一种防治牛乳房炎的复合微生态制剂及其应用的制作方法

1.本发明涉及饲料技术领域，具体地，本发明涉及一种防治牛乳房炎的复合微生态制剂的制备及其应用方法。

背景技术：

2.乳房炎是奶牛饲养过程中最常见的乳腺疾病之一，可分成临床型乳房炎和隐性乳房炎两大类型，通常是泌乳初期的奶牛和处于泌乳高峰期的高产奶牛易发。调查研究表明，有5％-10％奶牛发生临床型的乳房炎，不仅降低奶牛泌乳量，还会导致乳区纤维化和小胳肿，升高牛乳中纤溶酶的水平，导致乳蛋白如酪蛋白的蛋白水解增加，引起牛奶和相关乳制品的质量显著降低，带来较大的经济损失。
3.奶牛乳房炎的发生是由病原微生物感染、奶牛自身及遗传因素、饲养管理因素营养因素、环境因素等多种复杂因素综合作用的结果。其中，病原微生物感染是引起奶牛乳房炎的最主要原因，病原微生物主要为细菌，如金黄葡萄球菌、无乳链球菌、大肠杆菌等，此外还有某些真菌和病毒。金黄葡萄球菌是奶牛乳房炎的常见病原体，可由乳头管侵入，再向乳腺组织内部蔓延，产生细胞黏附素、毒性胞溶外蛋白和荚膜多糖等多种致病因子，造成急性乳房炎或慢性乳房炎，该菌的某些特性如生物膜形成、胞内生存、荚膜表达等与奶牛乳房炎的发生有关。无乳链球菌是传染性致病菌，具有高度传染性，主要引起奶牛乳腺隐性感染，在管理及防控措施缺乏的情况下，无乳链球菌能在牛中迅速扩散。大肠杆菌在乳房通过多种细胞因子和趋化因子引起炎症和免疫防御反应，主要在宿主免疫受到抑制时的围产期和泌乳早期引起大肠杆菌性奶牛乳房炎，症状不一，有的是轻微的、局部性的乳腺炎症，有的则造成严重的乳腺炎症，甚至死亡。
4.世界各国的研究人员应用多学科的理论与方法，从不同角度对奶牛乳房炎的诊断和防治做了深入的基础研究，但是由于致病因素是多方面的，同时这些因素之间又有交互、协同作用，迄今仍无防治奶牛乳房炎的有效方法。目前，在防治奶牛乳房炎时多采取多种综合措施，包括奶牛的抗病育种、营养调控、加强饲养管理、早期检测与药物等，抗生素仍是防治奶牛乳房炎的主要方法。近年来，研究人员在益生菌抑菌、调节肠道健康、改善养殖场微生态环境、提高动物免疫机能等方面取得了许多成果，在疾病防治及提高生产性能等方面也获得了良好的效果。益生菌可以通过竞争黏附位点或产生细菌素等具有抗菌活性的物质，抑制金黄葡萄球菌、无乳链球菌及大肠杆菌等病原微生物的增殖或直接将其杀死，调节养殖场环境，维持动物健康，从而降低奶牛乳房炎的发生。

技术实现要素：

5.本发明的目的在于，提供一种由贝莱斯芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌组成的复合微生态制剂。该贝莱斯芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌菌株对金黄葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌等病原菌有较强抑制作用，复合使用一方面可抑制养殖环境中病原微生物，改善饲养环境，另一方面可抑制病原微生物对奶牛的感染，有效防治奶牛乳房炎。
0.5％-1.0％，葡萄糖1.0％-3.0％，柠檬酸二胺0.05％-0.10％，磷酸氢二钾0.05％-0.10％，硫酸镁0.05％-0.10％，硫酸锰0.05％-0.10％，调节ph值6.0-7.0。
28.将贝莱斯芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌混合，以沸石粉为载体，混合后贝莱斯芽孢杆菌活菌数为5.0
×
10
9-1.0
×
10
10
cfu/g，凝结芽孢杆菌活菌数为5.0
×
10
9-1.0
×
10
10 cfu/g。
29.本发明还提供一种防治奶牛乳房炎的复合微生态制剂的应用方法，将复合微生态制剂按照5-10g/m2使用量撒到奶牛养殖环境或将复合生微生态制剂按50-100g/头加入到日粮中，可以抑制或杀灭金黄葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌等病原菌，改善饲养环境，防止病原微生物对奶牛的感染，有效防治奶牛乳房炎。
30.本发明的贝莱斯芽孢杆菌ca03001(bacillus velezensis)已于2020年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为cgmcc no.19349。凝结芽孢杆菌ca04121(bacillus coagulans)已于2018年8月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.16244。
附图说明
31.图1是不同菌株以金黄葡萄球菌为病原指示菌的抑菌作用比较。
32.图2是不同菌株以无乳链球菌为病原指示菌的抑菌作用比较。
33.图3是不同菌株以大肠杆菌为病原指示菌的抑菌作用比较。
具体实施方式
34.下面结合附图和实施例进一步描述本发明的技术方案：
35.实施例1金黄葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌拮抗菌种的筛选及鉴定 1 材料方法
36.1.1 试验材料
37.1.1.1 菌种
38.金黄葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌购自中国工业微生物菌种保藏中心，益生菌菌株由北京科为博生物技术研究院分离保藏。
39.1.1.2培养基
40.(1)lb培养基
41.胰蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，氯化钠10.0g，加蒸馏水至1000ml，ph7.0
±
0.1， 121℃，灭菌30min。
42.固体培养基：在液体培养基基础上添加1.6％琼脂粉。
43.1.2 试验方法
44.1.2.1 金黄葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌拮抗菌株的筛选
45.(1)病原指示菌菌种的活化
46.将金黄葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌菌种分别接种到lb液体培养基中，在37℃、180rpm条件下振荡培养16h，备用。
47.(2)益生菌培养物上清的制备
48.将益生菌菌种分别接种到lb液体培养基中，在37℃、180rpm条件下振荡培养 24h。
然后将培养液在3500rpm条件下离心10min，放入4℃冰箱备用。
49.(3)病原指示菌平板的制备
50.移取约5ml的lb琼脂培养基，顺时针转动使培养基平铺平板底部，待凝固，用无菌镊子在平板底部依次对称摆放4个牛津杯。将金黄葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌分别与已融化冷却至50℃的lb琼脂培养基按1:100比例混匀，分别移取约15ml含菌培养基至对应摆有牛津杯的培养皿内，待冷却凝固后，用无菌镊子将牛津杯剔除。
51.(4)上样
52.分别移取100μl益生菌培养物上清液于指示菌平板的牛津杯杯孔内，注意避免液体溢出或外溅。
53.(5)培养
54.将上完样的培养皿室温静置1-2h，然后将金黄葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌指示菌平板在37℃培养16-20h。
55.(6)观察、测量
56.拍照，用游标卡尺测量各抑菌圈的直径并记录。
57.1.2.2 金黄葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌拮抗菌株的鉴定
58.gyrb基因序列分析：细菌总dna的提取采用细菌基因组dna提取试剂盒提取。 gyrb基因扩增引物为：gyrbf：5'
–
gaagtcatcatgaccgttctgcaygcnggngg naarttyga-3'；gyrbr：5'
–
agcagggtacggatgtgcgagccrtcnacrtcngc rtcngtcat-3'。反应体系(20μl)：1μldna模板、0.5μl上游引物、0.5μl下游引物、0.2μl easy taq、2μl dntps、2μl 10
×
easy taq buffer、14μl ddh2o，以上成分于冰上添加，混匀后离心；pcr反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃ 退火30s，72℃延伸2min，32个循环，最后72℃延伸10min。pcr产物利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后送北京生工有限公司进行序列测定。得到的基因序列在 genbank数据库中进行blast同源性比对。
59.2 结果
60.2.1 金黄葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌拮抗菌株的筛选
61.筛选得到的菌株ca03001对无乳链球菌的抑制作用最强，抑菌直径为20.17mm， ca04121对金黄葡萄球菌的抑制作用最强，抑菌直径为19.24mm，两株菌对大肠杆菌均具有较强抑制作用，如表1所示，抑菌效果图见附图1-3。
62.表1抑菌直径
[0063][0064]
2.2菌株的鉴定
[0065]
ca03001菌株gyrb基因序列(seq no.1)：
[0066]
acagtccgccagtttgcccggcagattggaaatctcaagcgcacttttgcggcgggtcaattcccgcgcttttttcgctgccatccg cgctcttgcggccattaaacctttttcaacgattttgcgggctgagtccggattttcaagaaggaatgtttccagcgcagaagaaaac agcgtatcagtgatcgttctcgcttcggagttgccgagcttcgttttcgtctgcccttcgaattgcggatcagggtgcttaattgaaata atggcagtcagcccttccctcacatcatccccgcttaaattcggatcattttctttgaaaatcccttttcttcttgcatagtcgtttataaca cgggtcagaccggttttaaatccggcttcgtgcgtgccgccttcgtatgtgttgatattatttgtgaaagaataaatattgcttgtatagc tgtcgttgtattgcaatgcaacttcaaccgttatgccgtctttctcgccttcgatataaatcggctcttcatgaacgacttctttggaacg gtttaagtactcaacatagcttttgattccgccttcgtagtggtactcgtttttccgttcttgtccttcacgtttgtcttcaatcgtgatgttta caccttttgtcaggaaggccaattcccggacacggtttgaaagcaggtcatagtcgtattcggttgtttctttgaaaatttccggatcc ggaacgaagtgcgtaatcgttccggtcttatcagtatcaccgatcacttcaagatcggccacaggtacaccgcgctcgtacgcctg atagtggatttttccgtcacgatgaaccgtaacgtcaagagtggtcgacaaggcgtttacga。
[0067]
ca04121菌株gyrb基因序列(seq no.2)：
[0068]
tggaaactcgggtggcggaataggtgtcggcggtctgcacgggttggtgcgtctgttgtgaatgccctgtctacagagctcgatgt ctatgtccaccgcgacgggcatatttactaccaaaaataccgccgcggcaaacctgcctttgacttaaaaatcattggcgaaacgg atcgtaccggcacaacgactcacttcttgccggatccggaaatttttacggaaacgaccgagttcgactttgatattcttacaacccg gctccgtgaacttgcctttttaaataaagggatcaaaatcaccattgaggacaaacgcgaaaaaaatccgcgcatacaagaatacc attacgaaggcgggatcaaatcgtacgtggagcatttgaaccgctcgaaagaagtgctccataaggaaccgatttatgtagaagg cgaaaaagacggcataaccgttgaagtatcccttcaatacaatgacgggtttgccagcaatatctattcttttgccaataatattcaca cctacgaaggcggcacacctgagtccggttttaaaacggctttaacgcgcgtcatcaatgattatgcccggaaaaacaatatgatc aaagaaaatgaagccaatttaacgggcgaagatgtccgggaaggcctcactgcgattgtttccatcaaacacccggatccgcagt ttgaaggacaaacgaaaacgaagcttggaaatacagaagcaagaacgattacagatgcggtattttccgagacgtttgagaagttt atgatggaaaatcctcaagtggcgcggaaaattgtcgaaaaaggggtgatggctgcccgggcaaggatggctgcgaaaaaagc gcgcgaactgacacggagaaaaagcgcgctcgaatcgacaagcctaccgggcaaacttgcagactgcacatcacgcgacccg gctgagagcgagctctacattgtcgaaggagactcggccggcggttctgccaagcagggaagggaccggatgtttcaggcgat cctgcctttaagagggaaaattttaaacgtagagaaagcgcgtttggataaaattttgtcaaatgcggaaatccggaccattattacc gcgcttggcacaggtgtcggagaagattcgacatctagaaggcgcgtatcatagaagtcgagatccatagc。
[0069]
通过gyrb基因序列测定及序列分析，ca03001菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌 (bacillus velezensis)，ca04121菌株鉴定为凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)。菌株分别于2020年4月1日、2018年8月27保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为分别为cgmcc no.19349和cgmccno.16244。
[0070]
实施例2复合微生态制剂的制备
[0071]
1.贝莱斯芽孢杆菌的生产方法步骤如下：
[0072]
(1)将贝莱斯芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，于30-40℃下培养12-24小时；
[0073]
(2)将斜面培养的贝莱斯芽孢杆菌接种于种子活化液体培养基中，500ml三角瓶装液量为100-200ml，在30-40℃、180-220rpm的条件下培养12-24小时；
[0074]
(3)将贝莱斯芽孢杆菌种子液以0.5-2％重量比接种于种子罐中，500l种子罐装液量为100-200l，在30-40℃、180-220rpm的条件下培养12-24小时；
[0075]
(4)将种子罐培养液以0.5-2％重量比接种于发酵罐中，罐压为0.01-0.05mpa，搅拌转速为180-220rpm，以体积比计，通风比为0.5-1:0.1-0.5，发酵时间为16-24小时；
[0076]
(5)将贝莱斯芽孢杆菌发酵液通过干燥塔进行喷雾干燥，鼓风机进风温度 140-170℃；出口温度60-80℃，干燥后通过60目振动筛。
[0077]
步骤(1)中斜面培养基组成：胰蛋白胨5.0-15.0g，牛肉浸粉1.0-5.0g，氯化钠 5.0-10.0g，葡萄糖3.0-8.0g，琼脂15-20g，蒸馏水1000ml，ph为7.0-7.5；
[0078]
步骤(2)中种子培养基为步骤(1)斜面培养基中去除琼脂粉；
[0079]
步骤(3)中种子罐培养基和步骤(4)中发酵培养基组成：大豆蛋白胨1.0％-2.0％，豆饼粉1.0％-2％，葡萄糖1.0％-1.5％，玉米粉0.5％-2％，碳酸钙0.5％-2％，硫酸镁 0.001％-0.01％和硫酸锰0.001％-0.01％，ph为7.0-7.5。
[0080]
2.本发明凝结芽孢杆菌的生产方法包括如下步骤：
[0081]
(1)将凝结芽孢杆菌接种于斜面培养基上，在35-45℃兼性或厌氧条件下培养 24-48小时；
[0082]
(2)将斜面培养的凝结芽孢杆菌接种于液体种子活化培养基中，在35-45℃兼性或厌氧条件下培养24-48小时；
[0083]
(3)将步骤(2)所获得的种子液接种于发酵罐培养基，在35-45℃兼性或厌氧条件静置培养24-48小时。
[0084]
(4)将凝结芽孢杆菌发酵液通过干燥塔进行喷雾干燥，鼓风机进风温度 140-170℃；出口温度60-80℃，干燥后通过60目振动筛。
[0085]
所述步骤(1)中斜面培养基组成：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0ml，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂粉16g，蒸馏水1000ml，121℃，灭菌30min；
[0086]
步骤(2)中种子培养基为斜面培养基中去除琼脂粉；
[0087]
步骤(3)中发酵培养基组成：蛋白胨1％-2.0％，酵母粉0.5％-1.0％，玉米粉 0.5％-1.0％，葡萄糖1.0％-3.0％，柠檬酸二胺0.05％-0.10％，磷酸氢二钾0.05％-0.10％，硫酸镁0.05％-0.10％，硫酸锰0.05％-0.10％，调节ph值6.0-7.0。
[0088]
3.将贝莱斯芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌混合，以沸石粉为载体，混合后贝莱斯芽孢杆菌活菌数为5.0
×
10
9-1.0
×
10
10
cfu/g，凝结芽孢杆菌活菌数为5.0
×
10
9-1.0
×
10
10 cfu/g。
[0089]
实施例3复合微生态制剂对患乳房炎奶牛泌乳性能和乳体细胞数的影响
[0090]
1 试验材料
[0091]
贝莱斯芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和复合微生态制剂产品由北京科为博生物科技有限公司生产提供。
[0092]
2 试验方法
[0093]
2.1 试验分组设计及饲养管理
[0094]
选择胎次(2-4胎)、泌乳期(泌乳天数40d
±
3d)、泌乳量(25kg
±
1kg)等相近的患乳房炎的荷斯坦奶牛80头，随机分为4组，每组20头牛，第一组为对照组，饲喂基础日粮，第
二组为贝莱斯芽孢杆菌组，饲喂基础日粮同时每天添加100g/头贝莱斯芽孢杆菌制剂，第三组为凝结芽孢杆菌组，饲喂基础日粮同时每天添加100g/ 头凝结芽孢杆菌制剂，第四组为复合微生态制剂组，饲喂基础日粮同时每天添加 100g/头复合微生态制剂。
[0095]
所有奶牛采用全混合日粮饲喂，自由采食和饮水，预饲期7d，试验期28天。
[0096]
2.2 测定指标及方法
[0097]
试验期0d、7d、14d、21d和28d记录产奶量，并采用乳品检测仪测定乳成分、牛乳体细胞计数仪测定乳体细胞数。
[0098]
3 试验结果
[0099]
(1)对泌乳性能和乳品质的影响
[0100]
如表2所示，与对照组相比，复合微生态制剂组的泌乳量显著提高(p﹤0.05)，凝结芽孢杆菌组和贝莱斯芽孢杆菌组的泌乳量有提高趋势(p﹥0.05)；与对照组相比，复合微生态制剂组、凝结芽孢杆菌组和贝莱斯芽孢杆菌组的乳蛋白、乳脂率均有增加趋势(p﹥0.05)。
[0101]
表2对奶牛泌乳性能和乳品质的影响
[0102][0103]
注：同行肩标不同小写字母表示差异显著(p﹤0.05)，有相同字母表示差异不显著(p ﹥0.05)，下同。
[0104]
(2)对乳体细胞数的影响
[0105]
如表3所示，一般牛乳中体细胞数超过50万个/ml即表现为临床乳房炎，试验期内，对照组牛乳体细胞数一直高于该阈值，没有降低。饲喂贝莱斯芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和复合微生态制剂一周后，试验组牛乳中体细胞数均显著降低，饲喂3 周后复合微生态制剂组牛乳中体细胞降至27.03万个/ml，显著低于其他各组(p﹤ 0.05)，试验期结束时各试验组牛乳中体细胞数均小于50万个/ml。由此可知，在奶牛日粮中添加贝莱斯芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和复合微生态制剂能够有效降低牛乳中体细胞数，改善奶牛乳房炎。
[0106]
表3对牛乳体细胞数的影响(万个/ml)
[0107]
[0108]
4结论
[0109]
试验结果表明，饲喂由贝莱斯芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌组成的复合微生态制剂能够提高奶牛泌乳量、乳品质，降低牛乳中体细胞数，改善奶牛乳房炎，其中以复合微生态制剂效果最佳，复合微生态制剂的对牛乳体细胞的降低率大于单独使用贝莱斯芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌时的降低率之和，表明将贝莱斯芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌复合使用时具有协同增效的作用。
[0110]
本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法，在此不一一列举实施例。
[0111]
本发明未详细说明的内容均可采用本领域的常规技术知识。
[0112]
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

技术特征：

1.一种防治奶牛乳房炎的复合微生态制剂，其特征在于，所述复合微生态制剂由贝莱斯芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和载体组成；贝莱斯芽孢杆菌的保藏编号为cgmcc no.19349，凝结芽孢杆菌的保藏编号为cgmcc no.16244。2.根据权利要求1所述的一种防治奶牛乳房炎的复合微生态制剂，其特征在于，复合微生态制剂中贝莱斯芽孢杆菌活菌数为5.0
×
10
9-1.0
×
10
10
cfu/g，凝结芽孢杆菌活菌数为5.0
×
10
9-1.0
×
10
10
cfu/g。3.根据权利要求1所述的一种防治奶牛乳房炎的复合微生态制剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌的生产方法包括如下步骤：(1)将贝莱斯芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，于30-40℃下培养12-24小时；(2)将斜面培养的贝莱斯芽孢杆菌接种于种子活化液体培养基中，500ml三角瓶装液量为100-200ml，在30-40℃、180-220rpm的条件下培养12-24小时；(3)将贝莱斯芽孢杆菌种子液以0.5-2％重量比接种于种子罐中，500l种子罐装液量为100-200l，在30-40℃、180-220rpm的条件下培养12-24小时；(4)将种子罐培养液以0.5-2％重量比接种于发酵罐中，罐压为0.01-0.05mpa，搅拌转速为180-220rpm，以体积比计，通风比为0.5-1:0.1-0.5，发酵时间为16-24小时；(5)将贝莱斯芽孢杆菌发酵液通过干燥塔进行喷雾干燥，鼓风机进风温度140-170℃；出口温度60-80℃，干燥后通过60目振动筛。4.根据权利要求3所述的一种防治奶牛乳房炎的复合微生态制剂，其特征在于，步骤(1)中斜面培养基组成：胰蛋白胨5.0-15.0g，牛肉浸粉1.0-5.0g，氯化钠5.0-10.0g，葡萄糖3.0-8.0g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000ml，ph为7.0-7.5；步骤(2)中种子培养基为步骤(1)斜面培养基中去除琼脂粉；步骤(3)中种子罐培养基和步骤(4)中发酵培养基组成：大豆蛋白胨1.0％-2.0％，豆饼粉1.0％-2％，葡萄糖1.0％-1.5％，玉米粉0.5％-2％，碳酸钙0.5％-2％，硫酸镁0.001％-0.01％和硫酸锰0.001％-0.01％，ph为7.0-7.5。5.根据权利要求1所述的一种防治奶牛乳房炎的复合微生态制剂，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌的生产方法包括如下步骤：(1)将凝结芽孢杆菌接种于斜面培养基上，在35-45℃兼性或厌氧条件下培养24-48小时；(2)将斜面培养的凝结芽孢杆菌接种于液体种子活化培养基中，在35-45℃兼性或厌氧条件下培养24-48小时；(3)将步骤(2)所获得的种子液接种于发酵罐培养基，在35-45℃兼性或厌氧条件静置培养24-48小时；(4)将凝结芽孢杆菌发酵液通过干燥塔进行喷雾干燥，鼓风机进风温度140-170℃；出口温度60-80℃，干燥后通过60目振动筛。6.根据权利要求5所述的一种防治奶牛乳房炎的复合微生态制剂，其特征在于，所述步骤(1)中斜面培养基组成：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0ml，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂粉16g，蒸馏水1000ml，121℃，灭菌30min；步骤(2)中种子培养基为斜面培养基中去除琼脂粉；
步骤(3)中发酵培养基组成：蛋白胨1％-2.0％，酵母粉0.5％-1.0％，玉米粉0.5％-1.0％，葡萄糖1.0％-3.0％，柠檬酸二胺0.05％-0.10％，磷酸氢二钾0.05％-0.10％，硫酸镁0.05％-0.10％，硫酸锰0.05％-0.10％，调节ph值6.0-7.0。7.权利要求1-6任一项所述的一种防治奶牛乳房炎的复合微生态制剂的应用。8.根据权利要求7所述的一种防治奶牛乳房炎的复合微生态制剂的应用，其特征在于，所述应用为：将复合微生态制剂撒到奶牛养殖环境，使用量为5-10g/m2；或者，将复合生微生态制剂加入到日粮中，混合均匀，其添加量为50-100g/头。

技术总结

本发明公开了一种防治奶牛乳房炎的复合微生态制剂及其应用，以贝莱斯芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌为活性成分复配而成。本发明中的贝莱斯芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌菌株对金黄葡萄球菌、无乳链球菌和大肠杆菌等病原菌有较强抑制作用，复合使用一方面可抑制养殖环境中病原微生物，改善饲养环境，另一方面可抑制病原微生物对奶牛的感染，有效防治奶牛乳房炎。有效防治奶牛乳房炎。有效防治奶牛乳房炎。