一种复合菌株微生态制剂及其制备方法

一种复合菌株微生态制剂及其制备方法

技术领域

 本发明涉及固体发酵工程领域，尤其涉及一种由酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌经固体发酵后按照一定比例组合的复合菌株微生态制剂。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)又称面包酵母或者出芽酵母，是一种公认安全的微生物(GRAS)，具有较高的蛋白含量及其它营养成分而被广泛应用于食品与饲料中。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，本发明是使用广东省微生物研究所菌种保藏中心的酿酒酵母菌作为发酵菌种。在医药工业中，酵母及其制品用于某些消化不良症，并能提高和调整人体的新陈代谢机能。在畜牧业中，酵母广泛用作精饲料以增加饲料中的蛋白质含量，对提高禽畜的出肉率、产蛋率和产乳率，对肉质的改良和毛皮质量的提高均有明显的效果。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长；刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高体免疫力；枯草芽孢杆菌菌体自身合成α‑淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用；能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。

地衣芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）是芽孢杆菌属的一种，细胞大小0.8μm×（1.5～3.5）μm，细胞形态和排列呈杆状、单生，细胞内无聚‑β‑盐颗粒，是一种革兰氏阳性杆菌，菌落为扁平、边缘不整齐、白，为兼性厌氧菌。地衣芽孢杆菌细胞形态和排列呈杆状、单生，可调整菌失调达到目的，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌，在其进入动物肠道后，通过其独特的生物夺氧作用机制，对肠道内葡萄球菌、酵母样菌等致病菌有拮抗作用，而对双歧杆菌、乳酸杆菌、拟杆菌、消化性链球菌等有益菌有促进生长作用，己获得国家农业部允许在饲料中添加使用，是非常优秀的饲料工业菌体添加剂。

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），革兰氏阳性菌，不仅属于硬（或厚）壁菌门，而且属于肠道乳酸菌，又称为“有孢子性乳酸菌”。是经美国FDA批准的一种“普遍认为安全”的杆菌类乳酸菌，口服后，凝结芽孢杆菌在动物的盲、结和直肠定植，发酵产生大量抗菌凝固素、乳酸、氨基酸、维生素和多种消化酶。凝结芽孢杆菌经人工胃液（pH1.4）处理2小时后的存活率为95.29%，双歧杆菌存活率为5.20%，乳酸杆菌的存活率为5.50%。研究表明凝结芽孢杆菌对人工胃液的酸性条件耐受性极强，其存活不受影响，明显优于其它微生态制剂，能顺利通过胃进入肠道，从而保证药效的正常发挥，将凝结芽孢杆菌密封于塑料瓶内，置于55℃干燥箱内处理60小时后，测定活菌数的结果表明，仍不低于1亿 cfu/g，水分含量无明显改变，凝结芽孢杆菌制剂可以在室温保存，有效期可达24个月。

凝结芽孢杆菌的功能特点：（1）有效抑制有害菌的生长，改良肠道微生态环境，促进肠道发育，增强肠道功能；（2）提高饲料品质，促进饲料的消化吸收，降低料肉比；（3）有效改善断奶仔猪由于应激和过敏反应引起的菌失调性腹泄；（4）无任何毒副作用，使用安全，并可降低环境中的氨气、硫化氢等有害气体，改善养殖环境。

将酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌四种菌株进行有机组合，充分发挥各菌种的菌优势，不仅能够预防消化道疾病，而且可以促进畜禽生长和增加体重，达到复配增效的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种复合菌株微生态制剂及其制备方法，通过不同功效菌株的有机组合和搭配，提高微生态制剂的作用效果。

实现本发明目的的技术方案如下：

一种复合菌株微生态制剂及其制备方法，包括以下步骤：

（1）酿酒酵母（Saccharomyces  cerevisiae）菌种培养：

① 菌种活化：本发明采用酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)作为发酵菌种，酿酒酵母又称面包酵母或者出芽酵母，购于广东省微生物研究所菌种保藏中心，保藏号：CICC1795。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，含有符合机体需求的优质蛋白质、膳食纤维、复合维生素和有机硒、铬、锌、铁等元素，是一种纯天然、无污染和绿环保的健康营养来源；它的蛋白质含量较高，氨基酸平衡性好，消化吸收率高，将‑80℃保存的酿酒酵母菌种在YPD固体平板上划线，30℃培养16~24小时；

② 制备一级种子：将活化的酿酒酵母菌种，用接种环挑取一环接种于200 mL YPD液体培养基中，将三角瓶置于摇床中，在温度为30℃和250rpm的条件下，振荡培养16~24小时后，制得一级种子菌；

③ 配制固体发酵培养基：固体干基：以玉米粉和小麦粉为基础料（含有玉米粉40~60wt%）、葡萄糖2wt%、尿素0.5wt%、K₂HPO₄ 1.0wt%和生物素0.01wt%；将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，并在pH值为自然条件下搅拌均匀；将固体培养基在温度为121℃下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

④ 固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照5~10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%、温度为25~30℃的条件下，培养20个小时左右，制得二级种子；

⑤ 将得到的二级种子，按照步骤④进一步固体发酵得到三级种子；可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照步骤④进一步固体发酵扩大培养；将酵母培养物进行菌落计数，要求活菌数达1.0×10⁸cfu/g鲜曲以上；

⑥ 将固体发酵的酵母蛋白培养物进行烘干干燥，然后粉碎和包装备用；

（2）枯草芽孢杆菌（Bacillus  subtilis）菌种培养：

① 菌种活化：

    本发明采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为发酵菌种，购于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号，GIM 1.131，将‑80℃保存的枯草芽孢杆菌菌种在种子培养基（蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，琼脂粉15g，加水至1升，高温高压灭菌备用）固体斜面上划线，37℃培养16个小时左右，活化；

    ② 制备一级种子：

    将活化的枯草芽孢杆菌，用接种环挑取一环接种于300 mL 液体种子培养基中（蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，加水至1升，高温高压灭菌备用），将三角瓶置于摇床中，37℃，250rpm，振荡培养16~20小时后，制得一级种子液；

    ③ 配制固体发酵培养基：

    固体干基：以玉米粉、小麦粉和豆饼粉为基础料（质量之比为7:2:1），葡萄糖5.0%，CaCO₃ 1.5%，MnSO₄·H₂O  0.04%；将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值调为6.5，搅拌均匀；将固体培养基经121℃、20min高温高压灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

    ④ 固体发酵：

将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照8~10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37℃培养16~20个小时，制得二级种子；将二级种子按照8~10%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37℃培养16~20个小时，制得三级种子；可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照8~10%的接种量进一步扩大培养；将枯草芽孢杆菌培养物进行菌落计数，要求活菌体浓度可达1.0×10⁹ CFU/g 鲜曲以上，芽孢形成率在90%以上；

    ⑤ 干燥： 

将枯草芽孢杆菌固体发酵培养物烘干、晾晒或者65℃下加温处理60min以内干燥，保存备用；

（3）地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）菌种培养：  

① 菌种活化：

    本发明采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）作为发酵菌种，将‑80℃保存的地衣芽孢杆菌菌种在种子培养基（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，琼脂粉15g，高温高压灭菌备用）固体平板上划线，37℃培养18~20小时；

    ② 制备一级种子：

    将活化的酿酒酵母菌种，用接种环挑取一环接种于200 mL 液体种子培养基中种子培养基（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，高温高压灭菌备用），将三角瓶置于摇床中，37℃，250rpm，振荡培养18~20小时后，制得一级种子液；

    ③ 配制固体发酵培养基：固体干基：以玉米粉和豆饼粉为基础料（玉米粉与豆饼粉的质量之比为9:1），葡萄糖1.0%，尿素0.3~0.5%，NaCl 1.0%。将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值为自然条件，搅拌均匀；将固体培养基经121℃、20min高温高压灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

④ 固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照8~10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37.5℃培养18~20个小时，制得二级种子；将二级种子按照8~10%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37.5℃培养18~20个小时，制得三级种子；可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照8~10%的接种量进一步扩大培养；将地衣芽孢杆菌培养物进行菌落计数，要求活菌体浓度可达1.0×10⁹ CFU/g 鲜曲，芽孢形成率在80%以上；

（4）凝结芽孢杆菌（Bacillus  coagulans）菌种培养： 

① 菌种活化：本发明采用凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）作为发酵菌种，保藏号：GIM 1.421，购于广东省微生物菌种保藏中心；将‑80℃保存的凝结芽孢杆菌菌种在种子培养基（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%和琼脂粉15g，经高温高压灭菌后备用）固体平板上划线，37~40℃培养20~24小时；

② 制备一级种子：将活化的凝结芽孢杆菌，用接种环挑取三到五环接种于200 mL 液体种子培养基中，将三角瓶置于摇床中，在温度为37~40℃和250rpm的条件下，振荡培养20~24小时后，制得一级种子菌；

③ 配制固体发酵培养基：固体干基：以玉米粉和豆饼粉为基础料（玉米粉与豆饼粉的质量之比为2:1）、KH₂PO₄  0.3~0.5wt%、MnSO₄·H₂O 0.02wt%和MgSO₄·7H₂O 0.125wt‰；将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，并在pH值为自然条件，搅拌均匀，将固体培养基在温度为121℃的条件下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

④ 固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照8~10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%和温度为37~40℃的条件下，培养20~24小时，制得二级种子；将得到的二级种子，按照8~10%的接种量进一步固体发酵得到三级种子；可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照8~10%的接种量进一步固体发酵扩大培养；将凝结芽孢杆菌培养物进行菌落计数，活菌体浓度可达1.0×10⁹ CFU/g 鲜曲以上，芽孢形成率在80%以上。

 2. 分别准确称取酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的培养物，制剂中四种菌粉的质量比依次为：40‑60:10‑30:10‑30:10‑30，混合均匀，即为复合菌株微生态制剂。

本发明有益效果：以玉米粉、小麦粉和豆饼粉作为基础料，添加适量的碳源、氮源、无机盐和生长因子进行固体发酵，降低培养基成本，提高了益生菌活菌浓度，为其在养殖业中的应用提供基础。经此方法发酵生产的复合菌株微生态制剂不仅含有高浓度的益生菌活菌，而且含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和微量元素，并含有消化酶和一些未知的生长刺激因子，具有较高的生物活性，因此，能促进动物新陈代谢，增强食欲，有利于动物的消化吸收，加速动物的生长发育及生产性能的发挥，还能提高动物的抗病防病能力。本发明生产工艺简单稳定，菌体密度高，发酵产物无需分离纯化便可直接使用，易于推广；将复合菌株培养物添加到猪饲料中，不仅能够预防消化道疾病，而且可以促进家禽类生长和增加体重。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。

实施例 1   固体发酵生产酵母蛋白饲料的工艺流程，包括以下步骤：

 1. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌：

（1）菌种活化：

本发明采用酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)作为发酵菌种，酿酒酵母又称面包酵母或者出芽酵母，购于广东省微生物研究所菌种保藏中心，保藏号：CICC1795。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，含有符合机体需求的优质蛋白质、膳食纤维、符合维生素和有机硒、铬、锌、铁等元素，是一种纯天然、无污染和绿环保的健康营养来源。它的蛋白质含量较高，氨基酸平衡性好，消化吸收率高。将‑80℃保存的酿酒酵母菌种在YPD固体平板上划线，30℃培养16个小时；

（2）制备一级种子：

将活化的酿酒酵母菌种，用接种环挑取一环接种于200 mL YPD液体培养基中，将三角瓶置于摇床中，在温度为30℃和250rpm的条件下，振荡培养16小时后，制得一级种子液；

（3）配制固体发酵培养基：

固体干基：以玉米粉和小麦粉为基础料（含有玉米粉40~60wt%）、葡萄糖2wt%、尿素0.5wt%、K₂HPO₄ 1.0wt%和生物素0.01wt%。将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，并在pH值为自然条件下搅拌均匀；将固体培养基在温度为121℃下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；  

（4）固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%、温度为25~30℃的条件下，培养20个小时，制得二级种子；将二级种子按照10%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为25~30℃培养20个小时左右，制得三级种子；可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照10%的接种量进一步扩大培养；将酵母培养物进行菌落计数，活菌数达2.6×10⁸cfu/g；

（5）将固体发酵的酵母蛋白培养物进行烘干干燥，然后粉碎和包装备用。

2．枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌种培养：

（1） 菌种活化：

    本发明采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为发酵菌种，购于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号，GIM 1.131，将‑80℃保存的枯草芽孢杆菌菌种在种子培养基（蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，琼脂粉15g，加水至1升，高温高压灭菌备用）固体斜面上划线，37℃培养16个小时左右，活化；

   （2） 制备一级种子：

    将活化的枯草芽孢杆菌，用接种环挑取一环接种于300 mL 液体种子培养基中（蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，加水至1升，高温高压灭菌备用），将三角瓶置于摇床中，37℃，250rpm，振荡培养16~20小时后，制得一级种子液；

   （3） 配制固体发酵培养基：

    固体干基：以豆饼粉、玉米粉和小麦粉为基础料（质量之比为3:1:1），葡萄糖5.0%，CaCO₃ 1.5%，MnSO₄·H₂O  0.04%；将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值调为6.5，搅拌均匀，将固体培养基经121℃、20min高温高压灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

    （4） 固体发酵：

将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37℃培养18个小时，制得二级种子。将二级种子按照10%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37℃培养18个小时，制得三级种子；可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照10%的接种量进一步扩大培养。将枯草芽孢杆菌培养物进行菌落计数，活菌体浓度达1.8×10⁹ CFU/g 鲜曲，芽孢形成率为92%；

   （5）干燥： 

将枯草芽孢杆菌固体发酵培养物烘干、晾晒或者65℃下加温处理60min以内干燥，保存备用；

3．地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）菌种培养：  

（1） 菌种活化：

    本发明采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）作为发酵菌种，将‑80℃保存的地衣芽孢杆菌菌种在种子培养基（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，琼脂粉15g，高温高压灭菌备用）固体平板上划线，37℃培养18小时；

    （2） 制备一级种子：

    将活化的酿酒酵母菌种，用接种环挑取一环接种于200 mL 液体种子培养基中种子培养基（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO₄添加至0.2%，高温高压灭菌备用），将三角瓶置于摇床中，37℃，250rpm，振荡培养18小时后，制得一级种子液；

    （3） 配制固体发酵培养基：固体干基：固体干基：以玉米粉和豆饼粉为基础料（玉米粉与豆饼粉的质量之比为9:1），葡萄糖1.0%，尿素0.3~0.5%，NaCl 1.0%，将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值为自然条件，搅拌均匀，将固体培养基经121℃、20min高温高压灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

（4） 固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照8~10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37.5℃培养18~20个小时，制得二级种子。将二级种子按照8~10%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37.5℃培养18~20个小时，制得三级种子。可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照8~10%的接种量进一步扩大培养。将地衣芽孢杆菌培养物进行菌落计数，活菌体浓度达到9.15×10⁹ CFU/g 鲜曲，芽孢形成率在89%。

4．凝结芽孢杆菌（Bacillus  coagulans）菌种培养： 

（1） 菌种活化：本发明采用凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）作为发酵菌种，保藏号：GIM 1.421，购于广东省微生物菌种保藏中心。将‑80℃保存的凝结芽孢杆菌菌种在种子培养基（胰化蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g、25%浓度MnSO₄添加至0.2%和琼脂粉15g，经高温高压灭菌后备用）固体平板上划线，37~40℃培养24小时；

（2） 制备一级种子：将活化的凝结芽孢杆菌，用接种环挑取三到五环接种于200 mL 液体种子培养基中，将三角瓶置于摇床中，在温度为37℃和250rpm的条件下，振荡培养24小时后，制得一级种子菌；

（3） 配制固体发酵培养基：固体干基：以玉米粉和豆饼粉为基础料（玉米粉与豆饼粉的质量之比为2:1）、KH₂PO₄  0.3~0.5wt%、MnSO₄·H₂O 0.02wt%和MgSO₄·7H₂O 0.125wt‰；将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，并在pH值为自然条件，搅拌均匀，将固体培养基在温度为121℃的条件下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

（4） 固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照8%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%和温度为37℃的条件下，培养24小时，制得二级种子；

（5） 将得到的二级种子，按照步骤（4）进一步固体发酵得到三级种子；

（6） 可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照步骤（4）进一步固体发酵扩大培养；将凝结芽孢杆菌培养物进行菌落计数，活菌体浓度可达1.61×10⁹ CFU/g 鲜曲，芽孢形成率在83%。

5. 分别准确称取酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的培养物，制剂中四种菌粉的质量比依次为：55:15:15:15，混合均匀，即为复合菌株微生态制剂。

实施例 2‑3  

酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌各阶段培养操作等同实施例1，最终微生态制剂中上述四菌种配比分别见下表：

表1   本发明微生态制剂中四种菌粉质量比

  酿酒酵母 枯草芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌 凝结芽孢杆菌

实施例2 60 10 15 15

实施例3 50 15 15 20