DNA/琼脂糖凝胶的制备方法及其脱除重金属的应用

dna/琼脂糖凝胶的制备方法及其脱除重金属的应用
技术领域
1.本发明属于重金属脱除技术领域，具体涉及dna/琼脂糖凝胶的制备方法及其脱除重金属的应用。

背景技术：

2.各种重金属离子对于环境的破坏和污染己经成为一个全球性的问题，严重威胁到了公众的健康，水源作为能够进入人体的直接途径，饮用水安全十分重要，越来越多的科学家致力于开发脱除废水中重金属离子的技术。化学沉淀、离子交换等方法由于化学试剂的使用，会不可避免的造成二次污染。而膜分离、电化学处理法则存在着成本高的问题，且上述方法吸附容量较少，去除效率较低，均无法达到理想的重金属脱除效果。
3.吸附法相对于上述方法具有成本低、设计简单、可操作性强的优点，现已存在许多低成本吸附剂，且可通过解吸过程再生达到重复使用的目的，如活性炭、碳纳米管等。然而，这些吸附剂均存在特异性不足的问题。为了解决这个难题，科学家们使用能够特异性结合靶标的dna作为新型吸附剂。核酸适配体是一种用于分子识别的新型单链dna/rna分子，能以很高的亲和力和特异性结合目标分子，再加上其序列可设计性，可用于脱除水中的不同种类的污染物，广泛应用于诊断、分析和医学领域(dunn m r,jimenez r m,chaput j c j.analysis of aptamer discovery and technology[j].nature reviews chemistry,2017,1(10):1-16)。kim等人使用结合砷特异性dna适配体的链霉亲和素琼脂糖树脂从地下水中去除砷(kim m,um h j,bang s,et al.arsenic removal from vietnamese groundwater using the arsenicbinding dna aptamer[j].environmental science&technology,2009,43(24):9335-9340.)；还有将适配体通过π-π相互作用固定在纳米材料氧化石墨烯膜上高度选择性地去除激素(chergui s,rhili k,poorahong s,et al.graphene oxide membrane immobilized aptamer as ahighly selective hormone removal[j].membranes,2020,10(9):229.)；hu等人使用cnbr(溴化氰)活化的琼脂糖固定5
’‑
氨基修饰的dna适配体去除饮用水中的痕量(ng/l)药物(hu x,mu l,zhou q,et al.ssdna aptamer-based column for simultaneous removal of nanogramper liter level of illicit and analgesic pharmaceuticals in drinking water[j].environmental science technology,2011,45(11):4890.)。上述方法的优势是兼顾高吸附效率和良好的特异性，还能在水中吸附痕量的分子。但仍旧需要制备复杂的纳米材料或对材料及适配体进行修饰，这增加了实际应用的成本及制备难度。鉴于目前重金属脱除技术的诸多不足之处，研发一种无需任何修饰的低成本、高效率、特异性强且无二次污染的重金属脱除方法具有十分重要的意义。

技术实现要素：

[0004]
以dna作为吸附剂用于脱除水中的污染物时，需要对dna或基底进行修饰从而将dna负载到基体上，该方法操作复杂，成本较高。针对该问题，本发明提供一种dna/琼脂糖凝
胶的制备方法及其脱除重金属的应用，本发明以琼脂糖作为基底，加热融化，待其冷却凝固会形成三维网状结构，而利用长链dna在琼脂糖中迁移率很小甚至无法通过高浓度琼脂糖空隙这一特性，若在琼脂糖凝固前(约60℃时)加入带有靶标特异性结合能力的核酸适配体或dnazyme聚集体，即可将该聚集体固定在琼脂糖中用于污染物的脱除。此功能核酸聚集体可由rca扩增生成，利用rca产物为分子量较大的串联重复序列这一特性，可以指数性的生成靶标识别位点，增大对靶标的亲和能力，实现对污染物的高效吸附。该方法操作简单且不需要对琼脂糖或dna进行额外的修饰即可达到固定的目的，真正实现对重金属污染物的低成本高特异性脱除，对于核酸适配体和dnazyme应用于分离水中污染物有着重要的意义。由于dna稳定性强，且有序列可设计性，可实现各种环境和温度下对不同污染物特异的脱除作用，有很大的应用潜力。
[0005]
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
[0006]
一方面，本发明提供一种dna/琼脂糖凝胶的制备方法，将琼脂糖在水中加热至融化，在冷却凝固前，加入功能性核酸长链，所述功能性核酸长链上含有重复的功能性序列，琼脂糖凝固后形成三维网状结构，功能性核酸长链在琼脂糖中迁移率很小甚至无法通过高浓度琼脂糖空隙，从而被固定于琼脂糖的三维网络中。
[0007]
进一步的，在琼脂糖冷却凝固前，加入功能性核酸长链并搅拌，使之分散在琼脂糖中。
[0008]
进一步的，在琼脂糖冷却凝固前(58～62℃)，加入功能性核酸长链。
[0009]
在上述方案中，以琼脂糖为基底，以功能性核酸长链为吸附材料。琼脂糖在结构上是一种线性聚合物，加热后融化冷却凝固形成三维网状结构。
[0010]
所述功能核酸主要有两类，一类是被称为“化学抗体”的可折叠成独特三维构象的rna或dna适配体(通常为20～80个核苷酸)，这类核酸适配体可通过范德华力、氢键、静电相互作用等与靶标发生高特异性和高亲和力的结合。一类是具有催化功能的dna分子，被称为dnazyme，其活性可由特异的靶标激活，这种对金属离子的选择性结合能力，为其应用在重金属脱除方面提供了可能。在本发明中，进一步的，所述功能性核酸长链为带有靶标特异性结合能力的核酸适配体或具有催化功能的dna分子。
[0011]
进一步的，所述功能性核酸长链为单链或杂交链。在本发明的一些实施例中，dsdna的脱除率大于ssdna，推测原因是杂交形成双链后，结构更稳定，但不论哪种形式都高于89％，最高达到了99.85％，因此可以说，无论功能核酸聚集体杂交与否，均可达到高吸附率的目的。
[0012]
功能性核酸长链的制备方法包括但不仅限于滚环扩增(rca)。优选通过滚环扩增可指数性的生成靶标识别位点，增大对靶标的亲和能力，实现高效吸附。所述杂交链的制备方法是：采用滚环扩增技术制备两条长链dna，一条是含有重复的功能性序列的单链dna，所述功能性序列的两侧为互补区域，另一条是所述单链dna的互补链，所述互补链与所述功能性序列的两侧的互补区域配对，所述互补链上与所述功能性序列相对的位置为预留区域；将两条长链dna杂交，杂交后的双链dna具有稳定的二级结构，并且功能性序列在预留区域位置形成突起。当相互杂交的两条链均为rca产物长链时，可有效避免副产物的产生。预留区域的长度为1～5nt，在本发明的一些实施例中为3nt。
[0013]
进一步的，所述功能性序列两侧的互补区域为20bp，以保证两条长链dna能够稳定
结合。
[0014]
进一步的，在滚环扩增中，引物：模板的摩尔浓度为1:1。
[0015]
进一步的，两条长链dna杂交是在mg
2+
存在的条件下进行。
[0016]
另一方面，本发明提供上述方法制备的dna/琼脂糖凝胶在重金属脱除方面的应用。
[0017]
进一步的，将所述的dna/琼脂糖凝胶切碎以增大接触面积，随后浸入被重金属污染的溶液中，在室温下使用以20～120rpm混匀，从溶液中除去凝胶碎。
[0018]
进一步的，在被重金属污染的溶液加入少量的na
+
或mg
2+
，可以增加脱除效果。优选其中na
+
为0.01～300mm、mg
2+
为0.5～3mm；更优选na
+
为0.01～200mm，mg
2+
为0.5～2mm。在本发明的实施例证明，na
+
为200mm或mg
2+
为2mm时混合琼脂糖的脱除效果最佳。
[0019]
进一步的，调整被重金属污染的溶液的ph值至5～11，以提高所述dna/琼脂糖凝胶的脱除性能。在本发明的一些实施例中，ph在5～11的范围内脱除率均能达到99％。更优选ph5～7。
[0020]
本发明研究证明，体系中含有少量的盐离子可增加脱除效果，且dna/琼脂糖凝胶在较宽的ph范围内均有良好的脱除性能。
[0021]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0022]
(1)本发明利用长链dna在琼脂糖中迁移率很小甚至无法通过高浓度琼脂糖空隙这一原理，只需琼脂糖凝固前加入带有靶标特异性结合能力的核酸适配体或dnazyme聚集体，即可实现功能核酸聚集体在琼脂糖中的固定，无需对dna或琼脂糖进行额外的修饰，成本较低。
[0023]
(2)本方法可将凝固的dna/琼脂糖凝胶切碎以增大接触面积，只需浸入到目标溶液内孵育，即可通过功能核酸-靶标相互作用，实现对水中的重金属离子特异的高效吸附，除去凝胶碎后，即可实现污染物的脱除，操作简单。
[0024]
(3)本方法中使用的功能核酸可为对靶标具有亲和能力的核酸适体以及dnazyme，这些化学性质稳定的核酸类元件能够特异地识别并结合某一靶标，选择性地脱除污染物，且dna有序列可设计性，通过序列设计，可实现各种环境和温度下对不同污染物特异的脱除作用，有很大的应用潜力。
[0025]
(4)本方法中使用的功能核酸聚集体可由rca扩增生成，利用rca产物为串联重复序列这一特性，可以指数性的生成靶标识别位点，增大对靶标的亲和能力，使得重金属脱除效率显著提高。
[0026]
(5)本发明主要涉及琼脂糖、对靶标具有高亲和力的功能核酸、缓冲液及少量的盐离子，除此之外，不涉及任何化学试剂及纳米材料；不会造成二次污染，且无需精密的仪器，具有较高的实际应用价值。
附图说明
[0027]
图1为本发明所提供的将dna固定在琼脂糖中的原理示意图；
[0028]
图2为功能核酸聚集体的制备、杂交及功能核酸单体示意图；
[0029]
图3为rca产物/琼脂糖凝胶脱除水溶液中重金属的设计思路图；
[0030]
图4为实施例1的适配体和dnazyme单体的序列设计图；
[0031]
图5为实施例1为a-m/a-g和b杂交及限制性内切酶酶切结果图；
[0032]
图6为实施例1rca产物/琼脂糖混合凝胶的制备及电泳结果图；
[0033]
图7为实施例1单链及杂交状态下rca产物/琼脂糖凝胶脱除水溶液中的pb
2+
效果图；
[0034]
图8为实施例1rca产物/琼脂糖混合凝胶在不同浓度na
+
吸附pb
2+
结果图；
[0035]
图9为实施例1rca产物/琼脂糖混合凝胶在不同浓度mg
2+
吸附pb
2+
结果图
[0036]
图10为实施例1rca产物/琼脂糖混合凝胶在不同ph下吸附pb
2+
结果图；
[0037]
图11为实施例2的适配体和dnazyme单体的序列设计图；
[0038]
图12为实施例2单链及杂交状态下rca产物/琼脂糖凝胶脱除水溶液中的cd
2+
效果图；
[0039]
图13为本发明实施例3的dnazyme单体的序列设计图；
[0040]
图14为本发明实施例3单链及杂交状态下rca产物/琼脂糖凝胶脱除水溶液中的cr
3+
效果图。
具体实施方式
[0041]
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
[0042]
以下实施例所采用的寡核苷酸序列均由生工(青岛)合成。琼脂糖购买于biowest公司(法国)。所采用的连接酶、核酸外切酶、聚合酶、限制性内切酶等试剂均为市售材料。
[0043]
以下实施例功能核酸聚集体的制备均采用滚环扩增方法，图2-a)为滚环扩增的模板及辅助成环链(splint)示意图，图2-b)为滚环扩增过程示意图。
[0044]
以下实施例适配体及dnazyme单体的序列设计如图2-c)所示，将适配体或dnazyme单体的两段序列命名为a和b，其中a、b左右各有一定长度的互补区域(a和b分别与a’和b’互补)，保证了两条长链能够稳定结合；序列a中间突起区域为具有吸附pb
2+
能力的功能性核酸序列，b的序列中除了与a互补配对的区域外，在中间还有3nt的预留区域，目的是给a突出的部分留以空间，使得其能够更好地结合靶标。滚环扩增后相邻的互补区域的长度增加一倍，如图2-d)所示。
[0045]
实施例1dna/琼脂糖凝胶对重金属铅离子的脱除
[0046]
1.dna/琼脂糖凝胶的制备
[0047]
(1)适配体及dnazyme单体的序列设计
[0048]
将带有适配体m4-16的序列命名为a-m(图4-a)，将带有gr 5 dnazyme的序列命名为a-g(图4-b)。a-m和a-g的互补链b只有一种，因此只要制备3种rca长链即可。b的序列中除了与a互补配对的20nt外，在中间还有3nt是为了给a突出的部分以空间，使得其能够更好地结合pb
2+
。为了后期验证两条rca长链成功杂交，在a/b的互补区域还设计有限制性内切酶hpych4v的酶切位点(图4下划线序列)。
[0049]
(2)功能核酸聚集体的制备：
[0050]
模板环前体链的磷酸化。在1
×
pnk buffer a缓冲体系中，将所设计的适配体或dnazyme单体的互补序列ssdna a
’‑
m、a
’‑
g、b’以适当的浓度(50μm)加到体系中，添加6倍于ssdna浓度的atp、10u pnk(10u/μl)，然后于37℃孵育8h完成ssdna的5’端的磷酸化。
[0051]
随后使用splint法环化制备模板环。制备时需借助成环辅助链a
’‑
sp(7+7)或b
’‑
sp(7+7)。在1
×
t4 dna buffer缓冲体系中，加入5’端磷酸化修饰的成环链(p-ssdna)5μm，辅助成环链15μm，于pcr仪中经90℃反应3min，然后以0.1℃/s降温至25℃，保持15min，再加入10u t4 dna ligase，于25℃下孵育3h。
[0052]
为了得到适配体及dnazyme单体的聚合物，采用滚环扩增技术，分别以a
’‑
sp(7+7)或b
’‑
sp(7+7)为引物，使用phi29 dna聚合酶对之前制备好的模板环ca
’‑
m、ca
’‑
g、cb’进行滚环扩增，使用引物摩尔浓度：模板摩尔浓度＝1:1，终浓度均为1μm，在1
×
phi29 buffer内加入1mm dntps，以及6u phi29 dna聚合酶进行扩增，于30℃保温1h，扩增产物称为a或b。
[0053]
在10mm mg
2+
条件下，取扩增后得到的rca产物a和b，于90℃保温3min，再以0.1℃/s的速率降温至25℃，并保温20min，以达到充分的杂交。使用设计的限制性内切酶hpych4v进行酶切验证，取5μl上述杂交产物，于1
×
cutsmart buffer缓冲液体系中和2.5u hpych4v(酶切位点为tg
↓
ca)在37℃反应3h，通过8％的page查看酶切情况。
[0054]
如图5所示，由lane 3和4、lane 7和8进行对比，a-m和b的杂交产物经hpych4v酶切后产生长短不一的条带，说明a-m和b在10mm mg
2+
存在下能够杂交上，其中a-g和b的杂交产物酶切后胶孔处无底物剩余，下方只有较少的条带，说明底物被hpych4v完全酶切，a-g和b已完全杂交。
[0055]
(3)rca产物/琼脂糖凝胶的制备
[0056]
之前得到的杂交产物可用作制备rca产物/琼脂糖凝胶，将0.2g琼脂糖和20ml 0.5
×
tbe高火加热，降温至60℃后加入不同量的rca杂交产物(50pmol、100pmol)与10μl gelred染液(1000
×
)，待琼脂糖冷却凝固。为了验证固定的效果，在200v电泳1h，然后在凝胶成像仪上成像，查看固定情况。
[0057]
结果如图6所示，随着琼脂糖中dna浓度的增加，琼脂糖的颜变深，说明rca产物/琼脂糖混合凝胶制备成功。且电泳1h后凝胶染无变化，表示经电泳rca产物没有从1％琼脂糖中溶出，rca产物成功固定在1％的琼脂糖中，可用于后续实验。
[0058]
2.使用dna/琼脂糖凝胶脱除水溶液中的pb
2+
[0059]
将含10pmol rca杂交产物的混合凝胶碎浸入8ml含0.5μm pb
2+
(十倍于国标)的tris-hcl(ph 8)缓冲液中，在室温下使用混匀仪以70rpm混匀12h。从溶液中除去凝胶碎，取出上清液，使用双发卡环状dnazyme介导的双循环法分析上清液中pb
2+
的浓度。脱除率(removal percent)的计算公式如下：
[0060]
其中co为初始浓度，ce为脱除后的浓度。
[0061]
图7中的结果显示，当使用单链rca产物和杂交后rca产物制备的琼脂糖凝胶吸附pb
2+
时，相较于仅使用琼脂糖凝胶的对照组，吸附率可以提升将近40％～50％，达到99％，实现对水溶液中的高效吸附，说明本方法中的核酸类元件起到了对pb
2+
的特异性吸附作用。
[0062]
3.盐离子对脱除效果的影响
[0063]
(1)na
+
浓度对脱除的影响
[0064]
设置了6个实验组，分别在含0、10mm、50mm、100mm、200mm和500mm的na
+
条件下进行吸附试验，利用荧光放大方法测定上清液中pb
2+
含量，通过荧光放大40min后的放大倍数(f-fb)/(f
0-fb)判断吸附效果(放大倍数越小说明吸附效果越好)，如图8。由图8可知，水溶液中na
+
的含量为200mm时，上清液中的pb
2+
剩余量最少，这说明na
+
为200mm时rca产物/琼脂糖混
合凝胶的吸附性能最佳。值得说明的是，实际应用中饮用水中的离子含量达不到200mm，而混合凝胶在na
+
为0～100mm或高达500mm时也具有不错的吸附性能，可以在实际应用中利用。但若是应用于分离水中的特定目标物，并且寻求较高的吸附率，缓冲液少量的盐离子能使dna/琼脂糖混合凝胶达到最佳性能。
[0065]
(2)mg
2+
浓度对脱除的影响
[0066]
实验设置了5个实验组，分别在含0、10mm、50mm、100mm和200mm的mg
2+
条件下进行吸附试验，利用荧光放大方法测定上清液中pb
2+
含量，通过荧光放大40min后的放大倍数(f-fb)/(f
0-fb)判断吸附效果(放大倍数越小说明吸附效果越好)，如图9。由图可知，水溶液中mg
2+
的含量为2mm时，上清液中的pb
2+
的荧光增长比例最小，这说明mg
2+
为2mm时rca产物/琼脂糖混合凝胶的吸附性能最佳。而且由两种离子对比可知，mg
2+
对脱除的影响比na
+
更大，可能是由于相同浓度下mg
2+
带的电荷比na
+
多。
[0067]
4.ph对脱除的影响
[0068]
本实验设置7个实验组，离子条件为之前优化好的200mm na
+
、2mm mg
2+
，再将缓冲液的ph分别调至5、6、7、8、9、10、11进行试验，结果如图10所示，图10-a为不同ph下脱除后上清液的荧光放大倍数(放大倍数越小说明吸附效果越好)，图10-b为不同ph下计算得到的脱除率。
[0069]
由图10-b可知，在ph 5～11这个范围内，吸附效率均大于98％，说明rca产物/琼脂糖混合凝胶在广泛的ph范围内都有很高的性能。体系中pb
2+
浓度微小的区别只能由荧光信号放大倍数说明，由图10-a可知，在ph 5～7时，上清液中的pb
2+
浓度随着ph的增高而增大，说明在ph 5～7范围内，ph越大，脱除效率越低。在ph 7～11时，上清液中的pb
2+
浓度差别不大，说明碱性的环境对于脱除反应较为不利。
[0070]
表1实施例1中使用的寡核苷酸单链序列
[0071][0072]
注：斜体加粗部分为核糖核苷酸，其余为脱氧核糖核苷酸；下划线为功能核酸的活性中心。
[0073]
实施例2dna/琼脂糖凝胶对重金属镉离子的脱除
[0074]
1.dna/琼脂糖凝胶的制备
[0075]
(1)适配体及dnazyme单体的序列设计
[0076]
将适配体或dnazyme单体的两段序列具有左右各11bp的互补区域，rca后相邻的互补区域为22bp，保证两条长链能够稳定结合。中间突起区域为具有吸附cd
2+
能力的功能性核酸序列，将带有适配体cd2-2的序列命名为a-cd22(图11-a)，将带有bn-cd16 dnazyme的序列命名为a-cd16(图11-b)。与此同时，他们互补序列依次命名为b-cd22、b-cd16。为了后期验证两条rca长链成功杂交，在a/b的互补区域还设计有限制性内切酶hpych4v的酶切位点(图11下划线序列)。
[0077]
(2)功能核酸聚集体的制备：
[0078]
在1
×
pnk buffer a缓冲体系中，将所设计的适配体、dnazyme单体的互补序列ssdna a
’‑
cd22、a
’‑
cd16、b
’‑
cd22、b
’‑
cd16以适当的浓度(50μm)加到体系中，添加6倍于ssdna浓度的atp、10u pnk(10u/μl)后于37℃孵育8h完成ssdna的5
’‑
磷酸化。
[0079]
随后使用splint法环化制备模板环。制备时需借助成环辅助链a
’‑
cd22sp(7+7)、b
’‑
cd22sp(7+7)、a
’‑
cd16sp(7+7)、b
’‑
cd16sp(7+7)。在1
×
t4 dna buffer缓冲体系中，加入5’端磷酸化修饰的成环链(p-ssdna)5μm，以及其对应的辅助成环链(splint)15μm，于pcr仪中经90℃反应3min，然后以0.1℃/s降温至25℃，保持15min，加入10u t4 dna ligase后于25℃下孵育3h。
[0080]
为了得到适配体及dnazyme单体的聚合物，采用滚环扩增技术，分别以a
’‑
cd22sp(7+7)、b
’‑
cd22sp(7+7)、a
’‑
cd16sp(7+7)和b
’‑
cd16sp(7+7)为引物，使用phi29 dna聚合酶对之前制备好的模板环ca
’‑
cd22、ca
’‑
cd16、cb
’‑
cd22、cb
’‑
cd16进行滚环扩增，使用引物：模板＝1:1，终浓度均为1μm，在1
×
phi 29buffer内加入1mm dntps，以及6u phi29 dna聚合酶进行滚环扩增，于30℃保温1h，扩增产物称为a-cd22、b-cd22、a-cd16及b-cd16。
[0081]
在10mm mg
2+
条件下，取扩增后得到的rca产物a和b，于90℃保温3min，再以0.1℃/s的速率降温至25℃，并保温20min，以达到充分的杂交。
[0082]
(3)rca产物/琼脂糖凝胶的制备
[0083]
将0.2g琼脂糖和20ml 0.5
×
tbe高火加热，降温至60℃后加入不同量(50pmol、100pmol)的rca杂交产物(a+b)与10μl gelred染液(1000
×
)，待琼脂糖冷却凝固。
[0084]
2.使用dna/琼脂糖凝胶脱除水溶液中的cd
2+
[0085]
将含10pmol rca杂交产物的凝胶碎浸入8ml含1μm cd
2+
的tris-hcl(ph＝8)缓冲液中，在室温下使用混匀仪以70rpm混匀12h。从溶液中除去凝胶碎，检测上清液中重金属的残留cd
2+
的浓度。
[0086]
图12中的结果显示，当使用单链rca产物和杂交后rca产物制备的琼脂糖凝胶吸附cd
2+
时，相较于仅使用琼脂糖凝胶的对照组，吸附率将近90％，可以实现对水溶液中cd
2+
的高效吸附。
[0087]
表2实施例2中使用的寡核苷酸单链序列
[0088][0089]
注：下划线部分为功能核酸的活性中心。
[0090]
实施例3dna/琼脂糖凝胶对重金属cr
3+
的脱除
[0091]
1、dna/琼脂糖凝胶的制备
[0092]
1)适配体及dnazyme单体的序列设计
[0093]
查阅文献得知，现无cr特异性dnazyme，目前，大多数研究使用ce13d dnazyme检测铬离子，在此过程中，可通过磷酸盐缓冲液掩盖ce等镧系离子，因此，本研究选用ce13d进行cr
3+
的吸附。将ce13d dnazyme单体序列命名为a-cr和b-cr(图13)，其中a、b具有11+10bp的互补区域，rca后相邻的互补区域为21bp，保证了两条长链能够稳定结合。中间突起区域为具有吸附cr
3+
能力的功能性核酸序列，为了后期验证两条rca长链成功杂交，在a/b的互补区域还设计有限制性内切酶hpych4v的酶切位点(图13下划线)。
[0094]
2)功能核酸聚集体的制备：
[0095]
在1
×
pnk buffer a缓冲体系中，将所设计的功能核酸单体的互补序列ssdna a
’‑
cr、b
’‑
cr以适当的浓度(50μm)加到体系中，添加6倍于ssdna浓度的atp、10u pnk(10u/μl)后于37℃孵育8h完成ssdna的5
’‑
磷酸化。
[0096]
随后使用splint法环化制备模板环。制备时需借助成环辅助链a
’‑
crsp(7+7)、b
’‑
crsp(7+7)。在1
×
t4 dna buffer缓冲体系中，加入5’端磷酸化修饰的成环链(p-ssdna)5μm，以及辅助成环链15μm，于pcr仪中经90℃反应3min，以0.1℃/s降温至25℃保持15min，加入10u t4 dna ligase后于25℃下孵育3h。
[0097]
为了得到dnazyme单体的聚合物，采用滚环扩增技术，分别以a
’‑
crsp(7+7)、b
’‑
crsp(7+7)为引物，使用phi29 dna聚合酶对之前制备好的模板环ca
’‑
cr、cb
’‑
cr进行滚环扩增，使用引物摩尔量：模板摩尔量＝1:1，终浓度均为1μm，在1
×
phi29 buffer内加入1mm dntps，以及6u phi29 dna聚合酶进行滚环扩增，于30℃保温1h，扩增产物称为a-cr、b-cr。
[0098]
在10mm mg
2+
条件下，取扩增后得到的rca产物a-cr、b-cr混合，于90℃保温3min，再以0.1℃/s的速率降温至25℃保温20min，以达到充分的杂交。
[0099]
(3)rca产物/琼脂糖凝胶的制备
[0100]
将0.2g琼脂糖和20ml 0.5
×
tbe高火加热，降温至60℃后加入不同量(50pmol、100pmol)的rca杂交产物(a+b)与10μl gelred染液(1000
×
)，待琼脂糖冷却凝固。
[0101]
2.使用dna/琼脂糖凝胶脱除水溶液中的cr
3+
[0102]
将含10pmol rca杂交产物的凝胶碎浸入8ml含1μm cr
3+
的tris-hcl(ph＝8)缓冲液中，在室温下使用混匀仪以70rpm混匀12h。从溶液中除去凝胶碎，取出上清液，使用双发卡环状dnazyme介导的双循环法分析上清液中cr
3+
的浓度。
[0103]
图14中的结果显示，当使用单链rca产物和杂交后rca产物制备的琼脂糖凝胶吸附cr
3+
时，相较于仅使用琼脂糖凝胶，吸附率也有显著的提升，可以实现对水溶液中cr
3+
的高效吸附。
[0104]
表3实施例3中使用的寡核苷酸单链序列
[0105][0106]
注：下划线部分为功能核酸的活性中心。
[0107]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：

1.一种dna/琼脂糖凝胶的制备方法，其特征在于，将琼脂糖在水中加热至融化，在冷却凝固前，加入功能性核酸长链，所述功能性核酸长链上含有重复的功能性序列，琼脂糖凝固后形成三维网状结构，功能性核酸长链在琼脂糖中迁移率很小甚至无法通过高浓度琼脂糖空隙，从而被固定于琼脂糖的三维网络中。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述功能性核酸长链为带有靶标特异性结合能力的核酸适配体或具有催化功能的dna分子。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述功能性核酸长链为单链或杂交链，所述单链为采用滚环扩增方法制备的串联重复序列；所述杂交链的制备方法是：采用滚环扩增方法制备两条长链dna，一条是含有重复的功能性序列的单链dna，所述功能性序列的两侧为互补区域，另一条是所述单链dna的互补链，所述互补链与所述功能性序列的两侧的互补区域配对，所述互补链上与所述功能性序列相对的位置为预留区域；将两条长链dna杂交，杂交后的双链dna具有稳定的二级结构，并且功能性序列在预留区域位置形成突起。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述功能性序列的两侧的互补区域为20bp，以保证两条长链dna能够稳定结合。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在滚环扩增中，引物与模板的浓度比为1:1。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，两条长链dna杂交是在mg
2+
存在的条件下进行。7.权利要求1的方法制备的dna/琼脂糖凝胶在重金属脱除方面的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述的dna/琼脂糖凝胶切碎以增大接触面积，随后浸入被重金属污染的溶液中，在室温下使用以20～120rpm混匀，从溶液中除去凝胶碎。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在被重金属污染的溶液加入少量的na
+
或mg
2+
，以增加脱除效果，所述na
+
为0.01～300mm，mg
2+
为0.5～3mm。10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，调整被重金属污染溶液的ph 5～11，以提高所述dna/琼脂糖凝胶的脱除性能。

技术总结

本发明属于重金属脱除技术领域。以DNA作为吸附剂用于脱除水中的污染物时，需要对DNA或基底进行修饰从而将DNA负载到基体上，该方法操作复杂。针对该问题，本发明提供一种DNA/琼脂糖凝胶的制备方法，将琼脂糖在水中加热至融化，在冷却凝固前，加入功能性核酸长链，所述功能性核酸长链上含有重复的功能性序列，琼脂糖凝固后形成三维网状结构，功能性核酸长链在琼脂糖中迁移率很小甚至无法通过高浓度琼脂糖空隙，从而被固定于琼脂糖的三维网络中。本发明制备的DNA/琼脂糖凝胶可在重金属脱除方面应用。该方法操作简单且不需要对琼脂糖或DNA进行额外的修饰即可达到固定的目的，真正实现对重金属污染物的低成本高特异性脱除。实现对重金属污染物的低成本高特异性脱除。