雷尔氏菌XZW-1及其在降解有机污染物中的应用

雷尔氏菌xzw-1及其在降解有机污染物中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及雷尔氏菌xzw-1及其在降解有机污染物中的应用。

背景技术：

2.挥发性有机物(volatile organic compounds，vocs)是pm2.5和臭氧的重要前体物，严重影响环境空气质量。随着so2、no
x
得到有效控制，近年来vocs减排已成为大气污染控制的重点与关键。氯苯类有机物(chlorobenzenes，cbs)广泛用于染料、塑料、香料、医药、有机合成等生产过程，是含氯vocs工业废气的重要组分。cbs化学性质稳定、具有三致效应，是一类生态环境风险极高的疏水性、持久性有机污染物，被美国epa列为优先控制污染物，严重威胁生态环境与人体健康。因此，开展cbs废气净化研究具有重要现实意义。
3.生物法净化vocs是利用微生物通过代谢活动将废气中vocs转化为简单的无机物(co2、h2o等)及细胞组成物质的过程，具有成本低、去除效率高、无二次污染等优点，已成为大气污染控制技术领域的研究热点之一。
4.目前，可降解氯苯的菌株已有很多发现。例如，张士汉等从污水处理厂的活性污泥中驯化、分离得到一株具有氯苯高效降解能力的苍白杆菌zjutcb-1(一株高效降解氯苯的苍白杆菌zjutcb-1及其应用，公开号：cn109370945a)，在好氧条件下对初始浓度347.31-2604.80μmol/l氯苯的去除效率达100％。因此，筛选分离并利用定向驯化方法获得可降解氯苯类vocs高效降解菌株，研究其生物学特性和降解特性，可为氯苯类vocs废气的生物处理提供技术支撑和理论依据。

技术实现要素：

5.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供雷尔氏菌xzw-1及其在降解有机污染物中的应用的技术方案。本发明的雷尔氏菌xzw-1能以氯苯为碳源和能源，实现氯苯的高效降解，对生物法净化氯苯的工程应用具有重要意义。
6.本发明具体通过以下技术方案实现：
7.本发明第一方面提供了一株雷尔氏菌(ralstonia sp.)xzw-1，该菌株已于2022年05月06日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 2022557，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学，微生物分类命名为雷尔式菌ralstonia sp.。
8.上述雷尔氏菌分离自浙江某污水处理厂的活性污泥，为好氧的革兰氏阴性菌，菌落呈小点状、乳白、不透明、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长。经16s rdna测序后，判断其为雷尔氏菌属，命名为ralstoniasp.xzw-1。
9.本发明的雷尔氏菌xzw-1能以氯苯作为碳源和能源进行生长繁殖，高效降解氯苯，且能适应的温度和ph范围较广。此外，雷尔氏菌xzw-1还能以1,2-二氯苯和甲苯作为碳源和能源进行生长繁殖，并高效降解1,2-二氯苯和甲苯。
10.本发明第二方面提供了该雷尔氏菌xzw-1在降解有机污染物中的应用。
11.进一步，所述有机污染物为氯苯、1,2-二氯苯、甲苯、1,2-二甲苯中的一种或多种。
12.本发明第三方面提供了利用该雷尔氏菌xzw-1降解有机污染物的方法，其包括以下步骤：
13.a、将所述雷尔氏菌xzw-1接种于固体斜面培养基，30～35℃培养24～48h，获得斜面菌体；
14.b、将所述斜面菌体接种至无机盐培养基中，25～30℃培养24～36h，获得od
600
＝0.1～0.2的菌液；
15.c、将所述菌液和有机污染物混合，制成混合液；
16.d、使所述混合液于20～40℃下进行降解反应。
17.进一步，所述步骤a中固体斜面培养基包含以下质量份的组分：酵母粉0.50～1.00g/l、可溶性淀粉0.50～1.00g/l、mgso40.50～1.00g/l、胰蛋白胨0.50～1.00g/l、葡萄糖0.50～1.00g/l、丙酮酸钠0.30～0.60g/l、k2hpo
4 0.45～0.90g/l、琼脂18～20g/l，溶剂为去离子水。
18.进一步，所述步骤b中无机盐培养基包含以下质量份的组分：na2hpo
4 4.0～5.0g/l、kh2po
4 0.8～1.2g/l，(nh4)2so
4 2.3～2.8g/l，mgso
4 0.18～0.23g/l、cacl
2 0.022～0.24g/l、微量元素母液0.8～1.2ml/l，溶剂为去离子水。
19.进一步，所述步骤b中无机盐培养基的ph为4.0～10.0。
20.进一步，所述步骤c中有机污染物为氯苯、1,2-二氯苯、甲苯、1,2-二甲苯中的一种或多种。
21.进一步，所述步骤c中有机污染物的浓度为20～200mg/l。
22.进一步，所述微量元素母液包括以下成分：feso
4 0.8～1.2g/l、cuso
4 0.015～0.025g/l、h3bo
3 0.013～0.015g/l、mnso
4 0.08～0.13g/l、znso
4 0.08～0.13g/l、na2moo
4 0.015～0.025g/l、cocl
2 0.015～0.025g/l，溶剂为去离子水。。
23.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
24.(1)本发明的雷尔氏菌xzw-1能以氯苯、1,2-二氯苯和/或甲苯为碳源和能源，实现氯苯和1,2-二氯苯的高效降解，12h对氯苯的降解率可达99％以上，对1,2-二氯苯的降解率可达95％以上，对甲苯降解率可以达到50％以上；
25.(2)本发明的雷尔氏菌xzw-1能适应的温度和ph范围较广，在20～40℃、ph 6.0～8.0下均能生长繁殖并在一定程度上降解氯苯。
附图说明
26.图1为雷尔氏菌xzw-1的透射电镜图；
27.图2为雷尔氏菌xzw-1的系统发育树；
28.图3为雷尔氏菌xzw-1的菌体生长、氯苯降解曲线图；
29.图4为不同ph值培养液下雷尔氏菌xzw-1的氯苯降解性能(图a)、生长情况(图b)、矿化(图c)的影响柱形图；
30.图5为不同温度对雷尔氏菌xzw-1的氯苯降解效率(图a)、矿化效率(图b)及生长情况(图c)的影响；
31.图6为雷尔氏菌xzw-1对不同初始浓度氯苯的降解性能；
32.图7为雷尔氏菌xzw-1在不同初始氯苯浓度下的生长曲线。
具体实施方式
33.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
34.以下实施例中所使用的各培养基的成分如下：
35.无机盐培养基：na2hpo4·
12h2o 4.5g/l、kh2po
4 1.0g/l、(nh4)2so
4 2.5g/l、mgso4·
7h2o 0.2g/l、无水cacl
2 0.023g/l，微量元素母液1ml/l，ph7.0，溶剂为去离子水；
36.所述微量元素母液的成分如下：feso4·
7h2o 1.0g/l、cuso4·
5h2o 0.02g/l、h3bo
3 0.014g/l、mnso4·
4h2o 0.10g/l、znso4·
7h2o 0.10g/l、na2moo4·
2h2o0.02g/l、cocl2·
6h2o 0.02g/l，溶剂为去离子水。
37.r2a固体斜面培养基：酵母粉0.50g/l、可溶性淀粉0.50g/l、mgso4·
7h2o0.50g/l、胰蛋白胨0.50g/l、葡萄糖0.50g/l、丙酮酸钠0.30g/l、k2hpo4·
3h2o0.45g/l，琼脂18g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。
38.实施例1：雷尔氏菌xzw-1的分离、纯化与鉴定
39.(1)雷尔氏菌xzw-1的分离及纯化
40.现场采集浙江某污水处理厂的活性污泥，取静置后的下层污泥与无机盐培养基按1:2(v/v)混合，将3l混合物接入5l污泥驯化罐，以氯苯为碳源和能源，室温下驯化培养近20天后，从驯化罐取5ml污泥加入装有50ml无机盐培养基的摇瓶中，发现驯化的污泥在摇瓶中每天可稳定降解20mg/l氯苯，降解率可达80-90％(摇瓶实验条件：30℃、160r/min)。
41.将摇瓶中的污泥样品分别取1、2ml转接入其他摇瓶进一步测试其降解性能，发现转接后的污泥在摇瓶中每天可稳定降解20mg/l氯苯，将此污泥样继续转接富集6代(每次转接1ml)，然后将富集6代后的污泥按10-1
～10-6
倍数进行平板涂布，挑取单菌落，再以氯苯为底物，进行氯苯降解性能测定，分离纯化，获得一株具有氯苯降解活性的菌株xzw-1。
42.(2)雷尔氏菌xzw-1的鉴定
43.菌株xzw-1的菌落呈小点状、乳白、不透明、形态饱满、光滑湿润，易挑起，菌苔沿划线生长。雷尔氏菌xzw-1的透射电镜图如图1所示。
44.菌株xzw-1的生理生化特征为：好氧，革兰氏染为阴性。
45.对菌株xzw-1进行16s rdna测序，测序工作由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。菌株xzw-1的16s rdna(seq id no.1)，genebank登录号为on377124。
46.通过将菌株xzw-1的16s rdna序列上传到ezbiocloud网站，与网站上的标准菌株进行比对，并用mega-x软件，采用neighbor-joining法构建细菌发育进化树，并用bootstrap法(重复1000次)进行评估，构建的系统发育树如图2，从而确定该菌株xzw-1为雷尔氏菌属，命名为雷尔氏菌(ralstonia sp.)xzw-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年5月6日，保藏编号cctcc no：m 2022557，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
47.实施例2：雷尔氏菌xzw-1的扩大培养
48.将雷尔氏菌xzw-1扩大培养后，获得含有雷尔氏菌xzw-1的菌液，具体过程如下：
49.1)斜面培养：将雷尔氏菌xzw-1接种于r2a固体斜面培养基，30℃培养48h，获得斜面菌体。
50.2)扩大培养：用接种环挑取步骤1)获得的斜面菌体接种至无机盐培养基中，30℃，培养24h，获得od
600
＝0.1的菌液。
51.实施例3：雷尔氏菌xzw-1降解氯苯的性能
52.取实施例2中制得的菌液，接种至新鲜的含50mg/l氯苯的50ml无机盐培养基(ph＝7)，使初始菌体浓度以od
600
计为0.01。设计2个平行样和一个不接菌株的空白对照组。放入温度为30℃、转速为160r/min的摇床中培养，每隔3～6h取样测定氯苯降解率，并用5ml注射器抽出一部分菌液，测定菌体od值，结果见图3。
53.从图3可以看出，随着时间的延长，菌体浓度逐渐增大，培养12h菌体浓度达到最大(约为od
600
＝0.06)，氯苯降解率达到99％以上。说明雷尔氏菌xzw-1可利用氯苯作为碳源和能源进行生长繁殖，并且具有稳定高效降解氯苯的能力。
54.实施例4：初始ph值对雷尔氏菌xzw-1降解氯苯的影响
55.用1mol/l naoh水溶液或1mol/l h2so4水溶液调节无机盐培养基为不同ph值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)；取实施例2中制得的菌液，接种至新鲜的含50mg/l氯苯的50ml无机盐培养基中，调节ph后，使初始菌体浓度以od
600
计为0.01。设计2个平行样和一个不接菌株的空白对照组。将样品于30℃、160r/min恒温摇床里振荡培养，培养12h后取样，测反应液中氯苯降解率、od
600
值和co2值，结果见图4。
56.从图4可以看出，在ph＝6.0～8.0范围内，雷尔氏菌xzw-1均能以氯苯为碳源和能源生长繁殖，并在一定程度上降解氯苯；在ph＝7.0～8.0范围内，雷尔氏菌xzw-1对氯苯均有较高的降解率(99％以上)。同时雷尔氏菌xzw-1的生长量和产生的co2值也呈现与氯苯降解率一致的趋势。
57.实施例5：温度对雷尔氏菌xzw-1降解氯苯的影响
58.取实施例2中制得的菌液，接种至新鲜的含50mg/l氯苯的50ml无机盐培养基(ph＝7)，使初始菌体浓度以od
600
计为0.01。将各个样品分别置于温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃摇床中恒温振荡培养(摇床转速均为160r/min)。各温度下分别设计2个平行样和一个不接菌株的空白对照组。培养12h后取样，测反应液中氯苯降解率、od
600
值和co2值，结果见图5。
59.从图5可以看出，在20～40℃温度范围内，雷尔氏菌xzw-1均能以氯苯为碳源和能源生长繁殖，并在一定程度上降解氯苯；在25～30℃温度范围内，雷尔氏菌xzw-1对氯苯均有较高的降解率(99％以上)，同时雷尔氏菌xzw-1的生长量和产生的co2值也有与氯苯降解率一致的趋势。
60.实施例6：底物浓度对雷尔氏菌xzw-1降解氯苯的影响
61.在新鲜的无机盐培养基中加入不同浓度的底物氯苯(初始浓度分别为20、50、100、150、200mg/l)，分别接种实施例2中制得的菌液，使初始菌体浓度以od
600
计为0.01。设计2个平行样和一个不接菌株的空白对照组。在30℃、转速为160r/min的摇床中培养，定时取样测定雷尔氏菌xzw-1的od
600
和氯苯浓度，结果分别见图6和图7。
62.从图6和图7可以看出，当氯苯浓度为20～200mg/l时，雷尔氏菌xzw-1能在24h内快速繁殖，并能在24h后将氯苯几乎完全降解；随着氯苯浓度的增加，完全降解时间也在一定程度上增加。
63.实施例7：雷尔氏菌xzw-1对不同碳源底物的降解能力
64.在新鲜的无机盐培养基中分别加入除氯苯外的其他底物(底物浓度见表1)，接种实施例2中制得的菌液，使初始菌体浓度以od
600
计为0.01。在30℃、转速为160r/min的摇床中进行恒温振荡培养，培养24h后检测od
600
和降解率，结果见表1。发现雷尔氏菌xzw-1对1,2-二氯苯和甲苯有不同程度的降解。
65.表1雷尔氏菌xzw-1对不同碳源底物的降解能力
[0066][0067]
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0068]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：

1.雷尔氏菌(ralstonia sp.)xzw-1，其保藏编号为cctcc no：m 2022557。2.如权利要求1所述的雷尔氏菌xzw-1在降解有机污染物中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述有机污染物为氯苯、1,2-二氯苯、甲苯、1,2-二甲苯中的一种或多种。4.利用权利要求1所述的雷尔氏菌xzw-1降解有机污染物的方法，其特征在于包括以下步骤：a、将所述雷尔氏菌xzw-1接种于固体斜面培养基，30～35℃培养24～48h，获得斜面菌体；b、将所述斜面菌体接种至无机盐培养基中，25～30℃培养24～36h，获得od
600
＝0.1～0.2的菌液；c、将所述菌液和有机污染物混合，制成混合液；d、使所述混合液于20～40℃下进行降解反应。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤a中固体斜面培养基包含以下质量份的组分：酵母粉0.50～1.00g/l、可溶性淀粉0.50～1.00g/l、mgso40.50～1.00g/l、胰蛋白胨0.50～1.00g/l、葡萄糖0.50～1.00g/l、丙酮酸钠0.30～0.60g/l、k2hpo
4 0.45～0.90g/l、琼脂18～20g/l，溶剂为去离子水。6.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤b中无机盐培养基包含以下质量份的组分：na2hpo
4 4.0～5.0g/l、kh2po
4 0.8～1.2g/l，(nh4)2so
4 2.3～2.8g/l，mgso
4 0.18～0.23g/l、cacl
2 0.022～0.24g/l、微量元素母液0.8～1.2ml/l，溶剂为去离子水。7.如权利要求4或6所述的方法，其特征在于所述步骤b中无机盐培养基的ph为4.0～10.0。8.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述步骤c中有机污染物为氯苯、1,2-二氯苯、甲苯、1,2-二甲苯中的一种或多种。9.如权利要求4或8所述的方法，其特征在于所述步骤c中有机污染物的浓度为20～200mg/l。10.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述微量元素母液包括以下成分：feso40.8～1.2g/l、cuso40.015～0.025g/l、h3bo30.013～0.015g/l、mnso40.08～0.13g/l、znso40.08～0.13g/l、na2moo40.015～0.025g/l、cocl20.015～0.025g/l，溶剂为去离子水。

技术总结

雷尔氏菌XZW-1及其在降解有机污染物中的应用，属于微生物技术领域。本发明一方面提供了雷尔氏菌XZW-1，其保藏编号为CCTCC No：M 2022557，本发明另一方面提供了雷尔氏菌XZW-1的应用及应用方法。本发明的雷尔氏菌XZW-1能以氯苯为碳源和能源进行生长繁殖，并高效降解氯苯，且能适应的温度和pH范围较广。此外，雷尔氏菌XZW-1还能以1,2-二氯苯、甲苯和1,2-二甲苯为碳源和能源，并高效降解1,2-二氯苯、甲苯和1,2-二甲苯。二甲苯。二甲苯。