丙酸作为预测不孕症女性辅助生殖妊娠结局标志物的用途的制作方法

1.本发明属于辅助生殖技术领域，具体涉及丙酸作为预测不孕症女性辅助生殖妊娠结局标志物的用途。

背景技术：

2.不孕症影响了全世界8-12％的育龄夫妇。辅助生殖技术(art)已被用于不孕症，尽管art取得了令人瞩目的进步，但临床妊娠结果仍然相对不令人满意，尤其是对于新鲜胚胎移植。art单次移植的临床妊娠率仅为40％-50％，而提高接受art患者的妊娠率已成为一项重大的临床挑战。
3.肠道菌是肠道中的一组复杂微生物，在调节宿主全身代谢功能，包括雌性生殖功能中发挥着重要作用。肠道菌通过产生的代谢产物物影响宿主生理，主要产物之一是短链脂肪酸(scfas)，主要包括丁酸盐、丙酸盐和乙酸盐。研究发现母体scfa水平升高可能对母体体重增加、葡萄糖代谢和各种代谢激素水平产生影响。此外，动物实验证明scfas在胚胎植入和发育中发挥着重要作用。例如研究发现scfas丁酸钠能够通过增强大鼠的孕酮合成进而显着改善活产仔数和胚胎着床率和存活率；丙酸盐通过受体gpr41和gpr43影响小鼠胚胎发育；scfas与胎盘功能和子宫肌层收缩力密切相关。然而鲜有研究将scfas与妊娠结局相关联。
4.子宫通过宫颈和阴道与外界相通。有研究发现生殖道的微生物组成会影响子宫微环境，进而影响辅助生殖技术成功率。中国专利申请cn112384633a描述了一种基于阴道内阴道加德纳菌、乳酸杆菌等的相对丰度来预测辅助生殖技术不会导致怀孕的方法。中国专利202210918884.3描述了一种基于宫颈内卷曲乳酸杆菌、惰性乳酸杆菌的相对丰度来预测辅助生殖技术成功妊娠的方法。这些预测方法初步探索了生殖道系统微生物组对于预测辅助生殖技术成功率的可能性。尽管如此，随着微生物组检测技术和医学认知的不断进步与完善，临床实践的不断累积，微生物对于辅助生殖技术结局预测的方法也在不断标准化和精准化，预测的敏感性和特异性也逐渐提高，以便切实满足临床医疗需求。
5.肠道菌对女性生殖功能起着不可忽视重要作用，但目前的研究多集中在动物模型研究或单个疾病与对照的研究，并没有研究肠道菌和代谢物对辅助生殖妊娠结局影响的研究。发明人在开展一项旨在评估scfas与不孕症女性辅助生殖临床妊娠结局关系的病例对照研究时，发现丙酸水平较高对临床妊娠结局有负面影响，且与葡萄糖代谢指标甘油三酯和胰岛素抵抗指数呈正相关。利用肠道菌代谢产物短链脂肪酸丙酸对辅助生殖临床妊娠结局进行预测，发现预测结果很准确，因此本发明创新性的提出丙酸可以作为预测标志物来对辅助生殖妊娠结局进行预测，实现了安全、无创且精准的预测方法。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供了一种预测不孕症女性辅助生殖妊娠结局的标志物。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：
7.本发明一方面涉及丙酸作为预测不孕症女性辅助生殖妊娠结局标志物的用途。本发明首次观察到粪便丙酸水平与临床妊娠结局相关，roc曲线显示丙酸对临床妊娠结局的预测效果高于空腹血糖水平、甘油三酯、胰岛素抵抗指数。
8.在本发明的一个优选实施方式中，所述标志物还包括空腹血糖水平、甘油三酯、胰岛素抵抗指数中的至少1种、2种或者3种。本发明发现粪便丙酸与其他因素联合使用的预测效果得到提升。
9.在本发明的一个优选实施方式中，所述丙酸是指粪便中的丙酸。
10.在本发明的一个优选实施方式中，所述辅助生殖是指胚胎植入。
11.在本发明的另一方面，还涉及一种预测接受辅助生殖技术的不孕症患者妊娠结局的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
12.(1)采集不孕症患者的粪便样本；
13.(2)确定粪便短链脂肪酸丙酸含量。
14.在本发明的一个优选实施方式中，通过气相谱-质谱分析确定粪便短链脂肪酸丙酸的含量。
15.在本发明的一个优选实施方式中，根据粪便中短链脂肪酸丙酸含量预测临床妊娠结局，其中，当粪丙酸含量大于12.620μmol/g湿粪时，如果患者此次采用辅助生殖技术胚胎植入，预测临床妊娠结局会失败；当粪丙酸小于或等于12.620(μmol/g湿粪)时，如果患者此次采用辅助生殖技术胚胎植入，预测临床妊娠结局会成功。
16.在本发明的一个优选实施方式中，所述方法还包括基于预测妊娠结果进行建议，建议预测为成功结局的患者可进行辅助生殖技术植入胚胎，对预测结果为失败的患者，则不建议进行辅助生殖技术植入胚胎。
17.在本发明的一个优选实施方式中，对预测结果为失败的患者，建议通过药物或者饮食结构调理空腹血糖水平、甘油三酯、胰岛素抵抗指数中的至少1种、2种或者3种。
18.有益的技术效果
19.出人意料的是，本技术首次观察到粪便丙酸水平与辅助生殖临床妊娠结局相关，roc曲线显示丙酸对临床妊娠结局的预测效果高于空腹血糖水平、甘油三酯、胰岛素抵抗指数，且与其他因素联合使用的预测效果得到提升。这一结果强调了在日常实践中测量粪便丙酸水平的潜在临床作用。这些结果证明了肠道代谢产物短链脂肪酸丙酸可以被认为是临床妊娠结局的潜在预测因子，为进一步了解丙酸在糖脂代谢和女性生殖系统中的生物学作用开辟了新的视野。
附图说明
20.图1：非临床妊娠与临床妊娠两组粪便短链脂肪酸水平。
21.图2：湿粪便丙酸与甘油三酯、空腹血糖水平、胰岛素抵抗指数的关系。
22.图3：临床妊娠结局相关因素的单因素和多因素logistic回归分析。
23.图4：湿粪便丙酸与、甘油三酯、空腹血糖水平、胰岛素抵抗指数对非临床妊娠患者妊娠结局预测的roc曲线。
具体实施方式
24.实施例1：
25.一、研究设计和研究人
26.本研究采用单中心、回顾性、病例对照研究，样本为2021年5月至2021年8月在中国医科大学盛京医院生殖医学中心接受体外受精/卵泡浆内单精子注射(ivf/icsi)辅助生殖技术的不孕妇女279名，经过排除标准筛选最终45名纳入研究(32名未成功临床妊娠和13名成功临床妊娠)，研究肠道代谢产物短链脂肪酸与临床妊娠结局之间的关系，并探讨其潜在机制。
27.a)纳入标准：
28.1.年龄在20-40岁；
29.2.接受2枚新鲜胚胎进行体外植入；
30.b)排除标准：
31.1.有可能影响肠道微生物的肠道疾病；
32.2.在收集粪便样本前一个月内服用过抗生素和(或)益生菌/益生元补充剂；
33.3.因解剖因素或盆腔疾病而不能生育的妇女；
34.4.不稳定和不平衡的饮食习惯和结构；
35.5.资料不全者；
36.c)样本信息
37.1.该研究于符合赫尔辛基宣言并经中国医科大学盛京医院伦理委员会批准(参考号2017ps190k)。所有参与者都获得了书面知情同意书。
38.2.患者一般资料、临床参数主要来自中国医科大学盛京医院电子病历信息库。
39.二、样本采集和测量
40.2.1样本采集
41.在胚胎植入前自发月经期的第3到5天内，夜间禁食后于早上收集外周静脉血。
42.粪便在夜间进食至少8小时后收集，与血液样本应在3天内间隔收集。
43.2.2短链脂肪酸测量
44.用halo-f100粪便处理装置(中国苏州海陆生物科技有限公司)处理一定量的粪便(0.800
±
0.010g)，制备10％的粪便混悬液。提取约2ml样品到新型灭菌离心管中，在10000r/min,4℃，离心5分钟(美国马萨诸塞州赛默飞世尔科学有限公司)。取上清入离心管，充分混合。取500μl提取液倒入1.5ml离心管中，加入100μl短链脂肪酸预处理液(试剂成分包括：0.9％氯化钠；0.01％硫酸钠；0.01％磷酸盐缓冲液；0.01％苯甲酸钠)，-30℃保存24h。解冻后4℃，10000rpm离心3min，提取过滤上清。将100μl样品提取液提取到气相样品瓶管内，去除气泡，在气相谱平台进行样品分析(中国福立9720)。
45.气相谱-质谱分析条件设置为:谱柱(agilentffap30m
×
0.25mm
×
0.25μm)；柱温(20℃/min～180℃for1min
→
50℃/min～220℃for1min)；注入口(高纯氮气，250℃，1.0μl，分流比5:1，流量设置为2.5ml/min,6.5min
→
2.8ml/min,2min)；检测器(fid，温度:250℃，氢气:30ml/min，氧气:300ml/min)。测量指标包括乙酸，丙酸和丁酸，见表1。
46.表1，纳入研究样本的临床妊娠结局和肠道代谢产物短链脂肪酸水平
[0047][0048]
2.3血液指标测量
[0049]
使用uniceldxi800自动免疫分析系统(beckmancoulter,usa)，按照说明书，采用化学发光免疫法测定雌二醇、孕酮、催乳素、总睾酮、促卵泡激素、促黄体生成素、抗苗勒氏激素。在architectci16200全自动生化分析仪(abbottlaboratories,usa)上使用酶联免疫
吸附法(elisa)测定以下临床参数:性激素结合球蛋白、空腹血清胰岛素、空腹血糖水平、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、总胆汁酸。
[0050]
2.4妊娠结局的确定
[0051]
胚胎移植后35天，通过阴道超声观察受试者，检测到心脏活动的宫内胚胎/胎儿，定义为临床妊娠。
[0052]
三、成功临床妊娠和未成功临床妊娠人的差异分析
[0053]
3.1基本信息
[0054]
对成功临床妊娠和未成功临床妊娠的样本分成两个组进行研究，比较了两个组里的样本基本信息包括年龄、身高、体重、不孕、史既往胚胎移植情况等，发现两组间无差异，见表2。
[0055]
表2.非临床妊娠组和临床妊娠组的基线特征。
[0056][0057]
3.2短链脂肪酸和血液指标
[0058]
3.2.1粪短链脂肪酸
[0059]
分析临床妊娠和未临床妊娠的两组样本的粪短链脂肪酸指标，发现未临床妊娠组的丙酸水平显著高于临床妊娠组(p＝0.001)，见图1.b，而乙酸(p＝0.211)和丁酸(p＝0.531)两组间无差异(图1.a,c)。
[0060]
3.2.2血液指标
[0061]
分析临床妊娠和未临床妊娠的两组样本的血液指标，发现与成功临床妊娠患者相比，未成功临床妊娠患者的空腹血糖(空腹血糖水平，p＝0.010)、胰岛素抵抗指数(胰岛素抵抗指数，p＝0.028)、甘油三酯(甘油三酯，p＝0.006)显著升高。具体见表3.表3.临床妊娠和未临床妊娠两组血液临床指标
[0062][0063]
3.2.3粪短链脂肪酸和血液指标关系
[0064]
在上述分析中发现，成功临床妊娠和未成功临床妊娠两组间存在差异显著的血液指标(空腹血糖水平、胰岛素抵抗指数和甘油三酯)和短链脂肪酸(丙酸)。进一步分析粪丙酸与空腹血糖水平、胰岛素抵抗指数、甘油三酯的关系，通过线性相关分析，发现粪丙酸与甘油三酯(r＝0.451,p＝0.002)、胰岛素抵抗指数(r＝0.369,p＝0.013)呈正相关关系(图2.a,c)。
[0065]
四、成功临床妊娠和未成功临床妊娠结局的预测
[0066]
4.1粪丙酸是非临床妊娠的危险因素
[0067]
通过logistic回归分析评估丙酸水平与受试者非临床妊娠发生率之间的关系。关于临床妊娠结局，单因素分析发现粪便丙酸(or,1.275；95％置信区间,1.081-1.505；p＝0.004)，甘油三酯(or，6.155；95％置信区间,1.243-30.472,p＝0.026)和空腹血糖(or,7.137；95％置信区间,1.128-45.140；p＝0.037)为影响临床妊娠结局的因素。而多变量分析表明，只有粪便丙酸(or,1.246；95％置信区间,1.025-1.515；p＝0.027)为非临床妊娠的独立因素，见图3。
[0068]
4.2粪丙酸对临床妊娠结局有预测作用
[0069]
基于上述发现粪丙酸是是非临床妊娠的危险因素，用粪丙酸来预测临床妊娠结局。通过roc曲线评估粪丙酸对非临床妊娠的预测能力。如表4和图4所示，粪丙酸(》12.620μmol/g湿粪)对非临床妊娠结局风险具有预测能力，敏感性为71.9％，特异性为84.6％(auc＝0.820；p＝0.001)。
[0070]
表4.丙酸对非临床妊娠结局的预测
[0071][0072]
注：roc，受试者工作特征曲线；auc，曲线下的面积；se,标准误差；ci,置信区间。
[0073]
丙酸对临床妊娠结局的预测效果明显高于空腹血糖水平、甘油三酯、胰岛素抵抗指数。进一步评估血液因素增加粪丙酸对临床妊娠结局的预测能力，粪便丙酸和甘油三酯联合预测的auc为0.829，临床妊娠结局预测的敏感性为81.3％，特异性为76.9％。粪便丙酸与空腹血糖水平联合预测的auc为0.892，敏感性为87.5％，特异性为84.6％。粪便丙酸与胰岛素抵抗指数联合检测的auc为0.839、敏感性值为75.0％和特异性值为92.3％。可见，仅单独使用粪丙酸即可以对临床妊娠结局有很好的预测结果，且其他血液指标如果增加粪丙酸，则对预测效果有更好的提升。
[0074]
4.3利用肠道菌代谢物对妊娠结局进行预测
[0075]
丙酸预测妊娠结局：当粪丙酸含量大于12.620μmol/g湿粪时，如果受试者此次采用辅助生殖技术胚胎植入，预测临床妊娠结局会失败。而当粪丙酸小于或等于12.620μmol/g湿粪时，如果受试者此次采用辅助生殖技术胚胎植入，预测临床妊娠结局会成功。
[0076]
4.4短链脂肪酸预测胚胎植入妊娠结局的机制探究
[0077]
通过上述实验结果可知，非临床妊娠组的粪便丙酸水平明显高于临床妊娠组，且粪丙酸与甘油三酯和胰岛素抵抗指数存在正相关关系，可以解释粪丙酸对临床辅助生殖技术胚胎植入妊娠作用的潜在机制。
[0078]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.丙酸作为预测不孕症女性辅助生殖妊娠结局标志物的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述标志物还包括空腹血糖水平、甘油三酯、胰岛素抵抗指数中的至少1种、2种或者3种。3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述丙酸是粪便中的丙酸。4.根据权利要求1-3任意一项所述的用途，其特征在于，所述辅助生殖是胚胎植入。5.一种预测接受辅助生殖技术的受试者妊娠结局的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)采集受试者的粪便样本；(2)确定粪便短链脂肪酸丙酸含量。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述确定粪便短链脂肪酸丙酸含量是通过气相谱-质谱分析确定丙酸的含量。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，根据粪便中短链脂肪酸丙酸含量预测临床妊娠结局，其中，当粪丙酸含量大于12.620μmol/g湿粪时，如果受试者采用辅助生殖技术胚胎植入，预测临床妊娠结局会失败；当粪丙酸小于或等于12.620μmol/g湿粪时，如果受试者采用辅助生殖技术胚胎植入，预测临床妊娠结局会成功。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括基于预测妊娠结果进行建议，建议预测为成功结局的受试者可进行辅助生殖技术植入胚胎，对预测结果为失败的受试者，则不建议进行辅助生殖技术植入胚胎。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，对预测结果为失败的受试者，建议通过药物或者饮食结构调理空腹血糖水平、甘油三酯、胰岛素抵抗指数中的至少1种、2种或者3种。

技术总结

本发明公开了丙酸作为预测不孕症女性辅助生殖妊娠结局的标志物的用途。出人意料的是，本申请首次观察到粪便丙酸水平与临床妊娠结局相关，ROC曲线显示丙酸对临床妊娠结局的预测效果高于空腹血糖水平、甘油三酯、胰岛素抵抗指数，且与其他因素联合使用的预测效果得到提升。本发明公开了肠道代谢产物短链脂肪酸丙酸可以被认为是临床妊娠结局的潜在预测因子，为进一步了解丙酸在糖脂代谢和女性生殖系统中的生物学作用开辟了新的视野。统中的生物学作用开辟了新的视野。统中的生物学作用开辟了新的视野。