一种鼠李糖乳杆菌及其组合物与应用的制作方法

1.本发明涉及微生物与食药技术领域，尤其是涉及一种鼠李糖乳杆菌及其组合物与应用。

背景技术：

2.肌肉减少症(sarcopenia，sp，简称肌少症)是一种以肌量、肌力和肌肉功能的渐进性和全身性下降为特征的肌肉系统疾病，导致患者活动受限和易于跌倒，死亡风险增加。骨质疏松症(osteoporosis，op)是一种以骨量降低、骨微结构破坏致骨脆性增加为特征的全身性骨豁疾病，op引起患者生活质量下降，致残率和致死率增加。由于肌肉减少症和骨质疏松症有着共同的病例生理机制，比如机械力学因素、遗传基因、炎症因素、内分泌因素。同时肌少症与骨质疏松症在肌肉萎缩、步态异常、疼痛、跌到与脆性骨折等临床表现有较强的关联性。2009年，binkley等基于肌少症和骨质疏松症相似的病理生理基础以及密切的相关性，提出了肌骨共减综合症(osteosarcopenia,os)的概念，主要指符合骨质疏松症的诊断标准并同时存在肌量/功能下降的患者。os患者表现为骨密度(bmd)下降，骨脆性增加，肌量、肌力和肌肉功能的进行性和全身性下降，导致患者虚弱、跌倒、骨折、住院、致残和致死风险增加。
3.根据肌骨共减综合症不同的诊断标准，肌骨共减综合症在60岁以上人中的发病率范围在5％～37％。目前，尚无防治肌骨共减综合症的靶向药物，目前有效的防治手段包括健脾补肾为主的中医，如cn202110982828.1公开了一种用于防治肌少骨质疏松症的中药组合物，组合物包括盐杜仲等中药或提取物，另外抗阻和平衡训练、营养摄入(补充维生素d和钙)等早期干预措施也能有效预防和缓解肌骨共减症症状。近年来，众多研究表明肠道微生物可作为营养对肌肉健康和骨骼健康影响的中介，如cn 111748640 b公开了肠道菌在肌少症中的应用，通过检测erysipelotrichaceae_ucg-003的丰度，可以诊断受试者是否患肌少症和/或患肌少症的风险，从而实现受试者的无创诊断；cn 111718873 b公开了一株具有缓解骨质疏松功效的发酵乳杆菌及其应用，该菌株显著提高去卵巢大鼠的骨密度和皮质体积。cn103889241 b公开了用于促进健康的骨生长和/或用于预防和/或骨疾病的组合物，其包含至少一种长链多不饱和脂肪酸(lc-pufa)、至少一种益生菌、和寡聚糖的混合物，所述的混合物含有至少一种n-乙酰化寡聚糖、至少一种唾液酸基化寡聚糖和至少一种中性寡聚糖，所述益生菌是乳杆菌或双歧杆菌。然而，现有益生菌技术仅单一视角对肌肉减少症和骨质疏松症进行孤立性研究，未见特定菌株及其后生元对肌骨共减综合症的研究报道，因此，开发新的菌株及其组合物，用于制备一种便捷、高效的对缓解与肌骨共减综合症的营养品或药物，具有重要的意义和极大的市场价值。

技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种生物活性高、碳源利用广、且能够耐受胃液、肠液和胆盐且具有预防或/和肌肉减少症或骨质疏松或肌骨共
减症的鼠李糖乳杆菌，本发明还提供了由鼠李糖乳杆菌组成的组合物，并提出了将鼠李糖乳杆菌及由其组成的组合物用于预防或/和肌肉减少症或骨质疏松或肌骨共减症的新应用。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
6.一种鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)s24，于2021年8月20日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m 2021986。
7.生物保藏说明：鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)s24，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏机构简称：cctcc，保藏日期：2021年8月6日(2021年8月6日接收登记入册，8月20日检测为存活，并保藏)，生物保藏编号为cctccno：m 2021986，菌株编号：鼠李糖乳杆菌s24。
8.其中，所述鼠李糖乳杆菌s24分离自植物源，具体地，鼠李糖乳杆菌s24从四川彭祖山农家酸面团中筛选分离得到。
9.本发明的鼠李糖乳杆菌s24的生物学性质如下：
10.1)形态学特征：在mrs琼脂培养基上生长良好，菌落呈近球形杆状，单个、成对或呈栅栏状排列、大小中等、乳白、向上凸起光泽、菌落边缘不整齐、易挑取，显微镜下呈成对或呈栅栏状排列，革兰氏染后呈阳性。
11.2)生物学鉴定：鼠李糖乳杆菌s24送至四川省微生物资源平台菌种保藏中心进行16s rrna鉴定，其16s rrna基因序列如seq id no:1所示，鼠李糖乳杆菌s24的16s rrna序列进行ncbi blast比对，基于16s rrna基因序列比对结果以b.subtilis ncdo 1769(nr118972)为外枝构建的neighbor-joining系统发育树，如图2所示，与genebank中的鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)相似度为100％，鉴定该菌株为鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)s24。
12.鼠李糖乳杆菌s24发酵用培养基为mrs或维生素d
3-mrs培养基，所述维生素d
3-mrs培养基包括蛋白胨10.0g/l，牛肉粉5.0g/l，酵母粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐温80 1.0g/l，k2hpo4·
7h2o 2.0g/l，无水乙酸钠5g/l，柠檬酸二氨2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.2g/l，mnso4·
h2o 0.038g/l，1000～4000iu维生素d3(加琼脂粉15g/l为固体培养基)，优选，维生素d
3-mrs培养基中的维生素d3可以促进短链脂肪酸的增加，特别是显著提高在肠肌轴，肠骨轴起重要作用的丁酸含量；维生素d3能促进提高鼠李糖乳杆菌s24对病原微生物抑菌能力大幅提高，对幽门螺杆菌atcc 26695，变异链球菌cgmcc1.2499，金黄葡萄球菌cmcc26003，产气荚膜梭菌atcc13124，白念珠菌atcc10231的抑菌效果。
13.本发明解决其技术问题所采用的另一技术方案是：
14.一种组合物，包括上述鼠李糖乳杆菌s24活菌株、鼠李糖乳杆菌s24的灭活菌株及菌株代谢产物、鼠李糖乳杆菌s24后生元和植物乳杆菌活菌株、发酵乳杆菌活菌株中的一种或多种的混合物，其中植物乳杆菌优选植物乳杆菌lp550和植物乳杆菌lp220，发酵乳杆菌优选发酵乳杆菌gf1800。优选，组合物为鼠李糖乳杆菌s24后生元。
15.本发明的鼠李糖乳杆菌s24后生元是指鼠李糖乳杆菌s24发酵液经加工/灭活、浓缩、干燥处理后的乳酸菌菌体及代谢成分统称，包括菌体成分与代谢产物。
16.所述组合物包括但不限于生物菌剂、功能性食品、保健品或药物。
17.所述功能性食品为酵素、泡菜、固体饮料、丸剂、片剂或微胶囊晶球中的任意一种。
18.所述药物还含有药学上可接受的载体。
19.所述药学上可接受的载体包括但不限于：填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或润滑剂中的一种或多种。
20.所示药物为防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症的药物，优选为口服药。
21.所述填充剂为岩藻多糖、海藻糖、乳糖、壳聚糖、淀粉或糊精中的一种或多种；所述粘合剂为液状葡萄糖、淀粉糊或糖浆的一种或多种；所述润湿剂为甘油或乙醇中的一种或多种；所述崩解剂为交联聚维酮、羧甲基淀粉钠或交联羧甲基淀粉钠的一种或多种；所述润滑剂为二氧化硅硬脂酸镁或硬脂酸富马酸钠的一种或多种。
22.本发明的鼠李糖乳杆菌s24及其s24后生元可以显著缓解肌骨共减症(简称：os)大鼠体重下降，鼠李糖乳杆菌s24与其s24后生元能明显提高os大鼠的全身骨密度和腰椎骨密度，进而预防骨质疏松症(op)的形成。
23.本发明的鼠李糖乳杆菌s24及其s24后生元能显著提高os大鼠的前肢抓力、全身骨骼肌量和四肢骨骼肌量，实现对肌肉减少症(sp)的有效防治。
24.鼠李糖乳杆菌s24还可以促进os大鼠的腓肠肌pi3k蛋白表达，鼠李糖乳杆菌s24通过上调pi3k信号通路相关蛋白的表达，进而防治肌骨共减症os。
25.鼠李糖乳杆菌s24还能促进增加os大鼠肠道中乳杆菌、双歧杆菌丰度，进而达到防治肌骨共减症os。
26.基于本发明的鼠李糖乳杆菌s24的上述特性，本发明鼠李糖乳杆菌及其后生元的应用之一：
27.鼠李糖乳杆菌s24在制备防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症的功能性食品或药物中的应用；或者，鼠李糖乳杆菌s24与其灭活菌株、菌株代谢产物或鼠李糖乳杆菌s24后生元中的一种或多种形成的组合物在制备防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症的功能性食品或药物中的应用。
28.在某一示范实施例中，鼠李糖乳杆菌s24的用量≥6
×
108cfu/per mouse/day，鼠李糖乳杆菌s24的灭活菌株的用量为3～8
×
10
10
cfu/day，鼠李糖乳杆菌s24后生元的用量为≥6
×
108个/per mouse/day，游离氨基酸＞1mg/g。
29.其次，抑菌实验表明：鼠李糖乳杆菌s24对致病菌具有广泛的抑菌性。具体表现为对幽门螺杆菌atcc 26695、变异链球菌cgmcc1.2499、金黄葡萄球菌cmcc26003、产气荚膜梭菌atcc13124、白念珠菌atcc10231都具有较好的抑制效果，其中对变异链球菌cgmcc1.2499抑制最好。
30.基于鼠李糖乳杆菌s24的上述特性，本发明鼠李糖乳杆菌及其后生元的另一应用：
31.鼠李糖乳杆菌s24及其后生元在制备抑制致病菌的功能性食品或药物中的应用。
32.本发明的鼠李糖乳杆菌s24对胃酸、胆盐耐受性试验显示，鼠李糖乳杆菌s24在胃液ph2.0时菌株存活率达43.17％；当胆盐浓度达到3.0g/l时，菌株存活率达91.54％。鼠李糖乳杆菌s24具有非常好的胃酸、胆盐耐受性，适于口服。
33.鼠李糖乳杆菌s24能够利用l-阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、棉籽糖、鼠李糖、海藻糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、蜜二糖、d-松二糖、d-塔格糖、山梨糖、山梨醇、
甘露醇、七叶灵、n-乙酰-葡糖胺、α-甲基-d-甘露糖甙，具有广谱的碳源利用能力。其产酸能力强，发酵初期产酸迅速，产酸量大，且随着发酵时间的增加，其产酸量趋于平稳。基于上述特性，本发明鼠李糖乳杆菌及其后生元的再一应用：
34.鼠李糖乳杆菌s24及其后生元作为发酵剂在制备发酵食品、保健食品或膳食补充剂中的应用。
35.鼠李糖乳杆菌s24的用量为1
×
108～1
×
10
10
cfu/ml或1
×
108～1
×
10
10
cfu/g，后生元的用量为1～50g/kg或1～50g/l，游离氨基酸＞1mg/g。
36.本发明一种鼠李糖乳杆菌的有益效果：
37.该鼠李糖乳杆菌s24在mrs琼脂培养和维生素d
3-mrs培养基上生长良好，其生物活性高，具有广泛的碳源利用能力，产酸特性好，能够耐受人工胃液、肠液、胆盐。
38.所述鼠李糖乳杆菌s24与维生素d3能够起到协同促进作用，包括促进生长，提高短链脂肪酸含量，协同抑菌作用。
39.本发明的鼠李糖乳杆菌s24及后生元组能显著抑制os大鼠的体重下降，显著提高骨骼肌质量指数、四肢骨骼质量指数、全身骨密度、腰椎骨密度和前肢抓力，进而延缓或改善肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症，并通过增加pi3k蛋白表达，以及提高肠道乳杆菌、双歧杆菌的丰度等多种途径来预防和肌骨共减综合征。
40.本发明鼠李糖乳杆菌s24具有良好的安全性，鼠李糖乳杆菌s24的应用广泛，可用于制备防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症的功能性食品或药物，或抑制致病菌的功能性食品或药物，或作为发酵剂用于制备发酵食品、保健食品。
附图说明
41.图1为鼠李糖乳杆菌s24在mrs琼脂培养基上的菌落形态，其中，(a)平板菌落形态图，(b)显微镜下菌株形态图；
42.图2为鼠李糖乳杆菌s24系统发育树；
43.图3为鼠李糖乳杆菌s24对胃液的耐受能力；
44.图4为鼠李糖乳杆菌s24对胆盐的耐受能力；
45.图5为鼠李糖乳杆菌s24在mrs、维生素d
3-mrs培养基中的生长曲线；
46.图6为鼠李糖乳杆菌s24在mrs、维生素d
3-mrs培养基中发酵的产酸曲线；
47.图7为不同实验组的大鼠全身骨密度和腰椎骨密度对比分析图；其中，(a)大鼠全身骨密度，(b)大鼠腰椎骨密度；
48.图8为不同实验组的大鼠前肢抓力的对比分析图；
49.图9为不同实验组的大鼠的smi(a)和rsmi(b)对比分析图；
50.图10为不同实验组的大鼠中腓肠肌pi3k蛋白表达水平分析图。
具体实施方式
51.以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
52.本发明各实施例中所涉及的培养基配方：
53.mrs培养基(鼠李糖乳杆菌s24)：蛋白胨10.0g/l，牛肉粉5.0g/l，酵母粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐温80 1.0g/l，k2hpo4·
7h2o 2.0g/l，无水乙酸钠5g/l，柠檬酸二氨2.0g/l，
mgso4·
7h2o 0.2g/l，mnso4·
h2o 0.038g/l，(加琼脂粉15g/l为固体培养基)。
54.维生素d
3-mrs培养基(鼠李糖乳杆菌s24)(简称：vd
3-mrs)：蛋白胨10.0g/l，牛肉粉5.0g/l，酵母粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐温80 1.0g/l，k2hpo4·
7h2o2.0g/l，无水乙酸钠5g/l，柠檬酸二氨2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.2g/l，mnso4·
h2o0.038g/l，4000iu维生素d3(加琼脂粉15g/l为固体培养基)。
55.实施例1
56.本发明的一种鼠李糖乳杆菌s24(lactobacillus rhamnosuss24)，保藏编号：cctcc no:m 2021986。
57.1)鼠李糖乳杆菌s24的分离、筛选
58.从四川彭祖山农家酸面团中采集微生物筛选样品，将采集的样品剪碎后称取1g，放入9ml无菌生理盐水中，充分震荡混匀后，10倍梯度稀释涂布于mrs固体培养基中，37℃培养48h。肉眼观察，挑取培养基中不同形态大小的单菌落，反复划线纯化培养；再通过革兰氏染和溶钙法初步确定为乳酸菌，并将纯化的菌株用45％甘油保存于-80℃冰箱备用。
59.a)形态观察
60.将纯化的鼠李糖乳杆菌s24划线于mrs琼脂培养基上，37℃倒置培养48h后，对菌株的菌落形态进行观察，结果如附图1所示：所述菌株在mrs琼脂培养基上生长良好，菌落呈近球形杆状，单个、成对或呈栅栏状排列、大小中等、乳白、向上凸起光泽、菌落边缘不整齐、易挑取，革兰氏染后呈阳性，显微镜下呈成对或呈栅栏状排列。
61.b)菌株分子生物学鉴定
62.将纯化的菌株送至四川省微生物资源平台菌种保藏中心进行16s rrna鉴定，将测得的16s rrna序列进行ncbi blast比对，与genebank中的鼠李糖乳杆菌相似度为100％，可初步鉴定该菌株为鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)。该菌株的16s rrna鉴定序列如seq id no:1所示，命名为鼠李糖乳杆菌s24(lactobacillus rhamnosuss24)，鼠李糖乳杆菌s24基于16s rrna基因序列比对结果以b.subtilis ncdo 1769(nr118972)为外枝构建的neighbor-joining系统发育树见图2。
63.2)鼠李糖乳杆菌s24对人体胃肠耐受性试验
64.①
鼠李糖乳杆菌s24对胃液和肠液的耐受性
65.配制模拟胃液：nacl 2.0g/l，用hcl将ph值分别调至2.0、2.5、3.0和4.0，进行高压灭菌，胃蛋白酶3.2g/l，胃蛋白酶在实验时现加现用；配制模拟肠液：磷酸二氢钾6.8g/l，用naoh将ph值调至7.5，进行高压灭菌，胰蛋白酶10.0g/l，胰蛋白酶在实验时现加现用；取甘油管保存的鼠李糖乳杆菌s24菌种以10％的接种量接种至mrs培养基中37℃活化24h；将等量的鼠李糖乳杆菌s24菌液加入到体系50ml模拟胃液中，记录初始活菌，37℃恒温培养3h后测定活菌数。对检测的乳酸菌活菌进行统计，并计算存活率，菌株存活率＝试验组/对照组
×
100％。
66.当食物进入胃中时，胃酸即开始分泌。人体正常的胃分泌的胃酸浓度ph值约为0.5-1.5。胃在排空时ph值约在7.0
ꢀ‑
7.2间，当食物进入胃中时，ph值迅速下降到2-3。饭后胃液稀释，ph上升至3.5左右。参见图3，ph2.0时，s24存活率为43.17％；ph2.50时，s24存活率为65.79％；在ph3.0时，s24存活率为87.12％；在进食以后服用的鼠李糖乳杆菌s24菌株能够耐受胃液，且在肠道中，鼠李糖乳杆菌s24菌株能够耐受肠液。
67.②
鼠李糖乳杆菌s24对胆盐的耐受性
68.将鼠李糖乳杆菌s24菌株按5％的接种量接种到mrs液体培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次。将活化好的s24菌液按5％的接种量接种到mrs液体培养基中，于恒温培养箱中37℃静置培养15h。将培养好的菌液采用5000rpm离心10min收集菌体，并用无菌生理盐水将菌体震荡均匀。
69.按10％的添加量将震荡均匀的菌液加入到胆盐浓度分别为1.0g/l、2.0g/l、3.0g/l和0.0g/l(初始菌液)的mrs培养基中，以胆盐浓度为0.0g/l为对照组。然后于37℃恒温培养箱中孵育3h。将孵育后的菌液取出，立即按照10倍稀释加入无菌生理盐水，拍打混匀后检测乳酸菌数；对检测的乳酸菌活菌进行统计，并计算存活率，计算公式如下：
70.菌株存活率(％)＝试验组/对照组
×
100％。
71.鼠李糖乳杆菌s24胆盐耐受性数据如附图4所示：当胆盐浓度为1.0g/l和2.0g/l时，菌株的存活率分别为99.87％和94.09％，但当胆盐浓度达到3.0g/l时，菌株存活率仍达到91.54％。肠道内的胆盐浓度不超过3.0g/l，说明s24菌株能够耐受肠道内的胆盐。
72.3)鼠李糖乳杆菌s24生理生化特性
73.①
发酵底物利用能力
74.将新鲜斜面培养的待试乳酸菌穿刺接种于培养基中，或用新鲜培养的菌液滴加入融化的软琼脂柱内(温度47
±
1℃)，混匀后，在上方加盖一层约7mm厚的2％琼脂，置于37℃培养48h后，培养基由紫变黄判定菌株利用碳源产酸。
75.实验结果如表1所示，鼠李糖乳杆菌s24菌株能利用l-阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、松叁糖、棉籽糖、鼠李糖、海藻糖、核糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、蜜二糖、d-松二糖、d-塔格糖、山梨糖、山梨醇、甘露醇、七叶灵、柳醇、n-乙酰-葡糖胺、α-甲基-d-甘露糖甙等23种碳源底物进行发酵产酸。
76.表1菌株鼠李糖乳杆菌s24生理生化特性
–
利用碳源产酸
77.[0078][0079]
注：+：阳性反应；-:阴性反应；w:弱阳性反应
[0080]
②
鼠李糖乳杆菌s24在不同培养基中的生长性能试验
[0081]
将鼠李糖乳杆菌s24菌株菌种按5％的接种量分别接种到mrs、维生素d
3-mrs培养基液体培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次。将活化好的鼠李糖乳杆菌s24菌液按5％的接种量对应接种到mrs与维生素d
3-mrs液体培养基中，混合均匀后按8ml/支分装到无菌试管中(18mm
×
180mm)；将分装好的鼠李糖乳杆菌s24菌液放置37℃恒温培养箱中静置培养，并取3支试管测定菌液吸光度值od
600
，计算平均值；每隔一定时间，取3支试管测定s24菌液吸光度值od
600
，计算平均值；以时间为横坐标，吸光度值od
600
为纵坐标，绘制生长曲线。
[0082]
所述鼠李糖乳杆菌s24菌株在mrs与维生素d
3-mrs培养基中的生长曲线如附图5所示，从图5中可以看出，鼠李糖乳杆菌在维生素d3-mrs液体培养基中生长显著优于mrs液体培养基，od
600
在18h提高35％，表明维生素d3显著促进鼠李糖乳杆菌s24生长。
[0083]
③
鼠李糖乳杆菌s24对致病菌的抑菌能力试验
[0084]
对致病菌抑菌实验：在无菌平板中倾倒10ml的水琼脂培养基，待冷却凝固后放上
牛津杯，将指示菌菌悬液(幽门螺杆菌atcc 26695，变异链球菌cgmcc1.2499，金黄葡萄球菌cmcc26003，产气荚膜梭菌atcc 13124，白念珠菌atcc 10231)分别加入到冷却至50℃的指示菌所对应生长的琼脂培养基中，使指示菌浓度为106cfu/ml，混匀，将其倒在底层水琼脂上面，待其凝固后，用镊子取出牛津杯，即形成孔洞，向每个孔中加入200μl的待测样品(待测样品包括mrs培养基鼠李糖乳杆菌s24发酵液，维生素d
3-mrs的鼠李糖乳杆菌s24发酵液)，扩散30min，37℃培养15-24h。观察培养孔周围是否出现抑菌圈并用游标卡尺测量其直径，记录抑菌圈直径，最终根据抑菌圈的有无及大小评价抑菌活性。
[0085]
表2不同培养基培养得到的鼠李糖乳杆菌s24发酵液的抑菌能力分析
[0086][0087][0088]
结果如表2所示，相对于mrs培养基发酵获得的鼠李糖乳杆菌s24，mrs培养基中加入维生素d3后发酵获得的鼠李糖乳杆菌s24对病原微生物抑菌能力大幅提高，对幽门螺杆菌atcc 26695，变异链球菌cgmcc 1.2499，金黄葡萄球菌cmcc 26003，产气荚膜梭菌atcc 13124，白念珠菌atcc 10231抑菌圈都达到20mm以上，结合鼠李糖乳杆菌在维生素d
3-mrs培养基中菌数增加，但总酸减少，说明鼠李糖乳杆菌s24在维生素d
3-mrs培养基中抗菌肽等抗菌物质含量得到提高，进而鼠李糖乳杆菌s24抑菌性能得到显著提高。
[0089]
④
鼠李糖乳杆菌s24产酸能力试验
[0090]
将鼠李糖乳杆菌s24菌株菌种按5％的接种量分别接种到mrs、维生素d
3-mrs培养基液体培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次。将活化好的s24菌液按5％的接种量对应接种到mrs、维生素d
3-mrs培养基液体培养基中，混合均匀后按8ml/支分装到无菌试管中(18mm
×
180)。将分装好的鼠李糖乳杆菌s24菌液放置在37℃恒温培养箱中静置培养，并取3支试管测定菌液总酸，计算平均值；每隔一定时间，取3支试管测定菌液总酸，并以时间为横坐标，以产酸量为纵坐标，绘制产酸曲线，产酸曲线如图6所示。
[0091]
鼠李糖乳杆菌s24在维生素d
3-mrs液体培养基中产酸受到抑制，由于维生素d3在中性环境中稳定，但在酸性环境中易吸收，因此，较少的产酸有利于维生素d3的稳定性，通过hplc进一步分析表明，鼠李糖乳杆菌s24在维生素d
3-mrs液体培养基发酵的总酸中短链脂肪酸得到显著提高，特别是丁酸含量(表3)，相对在mrs液体培养基中发酵的丁酸含量提高
了186.35％，以上结果表明：维生素d3可显著抑制鼠李糖乳杆菌s24总酸的产生，但可以提高短链脂肪酸的增加，特别是显著提高在肠肌轴，肠骨轴起重要作用的丁酸含量。
[0092]
表3短链脂肪酸检测结果
[0093][0094]
注：短链脂肪酸定量单位为μg/ml
[0095]
实施例2
[0096]
一种组合物，包括鼠李糖乳杆菌s24后生元，所述后生元中含鼠李糖乳杆菌菌体数500亿个/g，游离氨基酸＞1mg/g，所述后生元的制备方法为：将鼠李糖乳杆菌s24在维生素d
3-mrs液体培养基中进行发酵得到发酵液进行浓缩、喷干含有菌体及代谢产物的固体粉末。
[0097]
实施例3
[0098]
鼠李糖乳杆菌s24及其后生元在制备防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症的功能性食品或药物中的应用。
[0099]
受试样品：实施例1中的鼠李糖乳杆菌s24菌粉(活菌数500亿cfu/g)，采用mrs培养基发酵培养获得；实施例2中的鼠李糖乳杆菌s24后生元(菌体数500亿个/g，游离氨基酸＞1mg/g)，其制备方法为：将鼠李糖乳杆菌s24在维生素d
3-mrs液体培养基中进行发酵得到发酵液进行浓缩、喷干含有菌体及代谢产物的固体粉末。
[0100]
鼠李糖乳杆菌s24对肌骨共减症的作用研究试验
[0101]
试验分组：购自成都达硕公司的30只spf级sd大鼠按体质量随机分为5组，即正常组(con组)、假手术组(shm组)、肌骨共减症模型组(os组)、os鼠李糖乳杆菌s24(os+s24组)和os鼠李糖乳杆菌s24后生元(os+s24后生元组)，其中：os组、os+s24组和os+s24后生元组大鼠采用去势法造模，shm组采用假手术造模，除con组外，其余各组大鼠术后均每日肌内注射青霉素钠8万单位/只，连续3d。术后恢复7d，7d后开始对os组、os+s24组和os+s24后生元组大鼠腹腔注释地塞米松磷酸钠注射液(dxm)1mg(/kg
·
d)，连续2周。造模结束后，开始进行药物干预。con组、shm组和os组大鼠每天灌胃10ml/kg生理盐水，os+s24组连续12周灌胃鼠李糖乳杆菌s24菌粉(6
×
108cfu/per mouse/day)，os+s24后生元组连续12周灌胃鼠李糖乳杆菌s24后生元(6
×
108个/per mouse/day)，实验结果完成后对数据进行分析，与con组相比，ap《0.05；与shm组相比，bp《0.05；与os组相比，cp《0.05；与os+s24组相比，dp《0.05。
[0102]
①
大鼠一般情况观察及体重变化分析
[0103]
灌胃期间每天观察并记录各组大鼠的摄食活动、精神状态及异常行为等。干预结束后，每周定时用电子秤测量各组大鼠体重(bodyweight，bw)。
[0104]
实验过程中，各组无老鼠死亡。os组大鼠较其他组皮毛光干燥，毛发乱，光泽度下降。os+s24组、os+s24后生元组大鼠较os组皮毛光泽，毛发柔和，精神与活动度正常。不同试验组的大鼠体重变化如表4所示。各剂量组与对照组、shm组之间无显著性差异(p》0.05)；os组相对con组、shm组，其体重上升幅度明显偏小，这与肌骨共减患者在临床上的表现之一——体重减轻一致；os+s24组、os+s24后生元组与os组相比，其体重变化存在显著性差
异，说明s24与s24后生元可以有效缓解os大鼠体重下降，即，长期口服鼠李糖乳杆菌s24活菌株或其后生元能有效预防动物肌骨共减症，且生长安全性良好。
[0105]
表4各实验组大鼠体重变化
[0106][0107][0108]
注释：与con组相比，ap《0.05；与shm组相比，bp《0.05；与os组相比，cp《0.05；与os+s24组相比，dp《0.05。
[0109]
②
各组大鼠骨密度变化分析
[0110]
试验方法：干预结束后、取材前，将上述各组大鼠麻醉，用双能x线骨密度仪测量各组大鼠全身骨密度(bone mineral density，bmd)、腰椎bmd。
[0111]
参见图7，试验结果表明：与con组和shm组相比，os组大鼠全身bmd和腰椎bmd明显下降(p《0.05)，说明造模成功；与os组相比，os+s24与os+s24后生元组大鼠全身bmd和腰椎bmd显著增加(p《0.05)，表明鼠李糖乳杆菌s24及其后生元可明显改善肌骨共减症大鼠(os组)的骨密度，进而有效防治骨质疏松症op。
[0112]
③
各组大鼠前肢抓力、smi和rsmi比较分析
[0113]
试验方法：干预结束后，使用抓力仪每周固定时间测量大鼠前肢抓力(forelimb grip strength)。测试前让大鼠在抓力仪上适应5分钟，然后抓住大鼠尾巴水平缓慢向后拉，直到大鼠前肢无法抓住横杆，记录仪器上的最大抓力读数。测定三次并记录，用三次抓力的平均值作为反映前肢肌肉力量的指标。双能x线骨密度仪测量各组大鼠全身骨骼肌量(lean mass，lm)和四肢骨骼肌量(appendicular lean mass，alm)。并计算大鼠骨骼肌质量指数(smi＝lm/bw)和四肢骨骼肌质量指数(rsmi＝alm/bw)。
[0114]
参见图8和图9，与con组和shm组比较，os组大鼠前肢抓力显著下降(p《0.05)，smi和rsmi也下降明显(p《0.05)；与os组和con组比较，os+s24组和os+s24后生元组大鼠前肢抓力、smi和rsmi明显增加(p《0.05)，相比os组的大鼠前肢抓力、smi和rsmi分别提高了29.40％、43.48％、45.74％，甚至，相比con组的大鼠前肢抓力、smi和rsmi分别提高了15.85％、13.6％、45％。表明：os+s24组和os+s24后生元组可显著改善肌骨共减症大鼠(os)的前肢抓力和骨骼肌量，不仅使肌骨共减症的大鼠的前肢抓力和骨骼肌量恢复，还可以促
进前肢抓力和骨骼肌量的进一步增强，有效防止防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合征。
[0115]
④
各组大鼠腓肠肌pi3k信号通路相关蛋白表达比较分析
[0116]
试验方法：采用蛋白免疫印迹法检测pi3k蛋白表达水平。具体操作为：取各组试验大鼠的冻存腓肠肌，液氮下研磨粉碎，并用裂解液裂解，提取总蛋白，采用bca法测蛋白浓度，蛋白样品变性。配制凝胶、电泳、转膜、封闭。依次加入pi3k(1:1000)和gapdh(1:1000)在4℃孵育过夜。tbst洗涤3次，每次15min。hrp标记的羊抗兔igg抗体室温孵育1h，tbst洗涤3次，每次15min。利用全能型凝胶成像系统显影，并采用image j软件定量分析蛋白条带。
[0117]
试验结果如图10所示，与con组和shm组比较，os组大鼠腓肠肌pi3k蛋白表达明显降低；与os组相比，os+s24和os+s24后生元组大鼠腓肠肌pi3k蛋白表达显著增加(p《0.05)。表明鼠李糖乳杆菌s24和鼠李糖乳杆菌s24后生元可能通过上调pi3k信号通路相关蛋白表达来防治肌骨共减综合征(os)。
[0118]
⑤
各组大鼠粪便中乳杆菌、双歧杆菌丰度检测分析
[0119]
参照专利cn113234622a方法对粪便中乳杆菌、双歧杆菌进行检测，试验结果见表5，与con组和shm组比较，os组大鼠肠道中乳杆菌、双歧杆菌显著减少；与os组相比，os+s24和os+s24后生元组大鼠肠道中乳杆菌、双歧杆菌显著增加(p《0.05)，表明鼠李糖乳杆菌s24和鼠李糖乳杆菌s24后生元可通过增加肠道中乳杆菌、双歧杆菌丰度来防治肌骨共减综合征(os)。
[0120]
表5鼠李糖乳杆菌s24调节大鼠肠道菌作用(lg cfu/g)
[0121][0122]
综上所述，与con组和shm组相比，os组大鼠全身bmd、腰椎bmd、smi和rsmi明显降低，表明去势法联合dxm可导致大鼠发生肌骨共减综合症(简称os)。与os组相比，os+s24组、os+后生元s24组大鼠体重、全身bmd、腰椎bmd、前肢抓力、smi和rsmi明显增加，表明：鼠李糖乳杆菌s24及其后生元可明显改善os大鼠体重下降、bmd、肌力和肌量，进而有效防治肌骨共减综合症。此外，鼠李糖乳杆菌s24及其后生元显著提高了os大鼠腓肠肌中pi3k蛋白表达水平，表明鼠李糖乳杆菌s24及其后生元防治os的作用可能与上调pi3k信号通路相关蛋白表达水平有关，同时，鼠李糖乳杆菌s24和鼠李糖乳杆菌s24后生元可增加肠道中乳杆菌、双歧杆菌的丰度调节肠道菌来防治肌骨共减综合症。
[0123]
实施例4
[0124]
本实施例的一种组合物，包括鼠李糖乳杆菌s24活菌株和鼠李糖乳杆菌s24的灭活菌株，其中，鼠李糖乳杆菌s24活菌株如实施例2所述；鼠李糖乳杆菌s24的灭活菌株为采用在维生素d
3-mrs液体培养基中37℃条件下培养48h后，得到鼠李糖乳杆菌s24菌液，菌液在
125℃，灭菌5分钟；将灭活后菌液经8000g离心5min，得到鼠李糖乳杆菌s24的灭活菌株；鼠李糖乳杆菌s24活菌株与鼠李糖乳杆菌s24的灭活菌株的重量比为1:3。
[0125]
本实施例的一种组合物，在制备肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症的功能性食品或药物中的应用，使用时，该组合物中鼠李糖乳杆菌s24用量为1.0*10
11
cfu/day，灭活鼠李糖乳杆菌s24用量为6.0*10
10
cfu/day。
[0126]
实施例5
[0127]
鼠李糖乳杆菌s24在制备防治os的功能性食品或药物中的应用，鼠李糖乳杆菌s24用量为1.0
×
10
11
cfu/day。
[0128]
其中，鼠李糖乳杆菌s24如实施例1中所述采用mrs培养基培养获得。
[0129]
实施例6
[0130]
本实施例的一种组合物，包括质量比为1:2:1的鼠李糖乳杆菌s24活菌株、鼠李糖乳杆菌s24的灭活菌株和鼠李糖乳杆菌s24后生元。
[0131]
由实施例1的3)
‑③
鼠李糖乳杆菌s24对致病菌的抑菌能力试验可知，鼠李糖乳杆菌s24活菌株对常见的幽门螺杆菌atcc 26695，变异链球菌cgmcc1.2499，金黄葡萄球菌cmcc26003，产气荚膜梭菌atcc13124，白念珠菌atcc10231等致病菌具有良好的抑制作用。
[0132]
本实施例的组合物具有抑菌作用，在制备抑制致病菌的功能性食品或药物中的应用，致病性螺杆菌包括幽门螺杆菌atcc 26695，变异链球菌cgmcc1.2499，金黄葡萄球菌cmcc26003，产气荚膜梭菌atcc13124，白念珠菌atcc10231。使用时，鼠李糖乳杆菌s24活菌株的用量为1
×
10
10
cfu/day，鼠李糖乳杆菌s24的灭活菌株为2
×
10
10
cfu/day，后生元的用量为100mg/day。
[0133]
实施例7
[0134]
本实施例的一种组合物，包括鼠李糖乳杆菌s24活菌株和鼠李糖乳杆菌s24菌株代谢物。
[0135]
根据实施例1可知，在mrs培养基上培养的鼠李糖乳杆菌s24活菌株具有较好的产酸与抑菌能力，本实施例的组合物作为发酵剂在制备发酵食品、保健食品中的应用。
[0136]
所述发酵食品为泡菜，本实施例的组合物作为发酵剂在制备泡菜中的应用方法具体如下：
[0137]
选用新鲜蔬菜洗净后，加入到4-5倍重量份的饮用水中，再加入总体积1％的食用葡萄糖，总体积0.5-2.0％的食用氯化钠，再接入本发明实施例1制备的鼠李糖乳杆菌s24，使其浓度达到107cfu/ml以上，在室温下发酵5-24h后，得到添加了含鼠李糖乳杆菌s24和鼠李糖乳杆菌s24菌株代谢物的组合物的发酵泡菜。该发酵泡菜口味爽脆，风味独特，并含有鼠李糖乳杆菌s24菌体及代谢产物，具有良好安全性和益生功能。
[0138]
实施例8
[0139]
本实施例的一种组合物，按重量份计，包括鼠李糖乳杆菌s24菌粉(4.0
×
10
10
cfu/g)14份、植物乳杆菌lp550(4.0
×
10
10
cfu/g)10份,植物乳杆菌lp220(4.0
×
10
10
cfu/g)4份,鼠李糖乳杆菌s24后生元(细胞数4.0
×
10
10
个/g)1份及辅料，所述辅料包括脱脂奶粉10重量份、抗性淀粉10重量份、麦芽糊精10重量份、透明质酸纳10重量份、樱桃提取物10重量份、维生素c 5重量份、叶酸3重量份、维生素d31重量份。
[0140]
先称取脱脂奶粉10重量份、抗性淀粉10重量份、麦芽糊精10重量份、透明质酸纳10重量份、樱桃提取物10重量份、维生素c 5重量份、叶酸3重量份、维生素d31重量份，混合均匀，采用浓度为30％酒精湿法20目筛网制粒成湿颗粒，55℃烘干3.5小时，20目筛网整粒后，再添加鼠李糖乳杆菌s24菌粉(4.0
×
10
10
cfu/g)14份、植物乳杆菌lp550(4.0
×
10
10
cfu/g)10份、植物乳杆菌lp220(4.0
×
10
10
cfu/g)4份,鼠李糖乳杆菌s24后生元(细胞数4.0
×
10
10
个/g)1份、硬脂酸镁2份，均匀混合后旋转式压片机压片，得到具有鼠李糖乳杆菌s24膳食补充剂的片剂。
[0141]
本实施例的组合物用于制备具有防治肌骨共减综合症。
[0142]
实施例9
[0143]
本实施例的一种组合物，按重量份计，包括鼠李糖乳杆菌s24(4.0
×
10
10
cfu/g)15重量份、鼠李糖乳杆菌s24后生元(4.0
×
10
10
个/g)1重量份、植物乳杆菌lp220(4.0
×
10
10
cfu/g)9重量份，发酵乳杆菌gf1800(4.0
×
10
10
cfu/g)10重量份、麦芽糊精10重量份、山梨糖醇10重量份、玉米肽10重量份、透明质酸纳10重量份、鹅肌肽4重量份、大豆肽4重量份、低聚木糖2重量份、西兰花种子水提物2重量份、富硒酵母2重量份、叶酸2重量份、苹果酸2重量份、谷胱甘肽2重量份、维生素e 2重量份、维生素c 2重量份、维生素d31重量份。
[0144]
该组合物的原料先过40目筛网后，按配比混合均匀，使用螺杆背封包装机装袋，制备成2-10g/袋具有防治肌骨共减综合症的固体饮料。
[0145]
实施例10
[0146]
鼠李糖乳杆菌s24在制备防治肌骨共减症的功能性食品或药物中的应用，鼠李糖乳杆菌s24用量为1.0
×
10
11
cfu/day。
[0147]
其中，鼠李糖乳杆菌s24如实施例1所述在mrs培养基上培养获得。
[0148]
实施例11
[0149]
鼠李糖乳杆菌s24后生元在制备防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症的功能性食品或药物中的应用，使用时，鼠李糖乳杆菌s24后生元的用量为1.0*10
11
个/day。
[0150]
其中，鼠李糖乳杆菌s24后生元如实施例2所述制备。
[0151]
实施例12
[0152]
鼠李糖乳杆菌s24及其后生元在防治os的功能性食品或药物中的应用，其中，鼠李糖乳杆菌s24用量为5*10
10
cfu/day，鼠李糖乳杆菌s24后生元用量为5*10
10
个/day。所述鼠李糖乳杆菌如实施例1所述在维生素d
3-mrs培养基培养获得，所述鼠李糖乳杆菌后生元如实施例2所述培养获得。

技术特征：

1.一种鼠李糖乳杆菌，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌命名为鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)s24，于2021年8月6日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2021986。2.如权利要求1所述鼠李糖乳杆菌，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌s24的16s rrna基因序列如seq id no:1所示。3.如权利要求1所述鼠李糖乳杆菌，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌s24发酵用培养基为mrs或维生素d
3-mrs培养基，所述维生素d
3-mrs培养基包括蛋白胨10.0g/l，牛肉粉5.0g/l，酵母粉4.0g/l，葡萄糖20.0g/l，吐温80 1.5g/l，k2hpo4·
7h2o 2.0g/l，无水乙酸钠5g/l，柠檬酸三铵2.0g/l，mgso4·
7h2o 0.2g/l，mnso4·
h2o 0.038g/l和1000～4000iu维生素d3。4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1～3任一项所述鼠李糖乳杆菌s24活菌株、鼠李糖乳杆菌s24的灭活菌株及菌株代谢产物、鼠李糖乳杆菌s24后生元、植物乳杆菌活菌株和发酵乳杆菌活菌株中的一种或多种组成的混合物。5.如权利要求1或2所述的鼠李糖乳杆菌s24和/或如权利要求4所述的组合物在制备防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症的功能性食品或药物中的应用。6.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌s24或含其的组合物通过缓解体重下降、提高os大鼠的全身骨密度和腰椎骨密度、提高os大鼠的前肢抓力、全身骨骼肌量和四肢骨骼肌量中的一种或多种途径防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症。7.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌s24或含其的组合物通过上调pi3k蛋白表达水平和/或提高肠道乳杆菌、双歧杆菌的丰度对肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症进行防治。8.如权利要求5所述应用，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌s24的用量≥6
×
108cfu/per mouse/day；所述鼠李糖乳杆菌s24的灭活菌株的用量为3～8
×
10
10
cfu/day，鼠李糖乳杆菌s24后生元的用量为鼠李糖乳杆菌s24菌体数≥6
×
108个/per mouse/day，游离氨基酸＞1mg/g。9.如权利要求1～3任一项所述鼠李糖乳杆菌s24及其后生元在制备抑制致病菌的功能性食品或药物中的应用。10.如权利要求1～3任一项所述的鼠李糖乳杆菌s24和/或如权利要求4或5所述的组合物作为发酵剂在制备发酵食品、保健食品或膳食补充剂中的应用。

技术总结

一种鼠李糖乳杆菌及其组合物与应用，其中，鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)S24，于2021年8月6日保藏于中国武汉中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2021986。本发明的组合物包括鼠李糖乳杆菌S24活菌株、及鼠李糖乳杆菌S24的灭活菌株、菌株代谢产物和鼠李糖乳杆菌S24后生元中的一种或多种的混合物。本发明还公开了鼠李糖乳杆菌S24及其后生元在制备防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症的功能性食品或药物中的应用。本发明鼠李糖乳杆菌S24具有良好的安全性，鼠李糖乳杆菌S24的应用广泛，可用于制备防治肌肉减少症或骨质疏松症或肌骨共减综合症的功能性食品或药物，或抑制致病菌的功能性食品或药物，或作为发酵剂用于制备发酵食品、保健食品。健食品。健食品。