产1，3-二羟基丙酮重组基因工程菌的固定化及应用

产1,3-二羟基丙酮重组基因工程菌的固定化及应用

技术领域：本发明属于微生物发酵技术，涉及产1，3-二羟基丙酮重组基因工程菌的固定化及应用。

背景技术

1,3-二羟基丙酮一种重要的化工、生化原料，医药、农药合成中间体和多功能食品添加剂，用途十分广泛。二羟基丙酮的合成方法主要有贵重金属催化氧化法和微生物法。重金属催化氧化甘油的合成法，由于无法克服催化选择性差的致命缺点，致使甘油转化率低于40%，DHA的产率低于25%。工业生产方法目前是利用微生物分批发酵。该法是在菌体生长到适当的时期，利用菌体产生的脱氢酶以甘油为底物进行脱氢反应，产生DHA。用于生产DHA的微生物主要是醋酸杆菌属(Acetobacter)和葡萄糖杆菌属(Gluconobacter)微生物，尤其是弱氧化醋酸杆菌(Acetobacter Suboxy-dans)和氧化葡萄糖杆菌(Gluoonobacter Oxydans)。菌种在复苏后先进行预培养，然后转发酵罐扩大培养，待菌种达到一定浓度后，接种到含有甘油的发酵培养基当中，经过60-80h的耗氧发酵后，再将发酵液一次放出，经分离纯化得到DHA。每一个分批发酵过程都经历接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。目前已有采用分流加甘油方法，在菌体生长到对数期时，并在产物DHA达到一定水平后，放出部分产物，并补加原料和培养基，这样就可以减少达到生产水平的生物量的时间，提高底物甘油的利用率，节约成本。分批发酵的特点是微生物所处的环境是不断变化的，发生杂菌污染，能够很容易终止操作。在发酵生产中，使用的菌种处于对数生长期，把它们接种到发酵罐新鲜培养基时，几乎不出现调整期，这样可在短时间内获得大量生长旺盛的菌体，有利于缩短生产周期。但该法的主要问题是底物甘油和产物DHA在培养基中的浓度过高时产生了高渗透压，使得发酵菌体裂解、失活，从而导致DHA的产率难以提高。

随着固定化细胞技术的发展，越来越多的研究者关注于固定化大肠杆菌细胞。固定化大肠杆菌细胞具有如下优势：相较于游离细胞，固定化细胞在催化反应过程中，其质粒更加稳定，目的基因产物活力较高，产物易于分离纯化。自1959年Hattori首次将大肠杆菌细胞吸附在树脂上实现了大肠杆菌细胞固定化以来，固定大肠杆菌活细胞或称为固定化增殖大肠杆菌细胞的研究工作相继展开。

超分子通常是指由两种或两种以上分子依靠分子间相互作用结合在一起，组成复杂的、有组织的聚集体，并保持一定的完整性使其具有明确的微观结构和宏观特性。人们可以根据超分子自组装原则，使用分子间的相互作用力作为工具，把具有特定的结构和功能的组分或建筑模块按照一定的方式组装成新的超分子化合物。这些新的化合物不仅仅能表现出单个分子所不具备的特有性质，还能大大增加化合物的种类和数目。如果人们能够很好的控制超分子自组装过程，就可以按照预期目标更简单、更可靠的得到具有特定结构和功能的化合物。MCM-41，脱铝超稳Y沸石，中孔碳等都是具有规则孔道结构、性能优异的可用作主客体化学的超分子。

本发明以超分子模板固定重组基因工程菌，重组基因工程菌是克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板，运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因（gldA），并克隆到大肠杆菌表达载体PET 28a上，构建克隆载体PET-gldA，并在E.Coli ＪＭ１０９中成功表达。构建的甘油脱氢合成1,3-二羟基丙酮固定化工程菌，在含有甘油的培养基中发酵合成1,3-二羟基丙酮。通过过滤发酵液、有机溶剂萃取和组合溶剂重结晶等获得产品1,3-二羟基丙酮。产物表达量最好可达120g/L，重复利用20次后，产物表达量仍可达107g/L。

发明内容

本发明目的在于提供产1,3-二羟基丙酮重组基因工程菌的固定化方法。

本发明的另一个目的在于提供产1，3-二羟基丙酮的固定化重组大肠杆菌的方法及应用。

本发明是通过下述方法实现的：

用超分子模板固定大肠杆菌表达甘油脱氢酶基因（gldA）的工程菌。工程菌的构建是是以克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模板，运用PCR扩增得到编码甘油脱氢酶（GDH）的基因（gldA），并克隆到大肠杆菌表达载体PET 28a上，构建克隆载体PET-gldA，并在E.Coli ＪＭ１０９中成功表达。是用超分子模板固定的重组基因工程菌在含甘油的培养基中发酵制备1，3-二羟基丙酮。

质粒子及菌株：

克隆载体PET28a，大肠杆菌E.Coli ＪＭ１０９购自商业公司。

限制性内切酶，Taq酶，T4 DNA连接酶均购自大连宝生物公司。MCM-41，脱铝超稳Y沸石，中孔碳均来自江南大学。其他化学试剂为国产分析纯化学试剂。

克雷伯杆菌分离培养基：蒸馏水1000mL,甘油5g,NaCl 5g,酵母粉5 g，葡萄糖20g,琼脂粉15g,调pH7.0,0.1MPa灭菌20min.冷却至35℃～45℃，加入尼尔红（Nile Red）2mL/L(0.30mg Nile Red溶于100mL二甲基亚砜），无菌条件下倒入培养皿，冷却后备用。

    富营养培养基：蒸馏水1000mL,酵母粉10 g,琼脂粉10g,甘油3g,(NH₄)₂SO₄ 5g,调pH7.0，0.1MPa灭菌10min.

    产品发酵培养基：

磷酸盐缓冲液的配制：蒸馏水1000mL，NaH₂PO₄.12H₂O 8.95g，KH₂PO₄ 1.5g,pH7.0，0.1MPa灭菌，15min～20min,备用。

基因工程菌富集培养基为 LB 培养基：发酵培养基为添加15.0%甘油的LB培养基，以鼓入空气作为基因工程菌氧化剂；培养温度为35℃。

克雷伯杆菌脱氢酶基因的获得与重组质粒的构建：

通过对1,3-二羟基丙酮合成酶gldA进行序列分析，设计了保守引物：primer-I:5`-GGTGGGATCCTACATGCGCACTTATTTGAG-3`primer-II:5`-AATGCTCGAGCGAATTAACGCGCCAGCCAC-3`。以克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模版扩增得到一个大的片段，从中分析得到DHA合成酶基因1133bp大小的开放阅读框，根据获得的序列设计DHA合成酶基因gldA的扩增引物，在上下游分别引入了XbaI和EcoRI位。对PET28a和PCR扩增产物进行XbaI和EcoRI双酶处理，回收后在T4DNA连接酶作用下16℃连续过夜，以备转化。

    PCR扩增：97℃预变性10min，94℃变形60s，58℃退火30s，72℃延伸60-120s，30个循环后72℃延伸10min。

将gldA基因和载体质粒PET28a同时进行XbaI和EcoRI双酶切，酶切后利用T4连接酶将gldA基因连接到质粒PET28a中，得重组质粒PET-gldA。

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化：

根据《分子克隆实验指南》钙法制备大肠杆菌感受态细胞并进行转化，转化后接于1mlLB培养集中36℃、150r/min振荡培养2h，均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组大肠杆菌。筛选得到的菌株利用菌落PCR和限制性内切酶酶切重组质粒验证重组子。

超分子模板固定：

将适量超分子和5mLPH7.0的磷酸缓冲液加入25mL的锥形瓶内，然后再加入2mL的激活剂和2mL的大肠杆菌工程菌溶液，最后向溶液中滴加7.5％的戊二醛直至溶液质量分数为0.75％。固定化反应在180r/min，15度的条件下进行2h，再经过滤、50mL PH为7.0的磷酸液洗涤后得到固定化大肠杆菌工程菌。

克雷伯杆菌发酵及DHA的提取：

前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)的单菌落。35℃、120r/min培养15h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，30℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，然后在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，35℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。在分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入10瓶含有100m发酵培养基的500ml三角瓶中，30℃～37℃、130r/min振荡培养72h。

固定化重组大肠杆菌发酵生产1,3-二羟基丙酮：

-70℃保藏的固定化重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，30℃～37℃培养过夜，以2%的接种量接种于发酵培养基中，加入1～2mmol/L的IPTG诱导gldA的表达，发酵培养72h。

发酵产物的分离：发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩后，使用乙酸丁酯和石油醚（1:3～4体积）重结晶得到产品。

本发明的固定化菌株，产物表达量高，最高可达120g/L，重复利用性好，重复利用15次后，产物表达量仍可达100g/L，将对1，3-二羟基丙酮的生物发酵制备具有积极的作用，应用前景广阔。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，对本发明作进一步的阐述，但不限于这些具体的实施例，而所有的实施例均按上述的操作步骤操作。

实施例1、

质粒子及菌株：

克隆载体PET28a，大肠杆菌E.Coli ＪＭ１０９购自商业公司。

限制性内切酶，Taq酶，T4 DNA连接酶均购自大连宝生物公司。MCM-41来自江南大学。其他化学试剂为国产分析纯化学试剂。

克雷伯杆菌分离培养基：蒸馏水1000mL,甘油5g,NaCl 5g,酵母粉5 g，葡萄糖20g,琼脂粉15g,调pH7.0,0.1MPa灭菌20min.冷却至35℃，加入尼尔红（Nile Red）2mL/L(0.30mg Nile Red溶于100mL二甲基亚砜），无菌条件下倒入培养皿，冷却后备用。

    富营养培养基：蒸馏水1000mL,酵母粉10 g,琼脂粉10g,甘油3g,(NH₄)₂SO₄ 5g,调pH7.0，0.1MPa灭菌10min.

    产品发酵培养基：

磷酸盐缓冲液的配制：蒸馏水1000mL，NaH₂PO₄.12H₂O 8.95g，KH₂PO₄ 1.5g,pH7.0，0.1MPa灭菌，15min～20min,备用。

基因工程菌富集培养基为 LB 培养基：发酵培养基为添加15.0%甘油的LB培养基，以鼓入空气作为基因工程菌氧化剂；培养温度为35℃。

克雷伯杆菌脱氢酶基因的获得与重组质粒的构建：

通过对1,3-二羟基丙酮合成酶gldA进行序列分析，设计了保守引物：primer-I:5`-GGTGGGATCCTACATGCGCACTTATTTGAG-3`primer-II:5`-AATGCTCGAGCGAATTAACGCGCCAGCCAC-3`。以克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)基因组DNA为模版扩增得到一个大的片段，从中分析得到DHA合成酶基因1133bp大小的开放阅读框，根据获得的序列设计DHA合成酶基因gldA的扩增引物，在上下游分别引入了XbaI和EcoRI位。对PET28a和PCR扩增产物进行XbaI和EcoRI双酶处理，回收后在T4DNA连接酶作用下16℃连续过夜，以备转化。

PCR扩增：97℃预变性10min，94℃变形60s，58℃退火30s，72℃延伸60-120s，30个循环后72℃延伸10min。

将gldA基因和载体质粒PET28a同时进行XbaI和EcoRI双酶切，酶切后利用T4连接酶将gldA基因连接到质粒PET28a中，得重组质粒PET-gldA。

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化：

根据《分子克隆实验指南》钙法制备大肠杆菌感受态细胞并进行转化，转化后接于1mlLB培养集中36℃、150r/min振荡培养2h，均匀涂布于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选重组大肠杆菌。筛选得到的菌株利用菌落PCR和限制性内切酶酶切重组质粒验证重组子。

超分子模板固定：

将3.5gMCM41和5mLPH7.0的磷酸缓冲液加入25mL的锥形瓶内，然后再加入2mL的激活剂和2mL的大肠杆菌工程菌溶液，最后向溶液中滴加7.5％的戊二醛直至溶液质量分数为0.75％。固定化反应在180r/min，15度的条件下进行2h，再经过滤、50mL PH为7.0的磷酸液洗涤后得到固定化大肠杆菌工程菌。

克雷伯杆菌发酵及DHA的提取：

前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)的单菌落。35℃、120r/min培养15h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，30℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，然后在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，35℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。在分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入10瓶含有100m发酵培养基的500ml三角瓶中，30℃、130r/min振荡培养72h。

固定化重组大肠杆菌发酵生产1,3-二羟基丙酮：

-70℃保藏的固定化重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，30℃培养过夜，以2%的接种量接种于发酵培养基中，加入1mmol/L的IPTG诱导gldA的表达，发酵培养72h。

发酵产物的分离：发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩后，使用乙酸丁酯和石油醚（1:4体积）重结晶得到产品。产物表达量达120g/L。催化酶回收重复利用20次，产物表达量达107g/L。

实施例2、

各培养基的组成和培养条件同上。重组大肠杆菌制备同上。

超分子模板固定：

将2.7g 脱铝超稳Y沸石和5mLPH7.0的磷酸缓冲液加入25mL的锥形瓶内，然后再加入2mL的激活剂和2mL的大肠杆菌工程菌溶液，最后向溶液中滴加7.5％的戊二醛直至溶液质量分数为0.70％。固定化反应在170r/min，15度的条件下进行2h，再经过滤、50mL PH为7.0的磷酸液洗涤后得到固定化大肠杆菌工程菌。

克雷伯杆菌发酵及DHA的提取：

前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)的单菌落。35℃、120r/min培养15h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，30℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，然后在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，35℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。在分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入10瓶含有100m发酵培养基的500ml三角瓶中，35℃、130r/min振荡培养72h。

固定化重组大肠杆菌发酵生产1,3-二羟基丙酮：

-70℃保藏的固定化重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，36℃培养过夜，以2%的接种量接种于发酵培养基中，加入1.5mmol/L的IPTG诱导gldA的表达，发酵培养72h。

发酵产物的分离：发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩后，使用乙酸丁酯和石油醚（1:3体积）重结晶得到产品。产物表达量达108g/L。催化酶回收重复利用20次，产物表达量达87g/L。

实施例3、

各培养基的组成和培养条件同上。重组大肠杆菌制备同上。

超分子模板固定

将3.3g 中孔碳和5mLPH7.0的磷酸缓冲液加入25mL的锥形瓶内，然后再加入2mL的激活剂和2mL的大肠杆菌工程菌溶液，最后向溶液中滴加7.5％的戊二醛直至溶液质量分数为0.85％。固定化反应在170r/min，15度的条件下进行2h，再经过滤、50mL PH为7.0的磷酸液洗涤后得到固定化大肠杆菌工程菌。

克雷伯杆菌发酵及DHA的提取：

前培养是在L-试管中，以无菌操作加入5ml富营养培养基，以无菌牙签接入克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)的单菌落。35℃、120r/min培养15h。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，30℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，然后在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。将前培养物0.5ml接种至含有100ml富营养培养基的500ml三角瓶中，35℃、130r/min振荡培养24h。4℃，6000*g无菌离心10min，弃上清，在离心管中以无菌磷酸盐缓冲液振荡混匀，再次在4℃，6000*g无菌离心12min，弃上清。在分别将不含有富营养培养基的菌体无菌接入10瓶含有100m发酵培养基的500ml三角瓶中，35℃、130r/min振荡培养72h。

固定化重组基因大肠杆菌发酵生产1,3-二羟基丙酮：

-70℃保藏的固定化重组大肠杆菌在LB培养基平板上活化，以灭菌牙签挑取单菌落接于20mlLB培养基中，36℃培养过夜，以2%的接种量接种于发酵培养基中，加入1mmol/L的IPTG诱导gldA的表达，发酵培养72h。

发酵产物的分离：发酵收获后，离心分离和回收催化酶，发酵母液使用乙酸丁酯萃取，将萃取所得的有机浓缩后，使用乙酸丁酯和石油醚（1:4体积）重结晶得到产品。产物表达量达95g/L。催化酶回收重复利用15次，产物表达量达65g/L。