一种插拔式可实现信号二次放大的拉曼层析试纸

本发明涉及一种检测试纸，具体涉及一种插拔式可实现信号二次放大的拉曼层析试纸，属于生物医学技术领域。

基于ELISA检测原理的免疫层析试纸以其测定时间短、操作简便、结果判读直观的优势，成为实践中使用最为广泛的层析技术。以常见的小分子免疫层析试纸为例，其检测原理多是将待测物特异性抗体预先固定到硝酸纤维素膜的某一区带，待测样品滴加到试纸的一端，在毛细管作用下，样品沿该膜向前移动，当经过固定有抗体的区域时，样品中的待测抗原会与该抗体发生特异性结合。此时，若用免疫标记的纳米颗粒如胶体金或免疫酶染，或标记具有拉曼、上转化发光、时间分辨荧光信号、化学发光的标记物分子，便可实现对待测物的定性定量检测。

由于层析检测法测定迅速、信号响应直观、成本低廉，在医疗、食品、药品、化学以及司法鉴定等多个领域已经得到广泛应用，目前市场上存在一系列胶体金检测试纸，但这些试纸均无通用性特征，且检测灵敏度仅达到国标要求。

本发明针对上述现有免疫层析产品的不足，建立一种插拔式可实现信号二次放大的拉曼层析试纸，目的是将免疫层析技术与拉曼检测相结合，提高层析检测的灵敏度与通用性。为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

插拔式二次信号放大拉曼层析试纸的结构和用途，该检测试纸分为A卡、B卡与C卡三部分，A、B卡之间通过卡口可以实现连接与断开，C卡可直接置于B卡之上；A卡由底板1、样品垫、结合垫1、结合垫2、结合垫3组成。B卡由反应膜、测定线、质控线、吸水纸垫、底板2组成。C卡由还原垫、增强垫组成；插拔式设计主要优势在于A卡与B卡(通用性设计，不因待测物的改变而改变该卡测定线与质控线的成份)之间可实现连接与断开，在B卡不变的情况下，更换不同目标物的A卡。由于B卡可与不同A卡组合使用，增强了检测指标间信号间可比性。信号二次放大主要通过两种胶体金的联用(一次信号放大)与反应膜上Ag的还原(第二次信号放大)实现，旨在提高灵敏度。

所述结合垫1含有偶联了牛血清白蛋白抗体的拉曼标记金核银壳；所述结合垫2含有偶联了待测物抗体的拉曼标记金核银壳；所述结合垫3含有待测物与生物素的偶联物；反应膜上测定线与质控线，均呈与所述试纸的长相垂直的条带状，检测区包被有亲和素，质控区包被有重组G蛋白(SPG)，所述还原垫含有柠檬酸钠缓冲液；所述增强垫含有硝酸银溶液。

所述偶联了牛血清白蛋白的拉曼标记金核银壳通过活性酯法制备而成；所述拉曼标记金核银壳通过种子诱导法制备。

所述偶联了待测物抗体的拉曼标记金核银壳通过活性酯法制备而成；所述拉曼标记金核银壳通过种子诱导法制备。

所述待测物与生物素的偶联物通过活性酯法制备而成。

所述底板为PVC或其它硬质不吸水材料；所述样品吸收垫为吸滤纸；所述吸水纸垫为吸水纸。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述胶体金试纸条的方法，其包括步骤：

1)制备具有包被亲和素的检测区和包被重组G蛋白的质控区的反应膜；制备C卡；

2)制备分别包被有牛血清白蛋白抗体的拉曼标记金核银壳、偶联了待测物抗体的拉曼标记金核银壳以及待测物与生物素偶联物的结合垫；

3)将1)制备的包被后反应膜与底板2组装制备成B卡；

4)将2)制备的结合垫与底板1组装制备成A卡；A卡与B卡组装成试纸条；

具体的说，步骤包括：

1)用氯金酸与柠檬酸钠反应，制备胶体金；

2)使用拉曼分子标记胶体金；

3)以水为重悬溶液，通过离心去除多余拉曼分子；

4)拉曼分子标记的胶体金溶液中依次加入柠檬酸钠与硝酸银，制备金核银壳纳米材料；

5)使用拉曼分子标记金核银壳纳米材料；

6)以水为重悬溶液，通过离心去除多余拉曼分子；

7)将牛血清白蛋白抗体溶液加入到制备的金核银壳纳米材料中，用卵清白蛋白或脱脂牛奶进行未结合位点的封闭，得到偶联了牛血清白蛋白抗体的拉曼标记金核银壳纳米材料并喷涂于结合垫，依次37℃烘干、冷冻干燥后制备成结合垫1；

8)将待测物抗体溶液加入到制备的金核银壳纳米材料中，用牛血清白蛋白进行未结合位点的封闭，得到偶联了待测物抗体的拉曼标记金核银壳纳米材料并喷涂于结合垫，依次37℃烘干、冷冻干燥后制备成结合垫2；

9)通过活性酯法制备待测物与生物素偶联物并喷涂于结合垫，37℃烘干2h制备成结合垫3；

10)将含对苯二酚的柠檬酸钠溶液喷涂于结合垫，37℃烘干2h制备成还原垫；

11)将硝酸银溶液喷涂于结合垫，37℃烘干2h制备成增强垫；

12)在底板1上按顺序黏贴结合垫3、结合垫2、结合垫1、样品垫制备成检测卡A；

13)在底板2上按顺序黏贴反应膜、吸水垫制备成检测卡B；

14)将还原垫叠放于增强垫之上，制备成C卡；

本发明所述一种插拔式可实现信号二次放大的拉曼层析试纸通过插拔式设计与信弓的二次放大，以及B卡的通用性设计，可以实现高灵敏的通用性免疫层析拉曼检测。本发明的插拔式可实现信号二次放大的拉曼层析试纸操作简单、检测时间短、储存简单、保质期长。A、B卡的插拔式设计以及B卡的通用性特点加之C卡的信号增强，显著增加了层析检测的灵敏度与通用性。

本发明可用于临床诊断、检验检疫、食品安全检测、司法鉴定、检测等诸多领域，具有广阔的市场前景。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，根据这些附图获得的其它附图都属于本发明保护的范围。

图1为本发明所述的插拔式信号二次放大拉曼层析试纸组装图

附图中，各标号所代表的材料列表如下：1、底板1；2、样品垫；3、结合垫1；4、结合垫2；5、结合垫3；6、反应膜；7、测定线；8、质控线；9、还原垫；10、增强垫；11、吸水纸垫；12、底板2；

图2为本发明所述的插拔式信号二次放大拉曼层析试纸A卡

附图中，各标号所代表的材料列表如下：底板1；2、样品垫；3、结合垫1；4、结合垫2；5、结合垫3；

图3为本发明所述的插拔式信号二次放大拉曼层析试纸B卡

附图中，各标号所代表的材料列表如下：6、反应膜；7、测定线；8、质控线；11、吸水纸垫；12、底板2；

图4为本发明所述的插拔式信号二次放大拉曼层析试纸C卡

附图中，各标号所代表的材料列表如下：9、还原垫；10、增强垫；

图5为本发明所述的插拔式信号二次放大拉曼层析试纸背面观

附图中，各标号所代表的材料列表如下：1、底板1；12、底板2；

图6为本发明所述的插拔式信号二次放大拉曼层析试纸检测结果判读

图6a、6b、6c、6d、6e、6f为试纸检测结果判定图。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1插拔式信号二次放大拉曼层析试纸条的构成：

所述试纸是由底板、样品垫、反应膜、吸水垫组成；

所述结合垫3、结合垫2、结合垫1、样品垫依次粘贴在底板1上，制备成检测卡A，样品垫的始端与底板1的始端对齐；(图2)

所述反应膜、吸水垫依次粘贴在底板2上制备成检测卡B；吸水垫的末端与底板2的末端对齐；(图3)

使用前，检测卡A通过结合垫3一端的突出部与检测卡B反应膜一端的凹槽通过卡口组装成完整的反应试纸；(图1、图5)

所述反应膜上检测区和质控区，均呈与所述试纸的长轴相垂直的条带状，检测区接近底板带凹槽的一侧，质控区远离底板带凹槽的一侧。检测区包被有链霉亲和素，质控区包被有重组G蛋白。

所述底板为PVC底板；所述样品吸收垫为吸滤纸；所述反应膜为硝酸纤维膜。

将还原垫叠放于增强垫之上，制备成C卡；

将上述A卡、B卡、C卡，在2～8℃环境中保存，有效期12个月。

实施例2实施例1中所述插拔式信号二次放大拉曼层析试纸的制备方法

一、试纸条的制备(以检测氯霉素为例)

试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备具有包被亲和素的检测区和包被重组G蛋白的质控区的反应膜；制备C卡；

2)制备分别含有牛血清白蛋白抗体的拉曼标记金核银壳、偶联了氯霉素抗体的拉曼标记金核银壳以及氯霉素与生物素偶联物的结合垫；

3)将1)制备的包被后反应膜与底板2组装制备成B卡；

4)将2)制备的结合垫与底板1组装制备成A卡；A卡与B卡组装成试纸条；

下面分步详细叙述：

(一)各部件的制备

1)金核银壳的制备

1ml 1％氯金酸溶液加入含有100ml MilliQ水的锥形瓶。用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，持续搅拌下加入一定量1％柠檬酸钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮红时停止，冷却至室温后用MilliQ水定容至100ml。加入1ml 10mmol/L 5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)，室温下搅拌3h。所述一定量柠檬酸钠溶液是指不同粒径纳米金对应的柠檬酸钠加入量，具体为制备15nm纳米金加入4ml柠檬酸钠；制备35nm纳米金加入1.3ml柠檬酸钠；

对于15nm纳米材料采用9000rpm，离心6min，弃上清，用MilliQ水让纳米材料重悬；对于35nm纳米材料采用7500rpm，离心6min，弃上清，用MilliQ水让纳米材料重悬，以去除未反应的DTNB。纳米材料溶液磁力搅拌条件下加热至沸腾，加入1ml柠檬酸钠，然后加入一定量的10mmol/L硝酸银溶液，溶液沸腾40min，然后冷却至室温，用MilliQ水定容至100ml。对于金核为15nm的材料采用7000rpm，离心6min，弃上清，用MilliQ水让纳米材料重悬；对于35nm纳米材料采用5500rpm，离心6min，弃上清，用MilliQ水让纳米材料重悬，以去除未反应的DTNB。所述一定量硝酸银溶液是指不同粒径纳米金对应的硝酸银加入量，具体为15nm纳米金加入4ml硝酸银溶液；35nm纳米金加入1ml硝酸银溶液；制备好的金核银壳室温避光保存。制备好的金核银壳纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

2)氯霉素单克隆抗体-金核银壳标记物的制备

将金核为15nm的金核银壳材料采用7000rpm，离心6min，弃上清，用0.2mol/LpH8.4的PB缓冲液让纳米材料重悬。磁力搅拌下，按每毫升金核银壳溶液加入10μg抗体的标准向金核银壳溶液中加入氯霉素抗体，继续搅拌混匀10min，加入10％牛血清白蛋白(BSA)组分V，使其在金核银壳溶液中终浓度为1％(体积百分含量)，静置10min。9000rpm，4℃离心20min，弃上清，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始金核银壳体积1/10的复溶液将沉淀重悬，4℃储存，备用。

复溶缓冲液：含0.05％吐温-80及0.5％的卵清蛋白(OVA)的0.01mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液。

3)BSA单克隆抗体-金核银壳标记物的制备

将金核为35nm的金核银壳材料采用5500rpm，离心6min，弃上清，用0.2mol/LpH8.4的PB缓冲液让纳米材料重悬。磁力搅拌下，按每毫升金核银壳溶液加入10μg抗体的标准向金核银壳溶液中加入氯霉素抗体，继续搅拌混匀10min，加入10％卵清蛋白，使其在金核银壳溶液中终浓度为1％(体积百分含量)，静置10min。9000rpm，4℃离心20min，弃上清，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始金核银壳体积1/10的复溶液将沉淀重悬，4℃储存，备用。

4)样品吸收垫的制备

将样品吸收垫置于含卵清蛋白0.5％的0.01mol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h备用。室温条件下，干燥保存。

5)结合垫1的制备

BSA单克隆抗体-金核银壳标记物喷涂于结合垫，室温下干燥15min，37摄氏度条件下干燥20min，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h，再真空干燥15h，即可取出，将得到的结合垫1放入塑封袋，加入干燥机，密封保存。

6)结合垫2的制备

氯霉素单克隆抗体-金核银壳标记物喷涂于结合垫，室温下干燥15min，37摄氏度条件下干燥20min，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h，再真空干燥15h，即可取出，将得到的结合垫1放入塑封袋，加入干燥机，密封保存。

7)结合垫3的制备

将氯霉素生物素偶联物喷涂于结合垫，37℃烘2h备用。室温条件下，干燥保存。

8)反应膜的制备

包被过程：用0.01mol/L pH7.4的磷酸盐缓冲液将链霉亲和素稀释到1mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上的检测区(T)，包被量为1.0μl/cm；用0.01mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲液将重组G蛋白稀释到1mg/ml，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维膜上的质控区(C)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥16h，备用

9)还原垫的制备

将0.5mol/L pH4.0并含3％对苯二酚的柠檬酸钠溶液喷涂于玻璃纤维垫，37℃烘2h制成还原垫备用。室温条件下，干燥、避光、密封保存。

10)增强垫的制备

将20mmol/L硝酸银溶液喷涂于玻璃纤维垫，37℃烘2h备用制成增强垫备用。室温条件下，干燥、避光、密封保存。

(二)各部件的组装

1、试纸的组装

在底板1上按顺序黏贴结合垫3、结合垫2、结合垫1、样品垫制备成检测卡A。在底板2上按顺序黏贴反应膜、吸水垫制备成检测卡B。将还原垫叠放于增强垫之上，制备成C卡；

2、试纸条的组装

将上述步骤1中制备的A、B卡以及C卡单独储存。使用前A、B卡通过底板1与底板2之间的卡槽连接。在2～8℃的环境中储存，有效期12个月。

实施例1，乳品中中氯霉素(CAP)的检测

所需材料：①针对氯霉素的插拔式可信号二次放大的拉曼层析试纸(本实验室自备)；②氯霉素加标纯牛奶一份(本实验室自备)

1)用试纸条检测样品

操作步骤：①免疫层析检测试纸平衡至室温，连接A卡与B卡；②氯霉素加标的纯牛奶经乙酸铅法前处理后备用；③待测样品滴加到样品垫；④恒温条件下等待10min；此时，样品溶液在毛细管作用下进行层析，溶解A卡上结合垫1、2、3上物质，并进行竞争结合反应；反应溶液经层析作用到达B卡检测区时与固定化通用性识别元件结合，未结合部分继续层析至质控区时与相应识别元件相结合。⑤将C卡置于检测区与质控区上方，加入100μl水溶液，恒温条件下等待10min，此时C卡上硝酸银被对苯二酚的柠檬酸钠溶液还原，银颗粒附着于检测区与质控区上，增强拉曼效应；⑥可视化判读结果结合拉曼检测仪测定检测区，分析记录结果。所述乙酸铅前处理方法具体为，1ml奶样加入100μl乙酸铅溶液，振荡反应3min后加入草酸钾溶液50μl，3000rpm，3min，吸取上清作为样品溶液。所述乙酸铅溶液配制方法：20g乙酸铅用水溶解并定容至100ml；所述草酸钾-磷酸氢二钠溶液配制方法：草酸钾3g以及磷酸氢二钠7g溶于水并定容至100ml。

(2)分析检测结果。

阳性：当质控区(C)显示拉曼信号，而检测区(T)无拉曼信号或拉曼信号弱于C线拉曼信号，判为阳性，用“+”表示，如图6a、6b。

阴性：当质控区(C)和检测区(T)均显示拉曼信号接近，判为阴性，用“-”表示，如图6c、6d。

无效：当质控区(C)不显示拉曼信号，试纸失效，如图6e。

定量：依据质控区(C)与检测区(T)拉曼信号相对强度，精确测定待测物含量，如图6f。

实施例2试纸条技术参数的确定

1、检测限实验

向空白牛奶样品中分别加标氯霉素至总浓度为0、0.01、0.1、1μg/L，用试纸条进行牛奶样品检测，结果为：当氯霉素浓度为0、0.01μg/L时，试纸显示除肉眼可见的黑、灰条带，并可测定出拉曼信号，测定区信号强于质控区，呈阴性。当氯霉素浓度为0.1、1μg/L时，试纸显示除肉眼可见的黑、灰条带，并可测定出拉曼信号，测定区信号弱于质控区，呈阳性，通过计算二者拉曼信号相对强度，表明本试纸条对牛奶中氯霉素检测限为0.03μg/L。

2、假阳性率、假阴性率试验

取已知氯霉素含量大于0.03μg/L的牛奶阳性样品20份和氯霉素含量小于0.03μg/L的牛奶阳性样品20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，结果见表1、表2。

表1检测阳性样品结果

表2检测阴性样品结果

结果表明：用3各批次生产的试纸条检测阳性牛奶样品时，结果全为阳性，可知阳性样本符合率为100％，假阳性率为0。检测20份阴性牛奶样品时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阴性率为0。本发明的检测氯霉素试纸条可以对牛奶样品中氯霉素残留进行快速检测。

3、特异性实验

特异性常用交叉反应率表示，是指与抗体结构相近的抗原决定簇发生结合的能力。该试纸条检测30μg/L的磺胺类(黄安二甲基嘧啶、磺胺嘧啶)、氟喹诺酮类(氧氟沙星、诺氟沙星)、红霉素、氨基糖苷类(庆大霉素、大观霉素)等药物，试纸条检测区和质控区均显，且检测区不弱于质控区，说明本试纸条对这些药物无交叉反应。

以上对本发明实施例所提供的插拔式二次信号放大拉曼层析试纸制备进行了详细介绍，仪器可用拉曼检测仪等对样品进行分析。本发明所述插拔式信号二次放大拉曼层析检测主要针对抗生素、农药、重金属、激素等小分子，也可用于蛋白、细胞、微生物等大粒径材料进行检测，可用于临床诊断、检验检疫、食品安全检测、司法鉴定、药品、检测等领域。

本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想：同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。