一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法及其应用

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法及其应用。这种荧光探针检测酶活性法可为研究组织细胞中一些重要的酶学过程中的机制，阐明生物系统中某些重要的信号通路，为某些重大疾病的早期诊断和预防提供良好的辅助手段。 

长期以来，硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)被认为是一种有毒的气体，然而，随着对H2S研究的深入，发现体内的一些组织细胞能生成H2S，它是继一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后被发现的第三种内源性气体信号分子。越来越多的实验表明，H2S不仅是一种内源性的气体信号分子，而且具有多种细胞保护作用，参与体内多种病理生理过程。在哺乳动物中，以半胱氨酸或半胱氨酸衍生物为底物催化生成H2S的内源酶具有相对的组织特异性，胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase，CGL)主要在心血管系统中表达，胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)主要在中枢神经系统、肝脏和胰腺组织中表达。巯基丙酮酸转硫酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST)和半胱氨酸裂解酶(cysteine lyase，CL)也负责催化内源性H2S的生成。随着H2S在生物体系中的重要作用逐渐地被认识，鉴别和检测生物内源性H2S的方法日益受到关注，检测生物样品中H2S浓度的准确性和可靠性对于理解其功能非常重要，但由于H2S为可挥发气体分子，在生物体内受到各种复杂因素的影响，导致其检测难度高，检测结果不稳定。而检测生物组织或细胞中的硫化氢合成酶活性能较好反映该组织细胞产生H2S的能力，相对于直接检测生物体内的H2S含量，该方法更为可靠和稳定。所以，直观、特异、定量地检测生物组织或细胞中硫化氢合成酶的活性显得尤为重要。 

传统的检测H2S方法如比法、电化学分析法、气相谱法以及硫化物沉淀法都需要复杂的样品处理，荧光检测方法由于简便，灵敏性高，可重复性好，并且能够实现可视化检测，因此，新型的荧光检测试剂和检测方法成为研究的焦点。硫化氢荧光探针灵敏度高，可作为生物物质研究指示系统，并可用于H2S的定量检测和组织细胞中硫化氢合成酶活性的间接测定，另外在研究微环境性质以及疾病的诊断等领域也有广泛应用，荧光检测方法不失为一种直观、特异、简便的检测手段，有望取代传统的检测方法。 

传统的检测硫化氢合成酶活性的方法有反应瓶-亚甲基蓝法，但该方法中的反复冻融法裂解组织细胞步骤显得尤为繁琐，其检测反应瓶吸收体系中的H2S含量也不如本发明的荧光成像法直观、简便和灵敏。本发明的方法中所采用的荧光探针是新型的苯丙二硫醇化合物，是一个封闭的内酯构象，稳定性好，能够长期保存使用(-20℃)，无可见光区域的吸收特性，探针自身荧光微弱(荧光量子产量：Φ＝0.003)，仅在反应后荧光增强(荧光量子产量：Φ＝0.392)，用于荧光成像时信噪比高，并可用于荧光的定量测定；该荧光探针在磷酸缓冲溶液中的检测限为微摩尔(μmol/L)，可检测到在血浆和细胞中10微摩尔的H2S浓度，检测效果稳定。荧光探针和H2S反应前后变化迅速，量子产率较高，在37℃条件下和H2S反应1h可达最高荧光强度，适用于反应体系内H2S的快速测定；其操作简便，检测条件容易实现，可重复性好，可视化；并且，该荧光探针选择性高，可特异地和H2S反应，不受其他生物硫醇如半胱氨酸、谷胱甘肽干扰。因此，该方法有希望作为一种新型的硫化氢合成酶活性检测技术得到应用。 

本发明需要解决的问题是： 

1.提供一种基于H2S的荧光探针的，可用于检测硫化氢合成酶活性的新方法。这种荧光探针检测酶活性法可为研究组织细胞中一些重要的酶学过程中的机制，阐明生物系统中某些重要的信号通路，为某些重大疾病的的早期诊断和预防提供良好的辅助手段。 

2.提供H2S荧光探针检测硫化氢合成酶活性的应用途径。 

本发明的技术方案为： 

1.一种用硫化氢的荧光探针检测硫化氢合成酶活性的新方法： 

(1)本发明的方法中所采用的荧光探针是新型的苯丙二硫醇化合物，是一个封闭的内酯构象，无可见光区 域的吸收特性，探针自身荧光微弱(荧光量子产量：Φ＝0.003)，仅在反应后荧光增强(荧光量子产量：Φ＝0.392)，MW＝591.65，其结构式为： 

(2)本发明的方法中所采用的荧光探针和H2S反应的发光原理及其特异性原来： 

该荧光探针是一个封闭的内酯构象，无可见光区域的吸收特性，探针(Nonfluorescent)与H2S在磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH值7.4)中反应，生成荧光团(Fluorescent)和3H-1，2-苯丙二硫醇-3-酮。 

H2S是一种活性亲核试剂，在生物系统中能够参与亲核取代，检测H2S选择性，关键是要跟其他生物亲核试剂区分，尤其是生物硫醇比如半胱氨酸和谷胱甘肽。从理论上讲，H2S可以认为是一个不可取代的硫醇，可进行两次亲核反应，而其他硫醇如半胱氨酸是一烷基代硫醇，只能进行一次亲核反应。H2S的游离巯基(SH)与荧光探针结构中最亲电子部分A反应生成中间产物A1，如果另一个亲电子体在合适的位置，如A1中的酯组，SH基团会经历一个自发环化的过程，释放荧光和产物B。这种方法不仅可以稳定地捕获H2S从而生成可降解的产物B，也可以定量地测定荧光强度，简便又直观地反映H2S含量。A也可以与生物硫醇如半胱氨酸等反应，但生成产物A2不能自发环化释放荧光团。因此，已报道的新型的由H2S介导的苯丙硫醇结构，其产生荧光信号对H2S具有较高的选择性，不受其他生物硫醇如半胱氨酸、谷胱甘肽干扰。 

(3)本发明的反应瓶吸收体系配制如下： 

a.配制100mmol/L磷酸缓冲液(PBS，PH＝7.4) 

A液：1mol/L K2HPO4·3H2O  (MW＝228.22)  取9.13g+40ml ddH2O； 

B液：1mol/L KH2PO4      (MW＝136.09)  取1.36g+10ml ddH2O； 

取A液40.1ml+B液9.9ml，混合后，用ddH2O定容至500ml； 

b.配制检测H2S的荧光探针液：将4mg荧光探针(MW＝591.65)溶解于13.5ml乙腈，配制浓度50mmol/L的荧光探针母液，-20℃长期保存，使用时，先取100mmol/L磷酸缓冲液(PBS，PH＝7.4)500μl，再加入乙腈500μl，混匀后取荧光探针母液20μl加入其中与之混合，配制浓度20μmmol/L的荧光探针工作液； 

c.配制溴烷铵(CTAB)：取364mg CTAB(MW＝364.45)溶解于100ml乙醇中配成10mmol/L的溴烷铵母液，常温保存，使用时，按1：1000用10mmol/L磷酸缓冲液(PBS，PH＝7.4)进行稀释，配成浓度10μmol/L的溴烷铵工作液； 

d.配制反应瓶吸收体系：取浓度20μmmol/L的硫化氢探针工作液100μl，在此基础上加入反应佐剂溴烷铵母液(CTAB，10mmol/L)10μl，并用磷酸缓冲液(PBS)定容至10ml，即CTAB终浓度为10μmol/L，取配制好的反应体系1ml加入反应瓶吸收池，现用现配。 

(4)本发明的反应瓶反应体系配制如下： 

a.配制100mmol/L磷酸缓冲液(PBS，PH＝7.4) 

A液：1mol/L K2HPO4·3H2O(MW＝228.22)  取9.13g+40ml ddH2O； 

B液：1mol/L KH2PO4      (MW＝136.09)  取1.36g+10ml ddH2O； 

取A液40.1ml+B液9.9ml，混合后，用ddH2O定容至500ml； 

b.配制1mol/L L-半胱氨酸(MW＝121.16)取0.12g+1ml上述(1)配制的磷酸缓冲液； 

c.配制20mol/L(0.5％)5-磷酸吡哆醛(MW＝265.1)取0.50g+100ml上述(1)配制的磷酸缓冲液； 

(5)本发明的检测方法实验步骤如下： 

a.对于组织样品，先剪成小块，再研磨，对于细胞，组织细胞裂解液(强)进行裂解(碧云天生物技术所，南通，中国)； 

b.组织细胞裂解产物经蛋白定量； 

c.将组织细胞裂解产物加入反应瓶外圈的反应池中，同时加入2mmol/L的5-磷酸吡哆醛和10mmol/L的L-半胱氨酸及裂解液。此为反应瓶的反应体系； 

d.吸收体系加在内圈的吸收池中，即加入一种硫化氢荧光探针(20μmol/L)100μl和反应佐剂溴烷铵(CTAB，10μmol/L)100μl，并用磷酸缓冲液(PBS)定容至10ml。 

e.在37℃条件下进行密闭吸收反应60min； 

f.荧光测定或荧光成像。 

2.H2S荧光探针检测硫化氢合成酶活性的应用途径 

将本发明的H2S荧光探针用于生物体系中含硫化氢合成酶的组织细胞的检测，生物组织或细胞生成H2S的功能的分析检测和荧光成像检测。 

本发明对硫化氢合成酶活性检测的新方法与现有技术相比，其有益效果是： 

(1)组织细胞裂解液裂解细胞组织，裂解液本身不影响酶的催化活性，其裂解程度比反复冻融法更彻底； 

(2)探针稳定性好，能够长期保存使用(-20℃)； 

(3)操作简便，检测条件容易实现，可重复性好，可视化检测； 

(4)探针选择性高，可特异地和H2S反应，其产生荧光信号对H2S有唯一的选择性，不受其他生物硫醇如半胱氨酸、谷胱甘肽干扰。 

(5)探针和H2S反应前后变化迅速，量子产率较高，在37℃条件下和H2S反应1h可达最高荧光强度，适用于反应体系内H2S的快速测定； 

(6)探针在磷酸缓冲溶液中检测限为微摩尔(μmol)，检测灵敏；但可以检测到在血浆和细胞中10微摩尔的H2S浓度，检测效果稳定。 

(7)探针自身荧光微弱(Φ＝0.003)，仅在反应后荧光增强(Φ＝0.392)，用于荧光成像时不会导致较低的信噪比，并可用于荧光的定量测定； 

本发明的H2S荧光探针检测硫化氢合成酶活性可为研究H2S相关的信号通路，以及H2S在一些疾病或生物体内病生过程中的意义及诊断提供了较好的研究方法。 

本发明的H2S荧光探针检测硫化氢合成酶活性法可直观反映生物某一组织细胞在特定生理或病理环境下产生H2S的能力，检测结果可用于荧光成像，在生物工程工业中具有很好的实用性。 

图1：为反应瓶图，其容积为50ml，反应体系加在反应瓶外圈的反应池，吸收体系加于内圈的吸收池，吸收池容积为2ml。 

图2：新型的吸收体系(含反应佐剂溴烷铵的H2S荧光探针工作液)检测NaHS供体所释放的H2S含量，对照组向反应池加入一定体积的PBS，实验组向反应池加入相同体积的不同浓度的NaHS供体，两组都在吸收池中加入相同的吸收体系，37℃，轻摇1h，用反应瓶-荧光探针法检测荧光强度，荧光强度可反映吸收液中H2S的含量。 

图3：不同的吸收时间，H2S荧光探针检测NaHS供体所释放的H2S含量，对照组向反应池加入一定体积的PBS，实验组向反应池加入相同体积的不同浓度的NaHS供体，两组都在吸收池中加入相同的吸收体系(含反应佐剂溴烷铵的H2S荧光探针工作液)，37℃，轻摇不同时间，用反应瓶-荧光探针法检测荧光强度，荧光强度可反映吸收液中H2S的含量。 

图4：新型的吸收体系(含反应佐剂溴烷铵的H2S荧光探针工作液)检测NaHS供体所释放的H2S含量，分别配制不同浓度的NaHS供体，直接加入相同的H2S荧光探针，用全波长扫描多功能读数仪(Varioskan Flash3001)(最大激发波长λex(max)＝476nm，最大发射波长λem(max)＝513nm)。 

图5：检测H2S荧光探针的淬灭情况，对照组向反应池加入一定体积的PBS，实验组向反应池加入相同体积的600μmol/LNa2S供体，两组都在吸收池中加入相同的吸收体系(含反应佐剂溴烷铵的H2S荧光探针工作液)，37℃，轻摇1h，用反应瓶-荧光探针法检测荧光强度，在荧光下观察其荧光淬灭情况。 

图6：HaCaT细胞经不同浓度的右旋-葡萄糖(D-Glu)和渗透压对照的左旋-葡萄糖(L-Glu)处理72h后，改进原来的反复冻融法，用碧云天生物技术所提供的组织细胞裂解液(强)进行裂解。用改良的反应瓶-亚甲基蓝显法检测高糖处理HaCaT细胞的H2S合成酶(CBS)的活性。 

图7：将50μmol/L S-NH2S供体(Yz-2-54)加入培养的HaCaT细胞中处理1h，用H2S探针直接检测培养基中和细胞内H2S的释放情况。 

下面通过实施例具体地说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。 

实施例1：新型的吸收体系检测NaHS供体所释放的H2S含量 

有文献显示，NaHS溶液中HS-/H2S比例为3：1，所以NaHS溶液中大部分为HS-。对照组向反应池加入一定体积的PBS，实验组向反应池加入相同体积的不同浓度NaHS供体，两组都在吸收池中加入相同的吸收体系(含反应佐剂溴烷铵的H2S荧光探针工作液)，37℃，轻摇1h，用反应瓶-荧光探针法检测荧光强度，荧光强度可反映吸收液中H2S的含量。结果如图2显示，高浓度组(600μmol/L)的荧光强度大于低浓度组(200μmol/L)，实验组荧光强度明显大于对照组。 

实施例2：不同的吸收时间，H2S荧光探针检测NaHS供体所释放的H2S含量 

对照组向反应池加入一定体积的PBS，实验组向反应池加入相同体积的不同浓度的NaHS供体，两组都在吸收池中加入相同的吸收体系(含反应佐剂溴烷铵的H2S荧光探针工作液)，37℃，轻摇不同时间，用反应瓶-荧光探针法检测荧光强度，荧光强度可反映吸收液中H2S的含量。结果如图3显示，600μmol/L NaHS组的荧光强度大于200μmol/L NaHS组，实验组荧光强度明显大于对照组，实验组中，相同的NaHS浓度，1h组荧光强度略大于1/2h组，**P＜0.01与Con-1/2h组比较，