绒山羊4E-BP1基因cDNA编码区核苷酸序列

技术领域 本发明涉及从体外培养的绒山羊胎儿成纤维细胞分离的编码4E-BP1蛋白的cDNA，更具体地说涉及编码4E-BP1蛋白质的cDNA编码区232bp的核苷酸序列和与它的前231bp核苷酸序列对应的氨基酸序列。

背景技术 细胞生长调控是一个受多因素影响的复杂过程，它不仅受到时间和空间的限制，还受到营养条件和细胞内外环境条件的影响。在营养条件合适并有其它刺激生长的因子存在时，细胞通过生物大分子合成而使得质量和形态都得到增长，此时则表现为生长。

eIF4E(eukaryotic translation initiation factor 4E)是真核细胞翻译启始复合体的亚单位之一，结合于mRNA的5′cap，与eIF4E结合的是eIF4G，二者的结合受到eIF4E结合蛋白4E-BPs的调节。低磷酸化的4E-BP1与eIF4E具有较高的亲和力，处于较高磷酸化状态的4E-BP1则可释放出eIF4E，使得eIF4G得以与eIF4E结合，进而启动5′cap mRNA的翻译。人的4E-BP1包含了118个氨基酸残基，小鼠的则是117个，C端的TOS模序(motif)对于与Raptor的结合进而被mTOR磷酸化是十分重要的。

人4E-BP1已报道的磷酸化位点有7个，分别是Thr37，Thr46，Ser65，Thr70，Ser83，Ser101和Ser112。在生长因子的刺激下，mTOR使4E-BP1磷酸化的顺序是：首先是Thr37和Thr46，然后是Thr70和Ser65，Thr70和Ser65的磷酸化对于eIF4E的释放是最为重要的，Thr70可以促进释放，而Ser65可以防止二者重新结合。这样的磷酸化在由胰岛素和IGF诱导时，在不同类型的细胞中是有差异的。上述结果显示了mTOR使得4E-BP1磷酸化对于eIF4E释放的重要性和这种磷酸化过程的复杂性。

迄今，关于4E-BP1在哺乳动物细胞生长与增殖中发挥调节作用的研究已在牛、人、大鼠、小鼠和黑猩猩等哺乳动物的细胞中开展并取得了许多成果，但尚未见绒山羊细胞中4E-BP1的研究报道，也未见有绒山羊4E-BP1基因的cDNA核苷酸序列和与它对应的氨基酸序列的报道。

在各种情况下，有重要的原因研究和开发与绒山羊4E-BP1蛋白相关的基因克隆及其重组表达，因为研究清楚绒山羊的4E-BP1基因和蛋白的功能，可以用在提高细胞培养、胚胎移植和发育及出生后新生儿的存活的质量等方面，由重组4E-BP1蛋白制备的抗体可以检测4E-BP1基因在不同种类的细胞、不同的细胞周期及个体的不同发育阶段的表达情况。

发明内容 本发明人已经努力从绒山羊的不同组织细胞中分离4E-BP1基因。作为结果，本发明人从绒山羊体外培养的胎儿成纤维细胞分离了4E-BP1基因的cDNA编码区232bp片段，并且确定了它的核苷酸序列和由它推断出的氨基酸序列。本发明人通过比对已知的牛、马、人、小鼠、黑猩猩、猪的4E-BP1基因的核苷酸序列，到保守区，然后根据牛的4E-BP1基因(NM_001077893)cDNA编码区的序列，在不打乱氨基酸编码序列的前提下设计出了一对用于通过RT-PCR方法扩增绒山羊4E-BP1基因cDNA编码区片段的简并引物(上游引物称为P1，下游引物称为P2)，并应用这对引物扩增出了特异性片段，测序后得到了绒山羊4E-BP1基因的cDNA编码区232bp片段，序列分析表明与牛的序列(NM_001077893)同 源性为98％(229/232)，推导出的由此序列的前231bp核苷酸序列编码的氨基酸序列与牛的相比有1个氨基酸的差别。这一cDNA片段称为“g4E-BP1”。

所以，本发明的目的是通过已知的不同物种的4E-BP1的核苷酸序列设计简并引物，然后通过RT-PCR方法克隆绒山羊4E-BP1基因的cDNA编码区片段。对该片段测序后提供编码绒山羊4E-BP1蛋白的基因的cDNA的编码区232bp的核苷酸序列和由此序列的前231bp核苷酸序列推断的氨基酸序列(序列详见序列表)。

附图的简要说明

从下面给出的说明结合附图，本发明的上面目的的特征将变的明了。其中：

图1显示了牛4E-BP1基因的cDNA的核苷酸序列(GenBank登陆号NM_001077893)。

图2显示了232bp的绒山羊4E-BP1基因的cDNA的编码区核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和由此序列的前231bp的核苷酸序列推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。

图3是显示从绒山羊胎儿成纤维细胞分离的总RNA的RT-PCR的结果(232bp的cDNA g4E-BP1)的电泳图。

图4是显示以质粒pMD19-T-g4E-BP1为模板，以P1、P2为引物进行PCR鉴定的电泳图。

图5是显示将质粒pMD19-T-g4E-BP1进行酶切鉴定的电泳图。

图6显示了绒山羊4E-BP1基因cDNA的编码区核苷酸序列与牛(NM_001077893)的4E-BP1基因cDNA的序列的比较。

具体实施方式 为了从绒山羊胎儿成纤维细胞中分离4E-BP1基因，本发明人首先按照提取细胞总RNA的标准要求收集体外培养的内蒙古白绒山羊(Inner Mongolia Cashmere Goat，Capra hircus)的胎儿成纤维细胞。然后利用TaKaRa的总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取绒山羊胎儿成纤维细胞的总RNA，然后以该总RNA为模板进行反转录操作，得到cDNA第一链。再以此cDNA第一链为模板，利用特异性引物P1、P2进行PCR扩增，得到目的片段。之后将电泳后分离的目的片段切胶回收，测定双链cDNA的浓度，与pMD19-T克隆载体连接构建成质粒pMD19-T-g4E-BP1。

为了检测连接反应是否成功和扩增质粒pMD19-T-g4E-BP1，将其转化E coli DH5α感受态细胞，然后将此被质粒pMD19-T-g4E-BP1转化了的Ecoli DH5α细胞涂在含有氨苄青霉素的选择性平板上，并同时进行蓝、白菌落筛选。37℃培养16小时后选取白的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，初步认定白菌落为获得的重组菌落。

重组菌落和重组质粒pMD19-T-g4E-BP1的进一步鉴定则分为三个步骤进行。首先挑取划线培养的菌落用Kieser法提质粒，再以此质粒为模板，用特异性引物P1、P2进行PCR鉴定，阳性的初步认定为重组质粒，其相应的菌落则为重组菌落。然后，再挑取初步认定为重组的菌落进行液体培养，精提质粒，再以此精提的质粒为模板进行PCR鉴定，阳性的质粒进一步进行EcoR I单酶切和EcoR I/HindIII双酶切鉴定。经过了PCR和酶切双重鉴定的质粒确定为重组质粒pMD19-T-g4E-BP1。作为结果，得到了显示阳性反应的重组质粒和重组菌落。将含有重组质粒pMD19-T-g4E-BP1的Ecoli DH5α液体培养的样品送宝生物工程(大连)有限公司测序。作为结果，获得了232bp的山羊4E-BP1基因cDNA编码区的核苷酸序列。

显示上面提到的特征的本发明的特异性PCR引物P1和P2，可以利用RT-PCR方法 扩增出绒山羊的4E-BP1基因的cDNA编码区片段。根据本发明获得的绒山羊4E-BP1基因cDNA的核苷酸序列可进一步通过RT-PCR或杂交的方法检测4E-BP1基因的组织表达特异性，也可进一步实现绒山羊4E-BP1基因全长cDNA的克隆。将本发明的cDNA重组到表达载体上可能会表达出完整的4E-BP1蛋白，进而可用于抗体生产，检测山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的4E-BP1基因的表达情况等等。在下面的实施例中进一步说明了本发明，但这并不限制本发明的范围。

实施例1：绒山羊4E-BP1基因的cDNA编码区232bp片段的克隆

为了克隆来自绒山羊胎儿成纤维细胞的4E-BP1基因包含232bp编码区的cDNA，根据图1公开的核苷酸序列(NM_001077893)，首先制备允许扩增232bp的cDNA的PCR简并引物，即上游引物P1：5′ACGCTCTTCAGCACCAC 3′；下游引物P2：5′TGTCCATCTCAAAC(T)TGTG  3′。

为了利用RT-PCR方法克隆4E-BP1基因的cDNA，从绒山羊胎儿成纤维细胞分离总RNA，利用TaKaRa总RNA提取试剂盒(TaKaRa RNAiso Reagent)并按照使用说明书的操作程序提取绒山羊胎儿成纤维细胞总RNA，进行电泳检测和紫外测定RNA浓度后置于-80℃冰箱保存备用。然后，利用TaKaRa的AMV反转录酶并按照使用说明书的操作程序进行反转录反应，得到cDNA第一链。

以上面得到的cDNA第一链为模板，P1、P2为引物，利用TaKaRa LATaqDNA聚合酶进行PCR反应。PCR反应体系如表1，反应循环如表2。

PCR反应结束后，取PCR产物10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳(0.5％TAE，电压8v/cm，1.5h)。电泳结束，0.5μg/ml的EB染液中染20分钟，再清水浸泡10分钟后置于凝胶成像仪观察照相。作为结果，得到了232bp的特异性目的片段(参见：图3)。

为了将获得的232bp的cDNA特异性目的片段连接到pMD19-T克隆载体上，首先将电泳分离的232bp的cDNA特异性目的片段进行切胶，然后利用胶回收试剂盒回收目的片段，紫外测定浓度后按照pMD19-T克隆载体说明书操作程序完成连接。为了检测连接反应是否成功和进一步扩增质粒pMD19-T-g4E-BP1，将其转化Ecoli DH5α感受态细胞，然后将此被质粒pMD19-T-g4E-BP1转化了的Ecoli DH5α细胞涂在含有氨苄青霉素和X-gal的选择性平板上，并同时涂上IPTG进行诱导，实现蓝、白菌落筛选。涂布的平板37℃培养16小时后选取白的重组菌落再进行平板划线培养12小时。作为结果，得到了白的重组菌落。

表14E-BP1基因PCR反应体系

表24E-BP1基因PCR反应循环

进一步的工作是对重组菌落和重组质粒进行鉴定(理论上将只有含有重组质粒的菌落才是真正的重组菌落)。首先将白的重组菌落进行划线培养12小时，然后挑取菌落，用Kieser法提质粒。再以此质粒为模板，用特异性引物P1、P2进行PCR鉴定。对阳性的菌落进行摇床振荡液体培养12小时，精提质粒，紫外检测浓度并进行1％琼脂糖凝胶电泳(0.5％TAE，电压8v/cm，1.5h)检测，作为结果，得到了与预期结果大小相符的质粒。最后一步是对精提的质粒利用PCR反应和酶切反应进行二次鉴定。PCR反应以质粒为模板，以P1、P2为引物，反应体系如表1，反应循环如表2。PCR反应结束后，取PCR产物10μl进行0.7％琼脂糖凝胶电泳(0.5％TAE，电压8v/cm，1.5h)。电泳结束，0.5μg/ml的EB染液中染20分钟，再清水浸泡10分钟后置于凝胶成像仪观察照像。作为结果，得到了232bp的特异性目的片段(参见：图4)。酶切鉴定采用TaKaRa EcoRI单酶切和EcoR I/HindIII双酶切，作为结果，质粒的单双酶切得到了与预期结果大小相符的片段(参见：图5)。

经过两次鉴定的重组质粒，与其相应的菌落即是重组菌落。将液体培养的重组菌落样品1ml送往宝生物工程(大连)有限公司测序。作为结果，获得了绒山羊4E-BP1基因的cDNA编码区232bp片段的克隆。

实施例2：绒山羊4E-BP1基因的cDNA的核苷酸序列

图2显示了实施例1中获得的232bp的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，和由此序列的前231bp核苷酸序列推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。在图2中，显示的序列是4E-BP1基因的核苷酸序列，它包括了cDNA编码区的232bp的核苷酸序列和由此序列的前231bp核苷酸序列编码形成的推断的分子量为8.47KDa的成熟蛋白质的77个氨基 酸。

图6显示了绒山羊4E-BP1基因cDNA的核苷酸序列与牛的4E-BP1基因(NM_001077893)cDNA的核苷酸序列的比较。表明：1)绒山羊4E-BP1基因cDNA的核苷酸序列与牛的4E-BP1基因cDNA的核苷酸序列有98％的同源性。由绒山羊的这段核苷酸序列的前231bp核苷酸序列推导出的氨基酸序列与牛的4E-BP1蛋白相同位置片段的氨基酸序列相比(NP_001071361.1)有1个氨基酸的差别，同源性99％(76/77)。

正如清楚说明的和如上说明，本发明提供利用RT-PCR法克隆绒山羊4E-BP1基因cDNA编码区的引物和编码绒山羊的4E-BP1蛋白质的包括232bp的cDNA的核苷酸序列和由它的前231bp核苷酸序列推断的氨基酸序列。此cDNA包括的231bp的核苷酸序列，它编码含有77个氨基酸残基的蛋白质，经过进一步的改造后它可以亚克隆到如pET或pcDNA3.1等原核或真核表达载体上进行表达。重组的cDNA片段可能会表达出完整的4E-BP1蛋白，进而可用于抗体生产，检测绒山羊各类细胞和组织、早期胚胎、个体在不同状态下的4E-BP1基因的表达情况等等。

1.绒山羊4E-BP1cDNA的编码区片段，它的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。

2.由cDNA编码区的核苷酸序列的前231bp核苷酸序列推断出的绒山羊4E-BP1蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO：2所述。