粉5-100重量份，使C21H22N2O2含量按干燥品计为1.09％～1.15％后，混匀，即制成调制马钱子粉。

本发明所述的重量份与体积份的比例为克/毫升。

本发明采用高效液相谱方法建立腰痛宁胶囊的指纹图谱，应用于腰痛宁胶囊生 产的全过程进行质量控制；采用药典会发布的相似度软件，将腰痛宁胶囊指纹图谱相似度阈值定为不得低于0.87。经实验证明该方法准确，可靠，可以最大限度的体现各组方药材的特征峰。

实验例1在波长选择上，通过研究初步确定了高效液相的波长范围，在210-260nm之间，继而使用HPLC/DAD对腰痛宁胶囊分析样品进行全波长扫描，根据DAD检测器在190～400nm全波长扫描图及其3D图和全波长2D叠加图，全波长扫描254nm处谱峰个数最多，溶剂背景低，干扰小，多数组分谱峰强度最大且分离情况较好，因此选择254nm作为腰痛宁胶囊指纹图谱的检测波长。

实验例2提取条件、提取时间、提取方式的优化

引入均匀设计的思想和方法，比较研究了六种提取溶剂组成：100％乙醇，70％乙醇，50％乙醇，30％乙醇，100％水，100％甲醇和甲醇加2.5％浓盐酸，在相同HPLC条件下进样分析比较，甲醇加2.5％浓盐酸提取谱峰数目和总峰面积最大，有利于腰痛宁胶囊特征信息表达，效果优于甲醇溶剂的提取，因此选用甲醇加2.5％浓盐酸为基本提取溶剂；比较了回流提取法、超声提取法、水提醇沉、渗滤以及混合提取方式等多种不同的提取方法，选用甲醇和盐酸作为提取条件，在相同HPLC条件下进样分析，采用功率为450W超声提取方式谱峰数和总峰面积同回流提取得到的指纹图谱相近，因为超声提取操作简单、时间短、重复性好，因此选用超声作为提取方式；同时还对提取时间(30、45、60、80、90、120min)进行了优化处理，选用超声提取45min(450W，40KH)，采用功率为450W超声提取时，提取时间45min后样品溶出达到稳态，45min与60min指纹图谱的峰个数及总峰面积基本相同。最后确定采用提取时间为45min。

实验例3谱分离条件的优化，考虑到腰痛宁胶囊处方中马钱子药材是君药，在处方中占有主导地位，同时马钱子具有毒性作用，是质量控制的重点。所以指纹图谱谱条件的优化目标设定为、这2个成分必须达到基线分离，同时需要兼顾其他成分谱峰，尽可能地体现最多的谱峰信息，在保证必要的分离效果情况下谱梯度条件尽可能简单，有利于指纹图谱获取的重复性和稳定性。研究过程中，分别选择乙腈(A)-水(B)和甲醇(A)-水(B)两种基本的流动相体系，比较结果显示，乙腈-水流动相体系获得的指纹图谱中谱峰数目和总峰面积最大，有利于腰痛宁胶囊特征信息表达，效果优于甲醇-纯水体系。研究中考察了在流动相中添加甲酸和三乙胺对谱分离的效果，初步试验提示在流动相中添加甲酸和三乙胺确实对谱分离具有明显的改善作用。流动相：乙腈为流动相A，含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液为流动相B；

进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A(乙腈)由8％～18％～98％～98％，流动相B(0.2％甲酸的0.2％三乙胺混合溶液)由92％～82％～2％～2％。

表1线性梯度洗脱时间程序

经过综合分析，最终确定指纹图谱条件为：取本品内含物，混匀，取2.0g，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇25mL，再加入0.63mL浓盐酸，称重，摇匀，超声提取45min(450W，40KH)取出，放冷至室温，称重，加甲醇补足失重。取续滤液10ul注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法(附录VI D)测定，HC-C18谱柱(4.6×250mm，5μ)，梯度洗脱，以乙腈为流动相A，以0.2％甲酸的0.2％三乙胺溶液为流动相B，梯度条件如表1；检测波长254nm；柱温25℃；流速为1ml/min。理论板数按峰计算应不低于6000。见附图1：方法学考察的共有峰。

实验例4方法学考察方面：

中药指纹图谱分析方法的精密度、重复性及稳定性的建立方法与常规分析测定相似。但在中药指纹图谱的应用中，这三者认定分为部分和整体两个方面，前者包括指标成分或共有峰的相对保留时间与相对积分面积的考察；后者为测定图谱之间的整体相似性考察。在研究过程中，分别对部分和整体两个方面进行了研究。

首先，对共有峰的相对积分面积进行了考察，具体分析如下：

以承德颈复康药业公司生产的腰痛宁胶囊成品为分析对象，以上图中的10个指纹峰为对象，考察了分析方法的精密度，重复性，及样品的稳定性。

1.精密度考察：主要考察仪器的精密度。取腰痛宁胶囊(批号：070121)供试品，按照腰痛宁胶囊指纹图谱的提取方法制备供试品，测定方法同腰痛宁胶囊指纹图谱方法。连续进样6，记录各共有谱峰的保留时间和积分面积，以的(3号峰，S)保留时间与积分面积为参照，换算出各共有峰的相对保留时间和相对积分4面积，以考察谱8峰的9相对保留时间、峰面积比值的一致性。结果表明方法采用的HPLC仪器及整体系统精密度良好，分析结果稳定、可信。按照相似度计算6次进样的相似度的RSD％＝0.08％。见附图2：指纹图谱精密度

表2腰痛宁胶囊指纹图谱方法精密度考察

2.重复性考察：按照前述方法，重复制备6份供试品溶液(080402)，进样分析，以峰面积为指标，考察方法的重复性，结果见表6。按照相似度计算6次进样的相似度的RSD％＝0.12％。见附图3：指纹图谱重复性

表3腰痛宁胶囊指纹图谱方法重复性考察

3.稳定性考察：主要考察供试品的稳定性。取同一批号(070402)的腰痛宁胶囊供试品，分别在48小时之内不同时间连续进样检测，记录各共有谱峰的保留时间和积分面积，以峰的保留时间与积分面积为参照，换算出各共有峰的相对保留时间和相对积分面积，考察谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。结果说明经制备的样品在常温实验条件下稳定性较好，在48h时间能保证实验结果的科学可靠，见表7和图32。按照相似度计算6次进样的相似度的RSD％＝0.10％，见附图4：稳定性。

表4 腰痛宁胶囊指纹图谱方法稳定性考察

其次，以10个指纹峰为对象，采用整体相似性方法对腰痛宁胶囊指纹图谱分析方法的精密度、重复性及稳定性进行了考察，结果如表所示。

表5腰痛宁胶囊指纹图谱方法学考察相似度计算结果

上述结果表明，无论是指标，整体相似度都具有较好的数据显示。腰痛宁胶囊指纹图谱测定方法具有可信的精密度和重复性，在48小时内样品稳定，可以获得可靠的指纹图谱。

4.在仪器的适用性上，比较了同一批样品(070124)，采用同一根谱柱在不同型号的高效液相谱仪上进行检测，采用指纹图谱相似度软件进行比较相似度。采用的高效液相谱仪包括：Agilent 1100，Agilent 1200，岛津-10A，waters。结果表明，在Agilent 1100，Agilent 1200，岛津-10A和waters高效液相谱仪上得到的谱图基本上一致，相似度达到0.95以上，说明本方法能适用于不同的液相谱仪。见附图5：在Agilent 1100，Agilent 1200，岛津-10A仪器上得到的图谱及附图6：在Waters高效液相谱仪上得到的谱图。

由于不同厂家仪器的泵流量精度、梯度混合方式、检测灵敏度、死体积大小等不同，而造成谱分离情况有异，同一谱峰在不同的仪器上保留时间有一定差异。虽然本方法对高效液相谱仪器具有较广泛的适用性，但是在选择测量仪器时仍然建议优先考虑与标准指纹图谱相一致，特别是谱仪的梯度滞后时间，以及泵的高压混合与低压混合的方式需要选择仪器时予以考虑。

5.在谱柱的适用性上，采用腰痛宁胶囊指纹图谱确立的样品提取方法，采用同一台高效液相谱仪(Agilent 1100)对同一个样品(070124)进行分析，在分析过程中更换不同的谱柱，型号为：A：Apollo(4.6×250mm，5um)；B：Agilent HC-C18(4.6×250mm，5um)；C：Agilent TC-C18(4.6×250mm，5um)；D：Interisl(4.6×250mm，5um)。对采集的图谱采用指纹图谱相似度软件进行处理，结果表明：采用同一台高效液相谱仪测定同一批样品时，结果基本一致，其中，以B：Agilent HC-C18(4.6×250mm，5um)效果最好。上述结果表明，Agilent HC-C18(4.6×250mm，5um)谱柱以及相同规格、性质相近的其它品牌的C18谱柱均有可能适用于腰痛宁胶囊指纹图谱的测定，但是为了保证腰痛宁指纹图谱具有更好的稳定性，推荐采用Agilent HC-C18(4.6×250mm，5um)谱柱。

6.对腰痛宁指纹图谱中指纹峰的归属进行了研究，腰痛宁胶囊的标准指纹图谱的特征共有峰的选择以经过谱峰归属性分析的21个谱峰(如下图)为基础，结合对40批腰痛宁胶囊成品指纹图谱的测定，按照在所有批次指纹图谱中均有的共有峰、且分离情况好、重复性和稳定性较好、有一定的药材代表性等原则，确定选择其中的10个谱峰作为对照指纹图谱的特征峰，分别对应21个谱峰的1号、3号、5号、6号、7号、10号、11号、15号、16号、21号，代表了马钱子、川牛膝、甘草、苍术等药材。其中原来对应于麻黄药材的2号谱峰，可能为麻黄碱和两种异构体的混合峰，另外由于麻黄生物碱的特征吸收在紫外末端吸收区(203nm)，在指纹图谱设定的检测波长254nm处响应较弱，重复性不理想，因此没有纳入到最终的指纹图谱10个共有特征峰中。相应地，已另行建立麻黄碱和的定量测定方法作为多指标成分定量质控指标，可与指纹图谱质控互为补充。见附 图7：确定指纹峰归属用图谱。

7.以本公司生产的15批腰痛宁胶囊产品生成了腰痛宁胶囊的标准指纹图谱。经试验证实，该指纹图谱具有良好的代表性。

典型指纹图谱的生成是通过一系列样品的指纹图谱研究，从中选择一个具有典型意义或有代表性的指纹图谱作为对照谱，或是把指纹图谱的共有峰的相对保留值作为对照，还可以采用数据(平均矢量或中位数矢量)综合所有样品信息的方法模拟生成的对照指纹图谱。

腰痛宁胶囊的对照指纹图谱采用多样本中位数矢量综合作为共有模式矢量，避免了多样本中超常样本的不良影响，使实验结果更加稳健可行。

利用确定的腰痛宁胶囊指纹图谱测定方法，以本公司生产的15批腰痛宁胶囊产品，以药典委指纹图谱软件为评价工具采用中位数的原则拟合生成对照指纹图谱，作为腰痛宁胶囊的标准指纹图谱。生成标准图谱如下。见附图8：《中药谱指纹图谱相似度评价系统》生成的对照指纹图谱。

为了确定腰痛宁胶囊指纹图谱相似度阈值的合理范围，对06年以后生产的48批腰痛宁胶囊产品进行了分析，说明本标准生成的指纹图谱能够较好的反映产品的质量。48批合格产品的指纹图谱相似度计算结果为0.867±0.044(平均值±SD)。综合考虑，将腰痛宁胶囊指纹图谱合格样品的相似度数值标准定为不低于0.87。见附图9：代表性的15批腰痛宁胶囊指纹图谱

表6 48批腰痛宁胶囊产品相似度测定结果

附图说明

图1：方法学考察的共有峰

图2：指纹图谱精密度

图3：指纹图谱重复性

图4：稳定性

图5：在Agilent 1100，Agilent 1200，岛津-10A仪器上得到的图谱

图6：在Waters高效液相谱仪上得到的谱图

图7：确定指纹峰归属用图谱

图8：《中药谱指纹图谱相似度评价系统》生成的对照指纹图谱

图9：代表性的15批腰痛宁胶囊指纹图谱

具体实施方式

实施例1：腰痛宁胶囊的指纹图谱测定

调制马钱子粉120g    土鳖虫21g

川牛膝21g           麻黄21g

乳香21g             没药21g

僵蚕21g             苍术21g

全蝎21g             甘草21g；

取原料药，加入常规辅料，按常规方法制成胶囊剂；

照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)，结合指纹图谱要求测定。

腰痛宁胶囊的指纹图谱测定方法为：取本品内含物，混匀，取2.0g，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇25mL，再加入浓盐酸0.63mL，密塞，摇匀，称定重量，以功率450W，40kHz进行超声处理45分钟取出，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液10μl注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法(药典一部附录VI D)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的谱柱，以乙腈为流动相A，以含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A(乙腈)由8％～18％～98％～98％，流动相B(含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液)由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000。

对照品溶液的配制精密称取对照品适量，加制成每1ml含0.5mg的溶液。精密量取上述对照品溶液2ml，置10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，其中每1ml中含0.1mg；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得。

指纹图谱及各项技术参数供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内。将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统(2004，1.0B版)，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；

腰痛宁胶囊的指纹图谱为：供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内，将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；标准指纹图谱为：

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对保留时间为：

1号峰：0.389±0.162；2号：0.575±0.253；3号峰：1；

4号峰：1.059±0.131；5号峰：1.151±0.268；6号峰：1.315±0.813；

7号峰：1.405±0.392；8号峰：1.987±0.248；9号峰：2.204±0.439；

10号峰：2.922±0.137；

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对峰面积为：

1号：0.063±0.047；2号：0.366±0.183；3号峰：1；

4号峰：0.416±0.101；5号峰：0.063±0.057；6号峰：0.153±0.074；

7号峰：0.131±0.086；8号峰：0.191±0.065；9号峰：0.090±0.036；

10号峰：0.305±0.138。

实施例2：本发明药物组合物片剂的制备

调制马钱子粉120g        土鳖虫21g    川牛膝21g

麻  黄21g               乳  香21g    没  药21g

僵  蚕21g               苍  术21g    全  蝎21g

甘  草21g；

取原料药，加入常规辅料，按常规方法制成片剂。

实施例3：本发明药物组合物口服液体制剂的制备

取调制马钱子粉80g  土鳖虫23g  川牛膝24.5g  麻黄17.5g  乳香15g  没药31g  僵蚕29g  苍术19g  全蝎18g  甘草26g，加入溶剂、矫味剂、乳化剂等辅料，按照常规工艺，制成口服溶液。

实施例4：本发明药物组合物缓释片剂的制备

取调制马钱子粉160g  土鳖虫17.5g  川牛膝19g  麻黄25g乳香26g  没药18g  僵蚕20g  苍术27g  全蝎28g  甘草17g，加入常规辅料，按常规方法制成缓释片。

实施例5：本发明药物组合物颗粒剂的制备

取调制马钱子粉154g   土鳖虫20g  川牛膝17.5g  麻黄23g乳香24.5g  没药19g  僵蚕18g  苍术26g  全蝎31g  甘草15g，加入常规辅料，按常规方法制成颗粒剂。。

实施例6：本发明药物组合物散剂的制备

取调制马钱子粉108g  土鳖虫24g  川牛膝32g  麻黄16g乳香17.5g  没药28g  僵蚕23g  苍术15g  全蝎20g  甘草30g，按照常规工艺制成散剂。

实施例7：本发明药物组合物滴丸的制备

取调制马钱子粉136g  土鳖虫19g  川牛膝15g  麻黄32g乳香28g  没药17.5g  僵蚕16g  苍术30g  全蝎23g  甘草18g，加入常规辅料，按常规方法制成滴丸。

实施例8：本发明药物组合物片剂的指纹图谱测定

照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)，结合指纹图谱要求测定。

本发明药物组合物片剂的指纹图谱测定方法为：

取实施例2制备的片剂2.5g，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇28mL，再加入浓盐酸0.68mL，密塞，摇匀，称定重量，以功率480W，45kHz进行超声处理60分钟取出，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液12μl注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法(药典一部附录VI D)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的谱柱，以乙腈为流动相A，以含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A(乙腈)由8％～18％～98％～98％，流动相B(含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液)由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000。

对照品溶液的配制精密称取对照品适量，加制成每1ml含0.5mg的溶液。精密量取上述对照品溶液3.5ml，置15ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，其中每1ml中含0.1mg；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各12μl，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得。

指纹图谱及各项技术参数供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内。将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统(2004，1.0B版)，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；

本发明药物组合物片剂的指纹图谱为：供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内，将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；标准指纹图谱为：

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对保留时间为：

1号峰：0.389±0.162；2号：0.575±0.253；3号峰：1；

4号峰：1.059±0.131；5号峰：1.151±0.268；6号峰：1.315±0.813；

7号峰：1.405±0.392；8号峰：1.987±0.248；9号峰：2.204±0.439；

10号峰：2.922±0.137；

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对峰面积为：

1号：0.063±0.047；2号：0.366±0.183；3号峰：1；

4号峰：0.416±0.101；5号峰：0.063±0.057；6号峰：0.153±0.074；

7号峰：0.131±0.086；8号峰：0.191±0.065；9号峰：0.090±0.036；

10号峰：0.305±0.138。

实施例9：本发明药物组合物滴丸的指纹图谱测定

照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)，结合指纹图谱要求测定。

本发明药物组合物滴丸的指纹图谱测定方法为：

取实施例7制备的滴丸3g，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇32mL，再加入浓盐酸0.7mL，密塞，摇匀，称定重量，以功率420W，38kHz进行超声处理55分钟取出，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液15μl注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法(药典一部附录VI D)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的谱柱，以乙腈为流动相A，以含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A(乙腈)由8％～18％～98％～98％，流动相B(含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液)由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000。

对照品溶液的配制精密称取对照品适量，加制成每1ml含0.5mg的溶液。精密量取上述对照品溶液3ml，置15ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，其中每1ml中含0.1mg；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各14μl，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得。

指纹图谱及各项技术参数供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内。将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统(2004，1.0B版)，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；

本发明药物组合物滴丸剂的指纹图谱为：供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内，将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；标准指纹图谱为：

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对保留时间为：

1号峰：0.389±0.162；2号：0.575±0.253；3号峰：1；

4号峰：1.059±0.131；5号峰：1.151±0.268；6号峰：1.315±0.813；

7号峰：1.405±0.392；8号峰：1.987±0.248；9号峰：2.204±0.439；

10号峰：2.922±0.137；

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对峰面积为：

1号：0.063±0.047；2号：0.366±0.183；3号峰：1；

4号峰：0.416±0.101；5号峰：0.063±0.057；6号峰：0.153±0.074；

7号峰：0.131±0.086；8号峰：0.191±0.065；9号峰：0.090±0.036；

10号峰：0.305±0.138。

实施例10：本发明药物组合物口服液体制剂的指纹图谱测定

照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)，结合指纹图谱要求测定。

本发明药物组合物口服液体制剂的指纹图谱测定方法为：

取实施例3制备的口服液体制剂1.8ml，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇20mL，再加入浓盐酸0.58mL，密塞，摇匀，称定重量，以功率360W，40kHz进行超声处理60分钟取出，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液9μl注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法(药典一部附录VI D)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的谱柱，以乙腈为流动相A，以含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A(乙腈)由8％～18％～98％～98％，流动相B(含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液)由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000。

对照品溶液的配制精密称取对照品适量，加制成每1ml含0.5mg的溶液。精密量取上述对照品溶液2.5ml，置5ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，其中每1ml中含0.1mg；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各8μl，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得。

指纹图谱及各项技术参数供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内。将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统(2004，1.0B版)，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；

本发明药物组合物口服液体制剂的指纹图谱为：供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内，将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；标准指纹图谱为：

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对保留时间为：

1号峰：0.389±0.162；2号：0.575±0.253；3号峰：1；

4号峰：1.059±0.131；5号峰：1.151±0.268；6号峰：1.315±0.813；

7号峰：1.405±0.392；8号峰：1.987±0.248；9号峰：2.204±0.439；

10号峰：2.922±0.137；

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对峰面积为：

1号：0.063±0.047；2号：0.366±0.183；3号峰：1；

4号峰：0.416±0.101；5号峰：0.063±0.057；6号峰：0.153±0.074；

7号峰：0.131±0.086；8号峰：0.191±0.065；9号峰：0.090±0.036；

10号峰：0.305±0.138。

实施例11：本发明药物组合物颗粒剂的指纹图谱测定

照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)，结合指纹图谱要求测定。

本发明药物组合物颗粒剂的指纹图谱测定方法为：

取实施例5制备的颗粒剂4g，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇32mL，再加入浓盐酸0.6mL，密塞，摇匀，称定重量，以功率320W，40kHz进行超声处理60分钟取出，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液13μl注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法(药典一部附录VI D)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的谱柱，以乙腈为流动相A，以含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A(乙腈)由8％～18％～98％～98％，流动相B(含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液)由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000。

对照品溶液的配制精密称取对照品适量，加制成每1ml含0.5mg的溶液。精密量取上述对照品溶液4ml，置20ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，其中每1ml中含0.1mg；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各13μl，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得。

指纹图谱及各项技术参数供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内。将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统(2004，1.0B版)，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；

本发明药物组合物颗粒剂的指纹图谱为：供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内，将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；标准指纹图谱为：

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对保留时间为：

1号峰：0.389±0.162；2号：0.575±0.253；3号峰：1；

4号峰：1.059±0.131；5号峰：1.151±0.268；6号峰：1.315±0.813；

7号峰：1.405±0.392；8号峰：1.987±0.248；9号峰：2.204±0.439；

10号峰：2.922±0.137；

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对峰面积为：

1号：0.063±0.047；2号：0.366±0.183；3号峰：1；

4号峰：0.416±0.101；5号峰：0.063±0.057；6号峰：0.153±0.074；

7号峰：0.131±0.086；8号峰：0.191±0.065；9号峰：0.090±0.036；

10号峰：0.305±0.138。

实施例12：本发明药物组合物散剂的指纹图谱测定

照高效液相谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)，结合指纹图谱要求测定。

本发明药物组合物散剂的指纹图谱测定方法为：

取实施例6制备的散剂1.5g，精密称定，置50mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇18mL，再加入浓盐酸0.56mL，密塞，摇匀，称定重量，以功率250W，50kHz进行超声处理30分钟取出，放冷至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量；摇匀，滤过，取续滤液8μl注入液相谱仪，进行分析，谱条件为：照高效液相谱法(药典一部附录VI D)测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的谱柱，以乙腈为流动相A，以含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液为流动相B，进行梯度洗脱，梯度条件为时间：0～20～50～60分钟，流动相A(乙腈)由8％～18％～98％～98％，流动相B(含0.2％甲酸和0.2％三乙胺的水溶液)由92％～82％～2％～2％；检测波长为254nm；柱温25℃；流速为1ml/min；理论板数按峰计算应不低于6000。

对照品溶液的配制精密称取对照品适量，加制成每1ml含0.5mg的溶液。精密量取上述对照品溶液1.5ml，置5ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，其中每1ml中含0.1mg；

测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各8μl，注入液相谱仪，记录60分钟的谱图，即得。

指纹图谱及各项技术参数供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内。将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统(2004，1.0B版)，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；

本发明药物组合物散剂的指纹图谱为：供试品谱图应与标准指纹图谱基本一致，有相对应的10个特征峰，特征峰出峰时间应在60分钟之内，将供试品谱图导入中药谱指纹图谱相似度评价系统，与标准指纹图谱相比较，计算相似度，相似度应不低于0.87；标准指纹图谱为：

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对保留时间为：

1号峰：0.389±0.162；2号：0.575±0.253；3号峰：1；

4号峰：1.059±0.131；5号峰：1.151±0.268；6号峰：1.315±0.813；

7号峰：1.405±0.392；8号峰：1.987±0.248；9号峰：2.204±0.439；

10号峰：2.922±0.137；

以3号峰为参照峰，10个特征峰的相对峰面积为：

1号：0.063±0.047；2号：0.366±0.183；3号峰：1；

4号峰：0.416±0.101；5号峰：0.063±0.057；6号峰：0.153±0.074；

7号峰：0.131±0.086；8号峰：0.191±0.065；9号峰：0.090±0.036；

10号峰：0.305±0.138。