一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法

本发明属于细菌检测技术领域，具体涉及一种猪增生性肠炎胞内劳森 氏菌的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。

猪增生性肠炎（porcine proliferative enteritis，PPE）是由猪 胞内劳森氏菌（Lawsonia intracellularis，LI）引起的猪的接触性 传染病。胞内劳森氏菌是一种弯曲的专性胞内寄生菌，主要寄生在猪 以及其他动物的回肠、结肠、盲肠部位，造成未成熟的肠道上皮细胞 腺瘤样增生。目前，该病已呈全球性流行，隐性感染猪较多，损失易 被忽视，亚洲地区的中国、日本、韩国及台湾地区近年来多次发生猪 增生性肠炎，猪感染率后，导致顽固性腹泻，造成猪只生长发育迟缓 ，严重降低饲料报酬率。另外该病经常存在混合感染其它病毒和细菌 性疾病，致使临床症状表现更加复杂化，很难做出准确判断，特别是 不易与仔猪副伤寒﹑猪传染性胃肠炎（TGEV）﹑猪流行性腹泻（PEDV ）腹泻性疾病相区别等。因此，建立有效的鉴别诊断方法和检测系统 成为进行其他研究的前提条件。

荧光染料定量PCR技术是在反应管中加入荧光染料，这种染料可嵌入双 链DNA，并且只有在嵌入到DNA后才能被激发产生荧光。随着扩增反应 的延伸，荧光信号会因为DNA产物的增加而增加，因此SYBR GreenⅠ 荧光信号的积累与扩增出的双链DNA的数量成正相关。目前将该方法应 用到猪增生性肠炎胞内劳森氏菌检测上的尝试还不多见，本发明旨在 建立针对猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的荧光定量PCR快速检测诊断方法 ，为该病的早期诊断防制及流行病学调查提供技术支持，同时为PPE的 分子检测试剂盒的研制打下良好的基础。

本发明的目的是提供一种猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的SYBR Green  I荧光定量PCR检测方法，该方法具有操作简便，敏感性高，重复性好 ，污染少，用时短和可自动定量分析等优点，能够检测出常规PCR无法 检测的病料，同时也免去了DNA水平电泳的步骤，更加省时，为该病的 早期诊断防制及流行病学调查提供技术支持。

本发明的技术方案是通过如下步骤来实现的：

（1）将回肠或盲肠等病料剪碎后，加入5ml的PBS进行研磨，加入浓度 均是1000U/ml的青﹑链霉素各1ml，将组织悬液放入‑20℃条件下，反 复冻融3次，融化后于12000 rpm离心5min，取上清，加入SDS、蛋白 酶K混匀，50℃下裂解1.5h，加入体积比酚:氯仿为1:1的酚和氯仿，使 病料组织变性，利于DNA的释放，取下层抽提，取上清液加体积比氯仿 :异戊醇为1:1的氯仿和异戊醇，提取和纯化DNA，去除其它杂质，再抽 提1次，取上清液加1/10体积3M/L 的NaAc，2倍体积无水乙醇，于‑2 0℃下沉淀1h，4℃下12000rpm，离心10min，弃上清液，沉淀即为DNA ，用75%乙醇冲洗2次，缓慢倒出乙醇，将沉淀室温晾干，加入适量dd H2O溶解DNA，于‑20℃保存或立即做PCR检测。

（2）根据GenBank中的LI aspA基因（AY280626），设计一对特异性 引物，引物序列如下：

PPE‑1‑F：5‑‑TAT，GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG‑‑3

PPE‑1‑R：5‑‑TGA，AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC‑‑3

其中PPE‑1‑F／R预期扩增片段为227bp。

（3）加入PCR Mix 12.5 μL，10 pM上、下游引物各1 μL，Rn ase Free water 8.5 μL，DNA模板或重组质粒2.0μL，将EP管置 PCR仪，按如下程序进行扩增：94℃  5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 40s，共35个循环；72℃延伸1 0 min，反应结束后，取5µL PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 结果，将扩增的PCR产物经2%的凝胶电泳分析并回收﹑纯化。

（4）将回收纯化后的PCR产物连接到pMD18‑ T Vector上，转化至感 受态细胞，筛选得到单菌落，挑取单个菌落接种至培养液中过夜振荡 培养，提取重组质粒，以提取的质粒DNA作为模板进行PCR鉴定，并将 重组质粒进行测序鉴定。

（5）提取经过测序鉴定正确的重组质粒，应用紫外分光光度计测定重 组质粒浓度，计算出基因拷贝数，将重组质粒进行10倍系列稀释，共 做6个稀释度：102,103,104,105,106,107，将其作为标准质粒模板。

（6）取标准质粒模板，构建反应体系，进行SYBR Green I荧光定量 PCR扩增，获得扩增动力学曲线及标准曲线。

（7）分别以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌﹑ LI阳性对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC。验证本 发明方法的特异性。

（8）将已计算出拷贝数的质粒做10倍梯度稀释,选取10‑9、10‑10、10‑11、 10‑12﹑10‑13稀释的五个浓度梯度进行荧光定量PCR检测,以此确定出荧光 定量PCR所能检出的最低模板拷贝数，验证本发明方法的敏感性。

（9）将已知的标准品分别进行批内、批间重复性试验，验证本发明中 方法的稳定性和重复性。

（10）对采自山东省内疑似PPE发病猪的盲肠、回肠组织样品及粪便样 品处理后，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR扩增，同时设阳性标 准对照和阴性对照，用于对比本发明方法的优良之处。

其中本发明所述步骤6‑10中，所述的荧光定量PCR反应体系如下：总反 应体 积25uL，其中ddH2O 10.5ul，上游引物0.5ul，下游引物0.5ul，2× One Step SYBR Green I Premix预混酶12.5ul，质粒模板1ul； 荧光定量PCR反应条件如下：94℃ 预变性3 min；94℃30 s，56℃ 30s，72℃30s ，同时在72℃延伸过程中收集荧光信号，40个循环， 同时设溶解曲线反应循环参数为：95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s。

其中将提取的质粒经紫外分光光度计量，标准质粒以10倍梯度稀释为 1.75×109‑‑1.75×104拷贝/ uL的阳性质粒模板进行荧光定量PCR反 应，建立荧光定量PCR标准曲线。

其中本发明中Ct值与质粒拷贝数的对数之间呈现出良好的线性关系， 相关系数为为R2=0.9979，斜率为‑4.0055，截距为41.1919，从而可以 得出拷贝数x与Ct值之间的线性关系曲线方程式：Ct = ‑4.0055×l gX +41.1919，而待测样品的Ct 值可以从实验结果中直接读取；把 待测样品的Ct值代入表达式就可以计算出其初始拷贝数（X）。

其中在反应结束后进行溶解曲线分析，扩增产物的溶解温度Tm为85.0 ‑85.3℃，无非特异性产物和引物二聚体的峰值出现，标准品均一稳定 。

其中分别以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌﹑ PPE阳性对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC。这2次 扩增PEE质粒模板均出现特异性的扩增动力学曲线，而TGEV、RV、PED V﹑大肠杆菌、沙门氏菌均未出现出相应的扩增动力学曲线，表明该方 法具有较好的特异性。

其中分别进行批内、批间重复试验。批内重复实验验的变异系数CV值 平均为0.76%，批间重复实验的变异系数CV值平均为1.41%，表明建立 荧光定量检测方法具有很好的稳定性。批内重复实验的变异系数均远 小于小于3.0％，批间重复性试验CV值均小于4.0％，试验误差极小， 符合统计学规律，充分证实该检测方法具有良好的重复性，这就为PP E在动物体内分布规律即组织嗜性研究、致病机制、 PPE早期感染的准确定量研究提供了一种精确、简便、可靠的研究方法

另外PPE荧光定量PCR检测灵敏度高于常规PCR，能检测出常规PCR不能 检测的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。在20份疑似PPE病料 中，常规PCR检出率为35%，而荧光定量PCR检出率为60%以上，检出率 大大高于常规PCR。

图1为PPE质粒标准品荧光PCR扩增动力学曲线。

图2为PPE荧光定量PCR标准曲线。

图3为扩增产物的溶解曲线分析。

图4为PPE﹑TGEV、RV、PEDV荧光定量PCR特异性实验扩增动力学曲线。

图5为PPE﹑大肠杆菌、沙门氏菌荧光定量PCR特异性实验扩增动力学曲 线。

为了使本发明的技术方案更加清楚明白，下面结合具体实施例对本发 明作进一步的说明。

实施例：

（1）引物设计

根据根据GenBank登录的LI aspA基因（AY280626），使用Primer5.0 分子生物学软件设计1对引物，送上海生工生物工程公司合成。引物序 列如下：

PPE‑1‑F：5‑‑TAT，GGC，TGT，CAA，ACA，CTC，CG‑‑3

PPE‑1‑R：5‑‑TGA，AGG，TAT，TGG，TAT，TCT，CC‑‑3

其中PPE‑1‑F／R预期扩增片段为227bp。

（2）DNA模板的提取

将回肠或盲肠等病料剪碎后，加入适量的PBS进行研磨，加入抗生素（ 双抗）将组织悬液放入‑20℃反复冻融3次，融化后12000 rpm离心5m in。取上清进行DNA 的提取；取上清537μL，加入60μL10％SDS至浓度为1％，加入3μL2 0mg/mL蛋白酶K至浓度为100μg/mL，将其混匀，总体积为600μL，50 ℃，裂解1.5h；加入等体积（600μL）酚:氯仿(取下层)抽提：12000 rpm，5min；取上清加等体积氯仿:异戊醇再抽提1次；取上清加1/10体 积3M/L NaAc，2倍体积无水乙醇，沉淀DNA：‑20℃，1.0h；4℃、12 000rpm，离心10min,弃上清，沉淀即为DNA，用75%乙醇冲洗2次，（注 意：缓慢倒出乙醇，勿将DNA倒掉）室温晾干；加入适量ddH2O溶解DN A，‑20℃保存或立即做PCR检测。

（3）RNA模板的提取

分别取300μl的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（ TGEV）、猪轮状病毒（RV）病毒液，置于无RNA酶的1.5mlEP管中；在 无RNA酶的1.5mlEP管中，加入800μl Trizol裂解液，混匀，静置5m in；加入200μl氯仿，振荡混匀，静置15min，4℃，12000rpm 离心 15min；管内液体分为三层，取上清550μl，加入等量预冷的异丙醇（ ‑20℃），混匀后‑20℃放置30min，12000rpm 离心10min，弃去所有 液体；加入1000μl 75%乙醇（预冷）洗涤1－2次，4℃ 8000rpm  离心5min；弃上清（离心管在吸水纸上控干），加入20μl DEPC水溶 解RNA，‑70℃保存或立即使用。

（4）猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的aspA基因PCR扩增

PPE PCR扩增采用25 µL反应体系，其组份如下: PCR Mix 12.5  μL，10 pM上、下游引物各1 μL，Rnase Free water 8.5  μL，DNA模板或重组质粒2.0μL，将EP管置PCR仪，按如下程序进行扩 增：94℃ 5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 40s，共35个循环； 72℃ 延伸10 min。反应结束后，取5µL PCR产物用1%琼脂糖凝胶 电泳检测PCR结果。

（5）猪增生性肠炎胞内劳森氏菌的aspA基因的克隆与鉴定

①将回收纯化的PCR产物与pMD18‑ T Vector载体相连，连接反应体 系为：

将上述反应体系混合均匀后于4℃连接过夜，连接后的产物直接用于转 化。

②取50µL感受态细胞，加入连接产物5µL，冰浴30 min，42℃热休 克90‑120s，冰浴15 min，加入950µL不含抗生素的LB液体培养基， 37℃ 250rpm振荡培养45 min至1 h，使菌液复苏并表达抗性，8  000rpm离心5 min，弃上清液，加入200µL液体培养基重悬沉淀，再 加入4µL IPTG（200mg/mL的异丙基硫代一ß ‑D半乳糖苷）和20µ L X‑gal（20mg/mL），混匀，均匀涂布于含50µg/mL Amp的LB固体 平板上，37℃培养14‑16h。

③上述转化培养的平板中挑取白单菌落，接种于5 mL含Amp的LB液 体培养基中，37℃振摇培养过夜，取1.5 mL菌液12 000rpm离心30s ，弃上清液，收集菌体，按质粒提取与回收试剂盒说明书进行质粒的 提取，质粒命名为pMD18‑ T‑PPE。

（6）标准品模板的制备

阳性质粒(命名为pMD18‑ T‑PPE) ， 由上海生物工程有限公司测序 鉴定。用碱裂解法提取质粒DNA。用蛋白核酸定量仪测定质粒浓度，参 照以下公式计算拷贝数：

经计算得pMD18‑ T‑PPE浓度为1.75×1011copies∕µL，根据得到的结 果，将质粒 稀释成1.75×109‑‑1.75×104拷贝/ uL，即：1.75×104，1.75×10 5，1.75×106，1.75×107，1.75×108，1.75×109拷贝∕µL的浓度 ，作为标准样品模板，进行定量PCR反应，制作标准曲线。

（7）猪增生性肠炎胞内劳森氏菌SYBR Green I荧光PCR检测

 ①分别取浓度为1.75×104，1.75×105，1.75×106，1.75×107， 1.75×108，1.75×109拷贝∕µL的pMD18‑ T‑PPE重组质粒作为模板 进行SYBR Green I荧光PCR扩增，获得扩增动力学曲线和标准曲线（ 如附图1、附图2），标准曲线的相关系数为0.9979，斜率为‑4.0055。

其中PCR扩增体系为：

总反应体积25uL：ddH2O10.5ul,上游引物0.5ul,下游引物0.5ul，2× One Step SYBR Green I Premix预混酶12.5ul，质粒模板1ul。

其反应程序为：

94℃下预变性3min；94℃下30s，56℃下30s，72℃下30s，同时在72℃ 延伸过程中收集荧光信号，40个循环，同时设溶解曲线反应循环参数 为：95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s，检测荧光信号，获得 扩增产物的溶解曲线（如附图3），标准品的溶解温度都在85.0‑85.3 ℃之间；

②以TGEV、RV、PEDV反转录后的cDNA和大肠杆菌、沙门氏菌﹑PPE阳性 对照的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，同时设NTC，这2次扩增PE E质粒模板均出现特异性的扩增动力学曲线，而TGEV、RV、PEDV﹑大肠 杆菌、沙门氏菌均未出现出相应的扩增动力学曲线，表明该方法具有 较好的特异性（如附图4、附图5）。

③将已计算出拷贝数的质粒做10倍梯度稀释,选取10‑9、10‑10、10‑11、10 ‑12﹑10‑13稀释的五个浓度梯度进行荧光定量PCR检测,以此确定出荧光定 量PCR的敏感 性。结果显示，当浓度为17.5拷贝∕µL时，仍能够获得S型的荧光曲 线。

④批内重复实验验的变异系数CV值平均为0.76%，批间重复实验的变异 系数CV值平均为1.41%，表明建立荧光定量检测方法具有很好的稳定性 。批内重复实验的变异系数均远小于小于3.0％，批间重复性试验CV值 均小于4.0％，误差极小，符合统计学规律，充分证实该检测方法具有 良好的重复性（如表1和表2所示）。

表1 荧光定量检测方法批内重复试验

表2  荧光定量检测方法批间重复试验

⑤PPE荧光定量PCR检测灵敏度高于常规PCR，能检测出常规PCR不能检 测的病料，而同样对于阴性样品均不能检测出。

表3 PPE荧光定量PCR方法与常规PCR方法比较

样品 常规PCR方法电泳结果 荧光定量PCR循环阈值

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