一种抑制乳腺癌的迁移和侵袭的miR-7-5p模拟物及其筛选方法、应用

一种抑制乳腺癌的迁移和侵袭的mir-7-5p模拟物及其筛选方法、应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，主要涉及了一种抑制乳腺癌的迁移和侵袭的mir-7-5p模拟物及其筛选方法、应用。

背景技术：

2.近年来，乳腺癌的发病率逐年上升，已成为威胁女性健康的头号杀手。乳腺癌往往由于肿瘤细胞不可控制的扩散而导致其他一些器官的功能下降，甚至衰竭以致死亡。尽管目前原发性乳腺癌的取得了不错的进展，但转移性乳腺癌还没有有效的方法。包括手术、化疗和放疗等手段主要适用于早期未转移的乳腺癌患者，对晚期广泛转移的乳腺癌患者收益甚微。并且利用化疗等方法的毒副作用很大。
3.然而，近年来的研究显示外泌体可装载细胞释放的大量生物活性分子(小的非编码rna、mrna、dna和蛋白质等)进入体液，伴随体液流动并结合靶细胞膜将其内容物释放到靶细胞中，起到细胞间信息传递的作用。其中，外泌体mirnas也在一定程度上反映了肿瘤细胞中异常mirnas的表达模式。异常mirnas更能表现对该肿瘤细胞的具体作用，而且由于mirna是生物体内天然存在具有通过碱基互补原理靶向抑制基因表达能力的小rna，所以mirna具有特异性的优势，是开发靶向物的有力工具。因此，利用不同侵袭性的乳腺癌细胞的外泌体筛选与乳腺癌转移相关的差异表达mirnas，可以开发能够抑制乳腺癌转移的小核酸药物。

技术实现要素：

4.针对现有转移性乳腺癌中存在的问题，本发明提供一种抑制乳腺癌的迁移和侵袭的mir-7-5p模拟物，该模拟物，能够靶向抑制ryk基因表达从而抑制乳腺癌的迁移侵袭。
5.本发明还提供了一种抑制乳腺癌的迁移和侵袭的mir-7-5p模拟物的筛选方法。
6.本发明的另一目的为提供了一种mir-7-5p模拟物在制备抑制乳腺癌的迁移和侵袭的小核酸药物中的应用。
7.本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：本发明提供了一种抑制乳腺癌的迁移和侵袭的mir-7-5p模拟物，所述mir-7-5p的序列如seq id no.1所示：uggaagacuagugauuuuguuguu。
8.进一步的，所述mir-7-5p模拟物的序列为：引导链: uggaagacuagugauuuuguuguu；过客链: caacaaaaucacuagucuuccauu。
9.本发明还提供了一种mir-7-5p模拟物的筛选方法，包括以下步骤：（1）利用生物信息学分析geo数据库下的gse114329数据集中的mda231 exo 和mcf7 exo两个子集，从数据集中下载原始数据后，对原始数据进行过滤、处理，然后进行差
异表达基因的筛选；（2）将筛选的差异表达的mirna进行qrt-pcr分析，筛选出mir-7-5p。
10.进一步的，步骤（2）中，所述qrt-pcr的程序为：95℃预变性5分钟，40个循环包括95℃ 15秒，60℃ 20秒，72℃ 40秒，内参为u6。
11.进一步的，所述qrt-pcr分析过程中，各mirna引物序列具体为：。
12.本发明还提供了一种mir-7-5p模拟物在制备抑制乳腺癌的迁移和侵袭的小核酸药物中的应用。
13.本发明进一步利用mir-7-5p模拟物进行伤口愈合实验和transwell迁移侵袭实验来证明了mir-7-5p模拟物能够在体外显著抑制乳腺癌的迁移侵袭。本发明又进一步验证mir-7-5p模拟物是可以在体外通过靶向抑制ryk基因的表达来抑制乳腺癌的迁移侵袭。
14.本发明筛选过程中，筛选出来的mirna包括mir-7-5p、mir-98-5p、mir-193a-5p、mir-345-5p、mir-378a-3p。
15.本发明的有益效果为：本发明在于提供mir-7-5p模拟物在显著抑制乳腺癌侵袭转移中的应用，研究发现mir-7-5p模拟物通过靶向抑制ryk的分子机制产生对乳腺癌的显著抑制效果。在体外培养体系下，mir-7-5p模拟物作用抑制乳腺癌的迁移侵袭能力；mir-7-5p模拟物能够抑制乳腺癌中ryk的蛋白和mrna水平。在裸鼠体内，mir-7-5p模拟物也可以显著抑制乳腺癌的迁移侵袭能力。因此，本发明验证mir-7-5p模拟物能够成为显著抑制乳腺癌转移的小核酸药物。
附图说明
16.图1为生物信息学分析mda-mb-231和mcf7源外泌体中差异表达mirnas的火山图。
17.图2为外泌体的鉴定图。
18.图3为各mirna在细胞以及外泌体中的表达图。
19.图4为mir-7-5p模拟物能抑制乳腺癌的迁移侵袭效果图。
20.图5为mir-7-5p模拟物靶向抑制ryk基因的作用结果图。
具体实施方式
21.以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明上述方法思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包含在本发明的范围内。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
22.实施例1 生物信息学分析筛选不同侵袭性乳腺癌细胞来源的外泌体内差异表达的mirna。
23.从geo数据库中下载gse114329数据集中的mda231 exo 和mcf7 exo两个子集的原始数据，然后对原始数据进行过滤、处理，得到干净的序列，然后进行差异表达基因的筛选。筛选出来的在低侵袭性乳腺癌细胞系来源的外泌体内高表达的mirna有9个，结果如图1所示。进一步排除重复数据中存在较大差异的几个mirna，最后选择了5个mirna，包括mir-7-5p、mir-98-5p、mir-193a-5p、mir-345-5p、mir-378a-3p。
24.实施例2 验证筛选出的不同侵袭性乳腺癌细胞来源的外泌体内差异表达的mirna。
25.（1）细胞培养mda-mb-231细胞系和mcf7细胞系购自大连美仑生物有限公司。两种细胞都在含10%胎牛血清（bi）的高糖dmem培养基（solarbio）中培养，在5% co
2 以及温度为37℃的细胞培养箱中培养。为了获得不受胎牛血清外泌体影响的外泌体，细胞也在含10%无外泌体胎牛血清（sbi）的高糖dmem培养基中培养。将细胞培养至对数生长期进行实验。
26.（2）外泌体提取及鉴定细胞培养过程中收集细胞培养上清，细胞培养上清高速离心：300
×
g 4℃离心10 min，2000
×
g 4℃离心15 min，10000
×
g 4℃离心30 min，然后进行超速离心：上清于4℃下110000
×
g离心90 min，弃去上清，沉淀于预冷的pbs中重悬，4℃下110000
×
g继续离心90 min，沉淀于适当的pbs中重悬。利用透射电镜观察具体形态。利用zeta电位及纳米粒度分析仪来检测粒径大小。利用western blot实验来检测外泌体标志蛋白cd63、tsg101以及alix。结果如图2所示。结果显示提取出来的为外泌体。
27.（3）qrt-pcr实验用专门提取small rna的rnaiso（takara bio）从细胞和外泌体中提取mirna。采用mirna 1st strand cdna synthesis kit（vazyme）对mirna进行反转录。使用sybr green试剂（vazyme）对rna水平进行实时定量分析。根据以下协议进行实时分析：95℃预变性5分钟，40个循环包括95℃ 15秒，60℃ 20秒，72℃ 40秒。内参为u6。结果如图3所示。各mirna引物
序列见表1。结果显示，mir-7-5p为其中差异表达最明显的mirna，因此猜测mir-7-5p可能能够作为显著抑制乳腺癌转移的小核酸药物。
28.表1实施例3 mir-7-5p模拟物能够显著抑制乳腺癌的迁移侵袭。
29.（1）细胞转染实验将细胞培养至每孔约80%的细胞生长。按照说明使用稀释后的lipornaimax试剂（mei5bio）以及mir-7-5p的模拟物和阴性对照，加到细胞培养基中，共孵育24 h以上。mirna模拟物和阴性对照的序列见表2。
30.表2（2）伤口愈合实验
将处理后的细胞接种于6孔板中，培养至每孔细胞生长至80%左右，然后用10 μl在每孔中等距刮取3层细胞。pbs洗涤两次，加入新的细胞培养基，然后用倒置显微镜测量划痕的宽度。加入预先处理好的用脂质体包裹的mir-7-5p的模拟物或阴性对照，然后再孵育48小时后，再次测量划痕宽度。以创面愈合率评价细胞迁移率，创面愈合率=（0 h划痕宽度－24 h划痕宽度）/ 0 h划痕宽度
×
100%。结果如图4a所示。结果也表明了mir-7-5p的模拟物能够显著抑制乳腺癌细胞的迁移。
31.（3）transwell迁移侵袭实验采用底部孔径为8 μm的聚碳酸酯膜transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力。利用无血清的dmem培养基重悬转染后的细胞，加入上腔(有基质凝胶包被或无包被)，下腔加入含10%血清的dmem完全培养基750 μl。在培养箱中培养24 h。首先将细胞固定在4%多聚甲醛中2分钟然后在甲醇中渗透20分钟。最后，利用0.1%的结晶紫染15分钟。然后轻轻用棉签将小室上层未迁移的细胞和基质凝胶涂层刮掉并放置在在显微镜下观察。结果如图4b所示。结果显示，mir-7-5p的模拟物能够在体外显著抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。
32.（5）荷瘤裸鼠皮下肿瘤模型建立选择4周龄雌性balb/c裸鼠，体重约为12-16 g。裸鼠在到达后进行适应性喂养一周，食物、水以及垫料经过严格灭菌处理，准备充足。将复苏的mda-mb-231细胞传代培养3次，处理细胞离心后用无血清的dmem培养基制备细胞悬液（2.5
×
10
7 cells/ml），皮下注射100 μl在裸鼠腋下，构建荷瘤裸鼠乳腺癌皮下肿瘤模型。当荷瘤裸鼠的肿瘤体积增大到约100 mm3，将裸鼠随机分为3组（n=3），分别瘤内多位点注射生理盐水，mir-7-5p 模拟物以及阴性对照，每隔两天一次，注射7次。
33.（6）h&e染取裸鼠肿瘤组织。首先利用4%多聚甲醛对肿瘤进行固定，然后利用石蜡进行常规包埋切片。然后将其放置于二甲苯以及不同浓度的乙醇中脱蜡，然后利用蒸馏水水洗2分钟。然后后苏木素和伊红染，每次染后注意将多余染液冲洗干净。然后再次利用乙醇和二甲苯进行常规脱水和透明，然后利用中性树脂进行封片。晾干后在显微镜下进行观察。结果如图4c所示。结果显示，注射mir-7-5p 模拟物的一组肿瘤组织边缘更加明显，因此说明mir-7-5p也能够在体内显著抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。
34.实施例4 mir-7-5p模拟物是可以通过靶向抑制ryk基因的表达来抑制乳腺癌的迁移侵袭。
35.（1）双荧光素酶报告基因实验由上海吉玛基因构建ryk-wt和ryk-mut的pmirglo载体（图5a）。将对数生长期mda-mb-231细胞接种于12孔板上。当细胞培养达到70%左右，将模拟物阴性对照或mir-7-5p 模拟物与ryk-wt和ryk-mut共转染进入mda-mb-231细胞中。转染48 h后进行细胞裂解，荧光素酶测定试剂盒检测荧光素酶活性。结果如图5b所示。结果显示，mir-7-5p 模拟物能够靶向抑制ryk基因。
36.（2）western blot实验首先用裂解液裂解细胞或外泌体，在冰上孵育15分钟，然后离心收集上清液。蛋白浓度测定采用bca蛋白测定试剂盒进行测定。蛋白样品用10% sds-聚丙烯酰胺凝胶分离，然后将蛋白条带转移到0.45 μm pvdf膜上，然后用5%脱脂奶粉封闭pvdf膜。将封闭后的膜与
相应的一抗稀释液在4℃孵育过夜后用tbst缓冲液洗涤四次，然后将膜与二抗稀释液在4℃孵育4-5 h，二抗孵育结束后继续用tbst缓冲液洗涤，然后使用ecl发光液和成像系统观察膜上的蛋白条带。结果如图5d所示。结果显示，在转染模拟物后mda-mb-231细胞中的ryk基因的蛋白表达明显降低，所以证明mir-7-5p 模拟物能够靶向抑制ryk基因的表达。
37.（3）qrt-pcr实验用rnaiso（takara bio）从细胞和外泌体中提取mrna。采用hiscript ii 1st strand cdna synthesis kit（vazyme）对mrna进行反转录。使用sybr green试剂（vazyme）对rna水平进行实时定量分析。根据以下协议进行实时分析：95℃预变性5分钟，40个循环包括95℃ 10秒，60℃ 30秒。内参为gadph。结果如图5所示。ryk mrna引物序列见表1。结果显示（图5c），mir-7-5p也能降低ryk的mrna表达，证明mir-7-5p 模拟物能够靶向抑制ryk基因的表达。
38.（4）免疫组化利用和h&e染同样的方法进行石蜡包埋，切片以及脱蜡处理，除去内源性的过氧化氢酶并清洗后再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中进行抗原修复。然后利用血清封闭，进行相关抗体的孵育。然后加入sabc孵育半小时后，清洗后再加入显剂。然后利用苏木素复染后利用乙醇和二甲苯进行脱水。最后利用中性树脂进行封片，晾干后在显微镜下进行观察。结果显示（图5e），mir-7-5p也能降低ryk的表达，证明mir-7-5p 模拟物在体内也能够靶向抑制ryk基因的表达。

技术特征：

1.一种抑制乳腺癌的迁移和侵袭的mir-7-5p模拟物，其特征在于，所述mir-7-5p的序列如seq id no.1所示：uggaagacuagugauuuuguuguu。2.根据权利要求1所述的mir-7-5p模拟物，其特征在于，所述mir-7-5p模拟物的序列为：引导链: uggaagacuagugauuuuguuguu；过客链: caacaaaaucacuagucuuccauu。3.一种如权利要求1或2所述的mir-7-5p模拟物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用生物信息学分析geo数据库下的gse114329数据集中的mda231 exo 和mcf7 exo两个子集，从数据集中下载原始数据后，对原始数据进行过滤、处理，然后进行差异表达基因的筛选；（2）将筛选的差异表达的mirna进行qrt-pcr分析，筛选出mir-7-5p。4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，所述qrt-pcr的程序为：95℃预变性5分钟，40个循环包括95℃ 15秒，60℃ 20秒，72℃ 40秒，内参为u6。5.根据权利要求3或4所述的筛选方法，其特征在于，所述qrt-pcr分析过程中，各mirna引物序列具体为：
。6.一种如权利要求1所述的mir-7-5p模拟物在制备抑制乳腺癌的迁移和侵袭的小核酸药物中的应用。

技术总结

本发明属于生物医药技术领域，主要涉及了一种抑制乳腺癌的迁移和侵袭的miR-7-5p模拟物及其筛选方法、应用。所述miR-7-5p的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明发现miR-7-5p模拟物通过靶向抑制RYK的分子机制产生对乳腺癌的显著抑制效果。在体外培养体系下，miR-7-5p模拟物作用抑制乳腺癌的迁移侵袭能力；miR-7-5p模拟物能够抑制乳腺癌中RYK的蛋白和mRNA水平。在裸鼠体内，miR-7-5p模拟物也可以显著抑制乳腺癌的迁移侵袭能力。因此，本发明验证miR-7-5p模拟物能够成为显著抑制乳腺癌转移的小核酸药物。酸药物。酸药物。