一株在高盐环境中除去黄曲霉毒素B1的嗜盐四联球菌的使用

一株在高盐环境中除去黄曲霉毒素B ₁ 的嗜盐四联球菌的使用

技术领域

本发明涉及一株在高盐环境中除去AFB₁的嗜盐四联球菌，已经于2010年4月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏编号为CGMCC No.3792，属于微生物领域。

背景技术

黄曲霉毒素是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等产生的次级代谢产物，黄曲霉毒素尤其是黄曲霉毒素B₁（AFB₁）具有较强的致癌作用，因此，各国在农产品、各种食品等原料与产品中的含量均有严格的限制。

自1960年发现黄曲霉毒素以来，世界各国科学家们均试图寻求预防和除去黄曲霉毒素的有效途径。目前除去黄曲霉毒素的方法主要有五类：①碱处理方法。Mukendi报道了使用亚硫酸钠、硫酸氢钠、氢氧化钠、氨等化学试剂对黄曲霉毒素去毒的研究，并分析了影响这些化合物去毒效果的各种因素。该类方法适合应用于含水量较高的青绿、青贮饲料以及液态粮油，去毒效率高但不适合籽实、饼粕等固体饲料原料，而且处理后原料残留有大量氨。由于该方法的设备投资大，成本高，已逐渐被淘汰。②氧化处理法。常用的氧化剂有次氯酸钠、臭氧、过氧化氢、等。该方法具有较好的去毒效果，但是该方法的缺点在于处理效果不稳定，饲料中维生素等营养成分损失严重，处理成本较高。③吸附剂吸附毒素。常用的吸附剂包括酵母细胞壁、硅铝酸盐、活性炭等。但吸附剂不能解除黄曲霉毒素的毒性，它还可能同时吸附食品中的营养成分而降低营养物质的利用率，而且被吸附的毒素有可能在动物胃肠道中重新释放。④抗氧化剂处理。这类抗氧化剂包括2-叔丁基对甲酚(BHA)、2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)、异硫氰酸苄酯、2,2,4-三甲基-6-乙氧喹啉等。其机理是抗氧化剂能促进大鼠体内α-谷胱甘肽转移酶-YC2 亚基的表达，有效地抑制了AFB₁与机体DNA 的结合。但是抗氧化剂的去毒作用有限，不能完全消除黄曲霉毒素中毒症，而且BHT 等抗氧化剂浓度均超过常规使用量的30 倍以上才显示较好的去毒效果，这样对动物具有一定毒害作用。⑤高温处理法。破坏AFB₁需要268℃以上的温度，该方法能耗高且对食品中的营养成分破坏大，实际应用很少。

朱新贵等在几种食品微生物除去黄曲霉毒素作用的研究（食品科学.2001，22：65～68）文中报道了乳酸菌、醋酸菌、面包酵母、酿酒酵母、米曲霉、枯草杆菌等对AFB₁具有除去作用。在30℃，添加AFB₁使其初始含量是10μg/ml，接种乳酸菌、醋酸菌和枯草芽孢杆菌的菌悬液，培养48h后，除去AFB₁的作用明显。乳酸菌和枯草杆菌的除去作用分别达到82％和86％，培养60h后，其除去率分别达到88％和89％。但面包酵母和酿酒酵母的除去作用则不明显。

本发明的目的就是采用一株能在高盐环境中生长繁殖，且具有除去AFB₁能力的嗜盐四联球菌达到去除酱油、豆酱和豆瓣酱等生产过程中污染的AFB₁的目的。本发明使用的嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus，保藏编号：CGMCC No.3792），属于益生菌类，安全可靠，含盐浓度在6% -20% 范围生长繁殖良好，能有效除去被污染的酱油、豆酱等发酵醪中的AFB₁。

发明内容

为了减少AFB₁对人和动物的危害，减少真菌毒素对食品的污染，保证食品安全，本文通过对该菌株生物修复AFB₁，应用于生产实际中，AFB₁的去除率达到41.76%。

本发明嗜盐四联球菌的形态学特征为在固体培养基上菌落表面光滑，湿润，边缘整齐，中央隆起，直径约为1mm，乳白。液体培养无菌膜，菌液浑浊且有少量沉淀，革兰氏染阴性，细胞呈球形，二个平面分裂形成四联状。

本发明所要解决的技术问题是提供一株除去AFB₁效果较好的嗜盐四联球菌及其在AFB₁污染样品上的应用。

本发明要求嗜盐四联球菌（T. halophilus）的菌龄处于为对数初期，菌体浓度在使用对象中的初始浓度为5.0×10⁶ ～1.5×10⁷ cfu/g(ml)，以湿基计。

本发明去除AFB₁的具体方法为：待处理的酱油醪、豆酱醅或豆瓣酱醅中接种菌龄是对数初期的嗜盐四联球菌（T. halophilus）悬液，初始菌体浓度为5.0×10⁶ ～1.5×10⁷ cfu/g(ml)，以湿基计，混匀后置于25℃～35℃,发酵10～30天。

本发明具有如下优点：

本发明方法能够在高盐环境中有效除去AFB₁，去除率达到41.76％；本发明使用嗜盐四联球菌系源于酱油醪，是东方传统酿造调味品常用的微生物菌种，并经Ames实验等方法验证是安全的；本发明方法是采用适合高盐发酵调味品生产的耐盐微生物菌株，去除生产过程中AFB₁的污染，为其安全生产提供了一种可行、合理的方法。

具体实施方式

下面结合具体实施范例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 在高盐液态物料体系中除去AFB₁

在含NaCl 6%～8% 的MRS液体培养基中添加AFB₁ ，使其浓度到达10ng/ml ，接入处于对数初期的嗜盐四联球菌(T. halophilus)悬液 ，初始菌体浓度5.0×10⁶cfu/ml，未接种的样品作对照，置于30±2℃的培养箱中培养72hr，取样分析，本发明嗜盐四联球菌除去了样品中58.05%的AFB₁。

实施例2 在高盐半固态物料体系中除去AFB₁

以产黄曲霉毒素的菌株As3.4408（中国科学院普通微生物研究所订购）为出发菌株，以蚕豆瓣为原料生产瓣曲，采用豆瓣酱生产工艺加入盐水使其盐分为13.5% ，水分含量为 55.0%。 将预先繁殖进入对数初期的嗜盐四联球菌（T. halophihus）悬液接入瓣醅，初始菌体浓度为5.0×10⁶cfu/g(ml)，置于30±2℃培养箱中保温培养30d，瓣醅中黄曲霉毒素B₁的除去率达35.70%。

实施例3 采用本方法除去被污染样品中的AFB₁

以一定量的已污染了AFB₁的豆瓣酱为研究对象。将预先繁殖至对数初期的嗜盐四联球菌（T. halophihus）悬液接入污染的豆瓣酱，初始菌体浓度为5.0×10⁶cfu/g(ml)，模拟工厂生产环境，25℃～35℃下培养30d，AFB₁的除去率达到41.76%。

经16SrDNA分子生物学鉴定，其16SrDNA序列：

ACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGCTGCTTAAGAAGAAACTTCGGTTTTTTCTTAAGCGGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGGAACCTATCCATCAGCGGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATATGGCTTTTTTTCACCTGAAAGAAAGCTCAAAGGCGCTTTACAGCGTCACTGATGGCTGGTCCCGCGGTGCATTAGCCAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAAGCAACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGCAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTCAGCAAAGAACAGGAGAAAGAGGAAATGCTTTTTCTATGACGGTAGCTGACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTGATTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCAGCTCAACTGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGATCACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCGCCCTAGAGATAGGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCAGCATTGAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGGAAGTACAACGAGCAAGCCAAGCCGCAAGGCCTAGCGAATCTCTGAAAGCTTCTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATCCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGCGGCAACCCTTAGGGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACGAATGATTGGG。