肿瘤(癌症)的基因综合方法

肿瘤(癌症)的基因综合方法

本发明用来自美国希望基因有限公司和上海凯旋威机电有限公司的资金 进行，因此以上二家公司在本发明中拥有一些权利。

发明领域

本发明涉及癌症(恶性肿瘤)的基因方法。对于恶性肿瘤，过去一直延用 传统的综合性方法，且已取很大的成功经验。随着新世纪的到来，生命科学的迅 速发展以及相关学科的交叉渗透，肿瘤基因已成为肿瘤生物领域研究的 热门话题，已被广大学者所接受，在肿瘤综合中渐露它的锋利头角。特别是 近些年来，世界各国将基因的方法从实验室研究(基础研究)推进到临床试验 阶段。由于癌症是一种多基因改变的疾病，本发明采用综合的新方法，将不 同的基因包括：肿瘤抑制基因、肿瘤转移抑制基因、增强人体免疫能力的基 因、杀死肿瘤细胞基因、增强抗癌药物耐药性的基因、反义核苷或细胞因子基因 等进行科学的组合搭配，从不同方位对癌症实施综合性基因，以求彻底治愈 癌症恶患。

背景技术

恶性肿瘤统称为癌症，它不同于良性肿瘤的最主要特征是能侵袭周围组织， 疾病晚期癌细胞发生远端转移，破坏被侵袭的器官，最终耗尽人体的生命体能， 导致机体衰亡。恶性肿瘤(癌症)几乎在所有类型的细胞中均可发生。从组织学分 析，癌症的起源可分为三种：起源于上皮细胞，大部分癌症属此类；淋巴瘤起源于 脾和淋巴结等的淋巴细胞；肉瘤起源于间叶组织和结缔组织、骨和肌肉等。人类 对恶性肿瘤发生机理的认识经历了漫长曲折的过程，各类学说众说纷纭，随着生 命科学和各门学科迅速发展和交叉渗透，特别是人类对肿瘤细胞地分子遗传学， 肿瘤分子病理生理学和功能基因组学的研究不断深入，已认识到原癌基因的得能 和肿瘤抑制基因的失能，以及肿瘤转移抑制基因的失能和人体免疫功能的改变和 细胞因子的失得能等，在癌症变化过程中起着中心的生物学作用。另外，近些年来， 在载体的构建，外源基因的表达调控使人体内应用的安全性和靶向性的研究取得 了很大的进展，为恶性肿瘤生物起了很大的推动作用。因此，癌症的疗法从 传统的综合性(手术、放疗、化疗)，已发展成为肿瘤的第四大疗法一肿瘤的 基因，肿瘤的基因已成为新世纪生命科学中的耀眼之星。本发明的基因 综合方法在上述等生命科学技术的发展基础上提出来的，根据恶性肿瘤的发 生机制是由于多基因功能失调所致，因此，用多基因、多方位对癌症进步综合性 ，比单一的癌症更科学，临床意义更大。动物实验的研究证实，癌症多基 因的综合比单一的基因临床疗效更好。由于癌症的发病机制是多基因失调而 致，癌症基因综合的重组基因的搭配，可以是全部有作用的基因参 与筛选，也可以是针对性，对不同类型、不同部位的癌症，基因综合的实施 方案也不一样，重组的基因搭配的配方也不同。本发明采用三组基因的 搭配是RhoGDI2、MAD-7和MUS81基因，分别从增强肿瘤转移抑制功能、增强和提高 机体免疫能力和直接杀死癌细胞三个方面来攻克癌症。动物实验的研究结果证 明，综合性基因疗法比单一癌症基因的疗效更好(抑制肿瘤生长，抑制肿瘤 转移)，肿瘤模型动物的生存率更长，生活质量更好，显示它的应用价值和对癌 症的临床意义。

发明概述

本发明是一种创新性的基因方法。由于人类恶性肿瘤(癌症)的发病机理 是多基因的平衡失调所致，从理论来说，为了更有效的达到治愈恶性肿瘤，癌症的 基因应该依照此理论进一步多基因平衡失调的综合。此理论乃本发明的 实施癌症基因综合的依据，经动物实验的研究结果来分析，恶性肿瘤的基因 综合比单一基因的肿瘤基因更有效，充分显示了本发明对恶性肿瘤 的临床意义。

本发明的实验方案中，筛选出的基因，进行科学有效的搭配组合，依照不 同癌症发生的部位，器官及系统不相同，基因的组合不尽相同。根据第3条权 利要求基因综合的基因组合，是质粒DNA、RNA分子、病毒载体、非病毒 载体、干细胞(携带基因)的单独或相互搭配组合，来实施恶性肿瘤的基因 综合，以求达到改善目前恶性肿瘤效果不佳的状况，治愈癌症这一恶患。

发明详述

肿瘤发生与年龄的分布，以及环境、饮食习惯和职业所表现的不同特征有关， 实验研究表明癌症是一个多阶段、多因素参与的过程，同时大多数肿瘤又是单细 胞起源，这就意味着在启动癌变的细胞克隆中，不断分裂的子代细胞多次发生了 遗传学和表遗传学改变。由此产生的表型成为选择的对象，随之细胞的恶性程度 逐步提高，最终成为转移性癌。这些对癌变过程有着原发和关键效应的基因改变， 以一定的时间顺序发生，这就构成癌变或癌的遗传学途径。近来学者们大多认同 癌症变化途径与癌基因的获能(激活、活化)和抑癌基因及癌症转移抑制基因的 失能(失活、表达下降甚至不表达)有关，到目前为止，已发现癌基因超过100多种， 肿瘤抑制基因和肿瘤转移抑制基因已超过30多种。细胞的正常生长和分化的控 制，是通过生长因子和细胞因子与膜表面受体的相互作用，进而诱发一系列信号 转导，最终在核内引起相应基因的活化或抑制来实现。原癌基因的产物还是在这 些途径的关键步骤上发挥作用，如细胞外的生长因子、细胞因子、跨膜的生长因 子受体、从细胞质间向核内传递信号的各类蛋白，以及在核内作为转录因子和调 控DNA复制的蛋白质等。从实验研究的结果中分析，癌基因粗略分成两种类型： 第一类癌基因能使细胞避免衰老和凋亡，起到永生化基因的作用；第二类癌基因 能降低对生长因子的要求，诱发细胞形态的改变，使细胞增殖失调，持续生长并能 转移。

癌变途径的失能遗传学的发生，是关系到肿瘤抑制基因的功能失活(失 能)，20世纪60年代在体细胞杂交试验中发现，癌细胞的恶性特征对正常细胞的表 型为隐性。在小儿视网膜母细胞瘤的流行病研究表明，这类肿瘤的发生有遗传和 散发两种形式。根据诊断年龄分布的特点，Knudson提出了′两次击中′的理论。接 着Comings进一步提出′两次击中′的是一个基因的等位基因，也就是说该突变基 因是隐性的。后来的一系列研究证明，视网膜母细胞瘤的发生是位于13号染体 上的一对RBI等位基因，由于基因突变，染体丢失，体细胞染体重组或DNA甲 基化等异常改变，引起RBI基因功能丢失(失能)的结果，RBI基因是肿瘤抑制基因 在癌变途径中失能遗传学事件的原型，这一事件进一步促进了这一领域的研究。 在家族性癌综合症应用连锁分析和定位克隆技术，已发现30多种肿瘤抑制基因。 总体上决定肿瘤遗传易感性的失能遗传学事例远多于得能的遗传学事例，这可能 是由于肿瘤抑制基因的作用是隐性的，当一个肿瘤抑制基因失能后，剩下的一个 正常等位基因仍可能维持发育过程，这十年来对家族性癌症综合进行深入的 研究，发现和鉴定了30多种与癌相关基因，其中大多数是肿瘤抑制基因。许多学者 将肿瘤抑制基因分为两组：把关基因(Gate Keeper)和管护基因(Caretaker)， 把关基因关系到细胞周期，细胞凋亡和DNA复制的调控，它们通过抑制增殖或促进 细胞凋亡，直接控制肿瘤的发生和演进，它们的失能是癌变遗传学途径的事件，是 癌的限速因子，一旦把关基因失能将启动癌症演进。管护基因关系到DNA修复和 维护基因组的完整性，它们的失能并不直接作用于癌变遗传学途径，而是导致遗 传学的不稳定，使把关基因、原癌基因等癌相关基因的突变增加，进而促进肿瘤的 发生和演进。管护基因的产物具有识别、切除和修复DNA错配和各类损伤等能力， 以维护基因组的完整性。

此外，研究者发现除了上述两类基因的得失能异常导致癌症的发生外，与另 一类肿瘤转移抑制基因的失能密切相关，且这类基因的失能是癌症导致死亡的关 键所至，至今已有多种肿瘤转移抑制基因被发现。如果说肿瘤抑制基因主要是抑 制肿瘤细胞的恶性表型；而肿瘤转移抑制基因主要是抑制肿瘤细胞的转移表型。 近年来有一些肿瘤转移抑制基因文献报道：1988年美国国立癌症研究院 (NCI)Steeg等发现，在7株具有不同转移能力的鼠K-1735黑素癌细胞中，有一段 基因其mRNA水平与肿瘤细胞的转移呈负相关，并且在低转移的癌细胞株中mRNA 水平高出高转移细胞10倍之多，他们把这一基因暂定为NM23，原来在啮齿类动物 肿瘤转移模型细胞转染实验中，也证明了NM23 mRNA水平与转移抑制表型密切相 关，进一步的研究发现，人类基因组中有两个亚型NM23基因，分别表示NM23-H1， 和NM23-H2，NM23-H1基因定位于17号染体着丝点附近，约P″--Q″间，研究表明 NM23-H1和NM23-H2不仅为两个完全不同的基因，而且分别受两个独立的调控系统 调节，其中NM23-H1的mRNA水平似乎与肿瘤细胞转移关系更为密切。后来研究者相 继发现了不同的肿瘤转移抑制基因，如Timp-1和Timp-2，在动物实验中，通过静脉 输注重组Timp-1，发现实验动物体内恶性肿瘤转移受到抑制。1995年Dong等从前 列腺癌杂交细胞AT6.1的第11号染体中分离到特异性抑制前列腺癌转移基因， 命名为Kail，后来第四军医大学西京医院妇产科医师宗晖等发现Kail基因的失能 与恶性卵巢癌的发生和转移密切相关，他们采用脂质体介导Kail cDNA转染高转 移性人卵巢癌细胞系HO-8910PM，发现蛋白的表达水平有显著差异。

近来，麻省理工学院怀德海研究所的Robert Weinbery用芯片技术来分析转 移老鼠乳腺癌细胞的基因表现，从中到一个重要的转录因子-TWIST，这个转录 因子在胚胎发育过程中，背负着引发细胞移动，以及组织重组的任务，而类似的细 胞移动和组织重组情况在肿瘤转移的时候也会发生。他们发现会使由钙粘附素E 所调控的细胞粘附作用失效，以及产生上皮细胞上皮一间隙转化，而且被阻断了 Twist表现的癌细胞其转移程度会降低，在人类乳腺癌中侵润性小叶癌中，也观察 到Twist抑制了钙粘附素E的表现。另外，其他科学家们也在不同的实验研究中发 现诸多基因与肿瘤转移抑制功能密切相关，如PRL-3的酵素基因不在正常细胞表 达，而在转移癌细胞中大量表达，以及发现WDNM1基因的mRNA表达是转移性乳腺癌 细胞株DMBA-8的20倍，随后克隆出的第二株WDNM2基因其表达水平与肿瘤转移呈 负相关。

Dr.Theodorecu D和同事们在膀胱癌细胞T24和T24T的实验中发现RhoGDI2基 因与肿瘤细胞转移高度相关，恶性程度不同，膀胱癌中RhoGD12的mRNA和蛋白质的 表达亦不相同，呈负相关。本公司在实验研究和对临床恶性肿瘤病人的检测中， 发现了RhoGDI2基因与肿瘤转移非常密切，经600多例正常人和各种不同临床恶 性肿瘤体转移的550多例病人的血液标本。经原位杂交方法测定RhoGDI2基因水 平，发现正常人RhoGDI2的表达大约在40-50％左右，与各种肿瘤体转移病人在 10％水平，大部分病人RhoGDI2基因不表达，充分说明大部分病人RhoGDI2基因失 能，研究的结果表明，RhoGDI2表达水平不仅与膀胱癌有关，与其它各种恶性肿瘤 也密切相关。因此，断定RhoGDI2在人类癌症的发生发展中扮演了一个重要的角 。本发明的详述部分花大量笔墨来论述肿瘤转移的相关议题。主要原因是癌症 最终死亡均是由于肿瘤的转移造成的，而且这一问题到目前为止仍无能为力。要 攻克恶性肿瘤，一定要彻底解决肿瘤转移的迷团，才能使肿瘤的上一新台阶。 癌症的发生、演进导致最后转移，直至耗尽病人机体的能量而死亡。癌症的发病 机理可以用上面论述的相关发病机制进行评述分析。由于多基因的协调失灵， 加上机体的免疫能力下降及其它因素改变，产生肿瘤细胞恶变，一旦细胞产生恶 变，形成恶性肿瘤后，它就能突破由胶原等组成的基底膜的屏障，开始向血道， 淋巴道以及周边组织进行侵润性发展，直致向远处转移，而导致机体的生命终止。

自从一九九一年美国的Andson教授首先利用基因重组技术进行首例基因治 疗，它采用腺病毒作载体，对ADA的病人进行尝试性基因。并获得成功。我国在 一九九一年由复旦大学教授薜京伦主持的科题组，采用相同的方法对凝血因子缺 乏的病人进行基因，亦获得成功。目前该项目已获准进入一期临床试验。近 十年来，生命科学和相关前沿学科的交叉发展，相互渗透，基因的方向已 从针对单一基因的遗传病，发展到针对多基因失调的肿瘤、血液系统疾病、神经 系统疾病、免疫性疾病和艾滋病等。不管在目的基因的选择、载体的高效表达转 录、安全性，以及疗效等方面均有了很大的进步。基因发展十分迅速，目前 世界上已批准进入临床试验的项目已达600个之多，大部分是针对肿瘤的基因治 疗，我国亦批准P53的基因药物进入一期的临床试验，本发明的基因综合是建 立在恶性肿瘤发生、演进的病理基础上的，这一创新性方法在动物实验研究中得 到验证。

基因综合和单一基因的方法进行比较，前者有明显效果，不管 在肿瘤肿块消退、抑制肿瘤发生及抑制肿瘤转移方面和提高生存率等均有明显统 计学意义。癌症的发生机制是多基因综合失调所致，但肿瘤的类型及发生的部位 不同，其发病过程和机理各不相同。因此，各种不同的肿瘤在选择基因时，各 种搭配组合也不相同，从组织学角度来分析，肿瘤发生的来源不同(内胚层和外胚 层)，肿瘤的分化演变，基因失调的机制不同。所以本发明提出基因的组合要 依照病理学的基础，科学的、有目的进行基因的搭配组合。由于肿瘤转移是 生命终结的关键因素，在筛选基因时不能忽略这方面的重要性，每个搭配组 合应让肿瘤转移抑制基因参与。本发明筛选的三组基因RhoGDI2是属于肿瘤 转移抑制基因，它可以有效地抑制恶性肿瘤的转移；MAD-7是有双重功能的基 因，它的原型是白细胞介素24，能提高和增强免疫能力，能增加机体T细胞的杀伤 能力，另外它亦有直接杀死肿瘤细胞的能力；MUS81是一个强有力的杀癌基因， 在细胞系和动物实验中表明，当它存在二个拷贝时，具有很大杀癌能力。这三组基 因均是人类同源基因。RhoGDI2基因位于染体12P.3上，基因序列全长为605bp， 用EcoR1，XhoI装在AAV-2载体中；MAD-7基因位于染体1Q32位置上，基因序列全 长620bp，用BamHI，XhoI装在AAV-2载体中；MUS81基因位于染体11Q13位点上，基 因序列全长工1656bp，用EcoR1 xBaI装在AAV-2载体中。本发明中RhoGDI2、MUS81、 MAD-7核苷酸序列可插入到重组表达载体中，重组表达载体中涉及本领域熟知的 质粒、病毒和非病毒载体，也包括纳米材料组成的各种载体和干细胞。通过上述 三组目的基因的遗传学序列的插入和操作，上述表达载体含启动子序列，其有利 宿主插入的遗传序列有效转录，表达载体通常含复制起点、启动子和允许作转化 细胞表型选择的特殊基因。本发明适用的载体，不局限于在细菌中的表达，也包 括哺乳动物细胞和其它细胞表达。本发明的载体亦负担在实验性生产和工业化生 产任务。重组的基因在实验中，按照GLP的要求进行产品形式合成生产，保存 低温条件中，用5％甘露醇保存液。将来临床用的基因产品将严格按照GMP的生 产要求进行生产。

动物实验中，采用两种方法进行疗效观察，单一基因组比多基因组疗效差，质 粒DNA组比重组在AAV-2载体的基因疗效差，单一rAAV重组体比三组重组体同 时注射疗效差，充分说明基因综合的临床意义非常重大。

本发明中的产品包装及产品保存作了描述，质粒DNA以水、粉剂合装或分装， 存放于4℃或-20℃低温条件，重组在AAV-2中的基因产品，以水、粉剂合装 或分装，存放于4℃或-20℃低温条件，(干细胞载体产品，水剂应保存在 -80℃-180℃)。

根据权利要求书的要求，本发明的基因导入方法，导入对象均已作了描述。动 物实验中，我们有目的尝试过基因的导入方法(给药途径)，经注射LacZ(半乳糖氨 胱酸酶)的方法，观察经静脉和肌肉注射的基因在动物体内表达内表达分布情况， 静脉注射LacZ后，肝、脾、心、脑、肾等器官表达率不尽相同。实验结果的启发 是，不同类型的肿瘤、不同部位的肿瘤、不同系统的肿瘤，给药途径的选择不同， 例如全身性肿瘤，血液系统恶性肿瘤，采用静脉注射方法最佳；呼吸系统恶性肿 瘤，采用呼吸道吸入给药方法最优；表层肿瘤为局部注射直接注射到肿瘤组织或 表面皮肤给药。导入方法为了效果更显著。