一种软枣猕猴桃性别鉴定的分子标记及特异性引物对M4的应用

一种软枣猕猴桃性别鉴定的分子标记及特异性引物对m4的应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学及遗传育种领域，具体涉及一种软枣猕猴桃性别鉴定的分子标记及特异性引物对m4的应用。

背景技术：

2.猕猴桃(actinidia)因其风味独特、营养丰富深受消费者喜爱。软枣猕猴桃(actinidia arguta)则是猕猴桃属近年来中发展最为迅速的新兴栽培品种。软枣猕猴桃果实大小与枣相似，果皮光滑可食用，具有丰富的膳食纤维、维生素、多糖等营养价值，对于缓解便秘、高血压、高血脂等慢性疾病都有很好的效果。猕猴桃属植物都属于雌雄异株，在果园种植中需要配置少量的雄株以满足授粉的需求。因为雄株并不结实，所以雄株的培育价值和生产需求要远远小于雌株。但是实生后代中由于幼苗期无法分辨性别使得大量的雄株在育种早期占用了大量的资源，提高了育种成本，严重影响了育种进程，造成了资源的浪费。因此，开发用于软枣猕猴桃幼苗早期性别鉴定的标记或方法迫在眉睫。
3.已有研究人员在猕猴桃属中尝试开发性别鉴定的分子标记，例如申请号为2014105250145、201410524999x、2014105230438、202010136148、202110969916的相关技术，但是这些技术主要适用于猕猴桃属内的其他物种或种间杂交体。软枣猕猴桃由于其自身复杂的倍性和遗传背景并没有很好的通用性，难以满足软枣猕猴桃育种工作的需求。因此，开发一种针对软枣猕猴桃早期性别鉴定的方法辅助软枣猕猴桃育种具有重要的现实意义。

技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种软枣猕猴桃雄性特异性分子标记及其引物对m4的应用，能够在软枣猕猴桃幼苗期或非开花挂果期快速地将雄性和雌性软枣猕猴桃植株区分开来，操作简单，重复性好，准确度高。
5.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.发明人收集了不同地理来源的88份软枣猕猴桃种质资源作为实验材料，通过对这些样品进行全基因组重测序，比对参考基因组，snp筛选以及与性别的全基因组关联分析，得到了可能的性别关联位点，结合基因注释结果，在软枣猕猴桃雌、雄样本差异区段设计特异性引物，开发雌雄性别鉴定的特异分子标记。最终得到可准确鉴定出软枣猕猴桃雄性和雌性植株的分子标记及其引物对m4。
7.分子标记在软枣猕猴桃性别鉴定中的应用，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.3所示，雄性软枣猕猴桃中含有所述的分子标记，雌性软枣猕猴桃中不含有所述的分子标记。
8.一种用于软枣猕猴桃性别鉴定的试剂盒，所述试剂盒含有用于扩增序列如seq id no.3所示的分子标记的引物对，引物对序列如seq id no.1-2所示，利用所述的引物在雄性
软枣猕猴桃中可扩增出dna条带，在雌性软枣猕猴桃中无法扩增出dna条带。
9.利用上述分子标记引物对m4鉴定软枣猕猴桃性别的方法，包括以下步骤：
10.(1)利用改良的ctab法提取待鉴定的软枣猕猴桃样品的dna；
11.(2)以步骤(1)中提取的基因组dna为模板，利用引物对m4进行pcr扩增反应；
12.(3)利用琼脂糖凝胶电泳技术检测pcr扩增产物；
13.(4)根据特异性带型进行软枣猕猴桃性别鉴定，在雄性样本中可扩增出656bp的dna条带，在雌性样本中无法扩增出656bp的dna条带。
14.本发明的有益效果在于：本发明提供的分子标记可将软枣猕猴桃雄性植株和雌性植株准确区分开，操作简单、重现性好、准确度高，有效克服童期用表型鉴定方法无法准确鉴定区分软枣猕猴桃性别的缺点。
附图说明
15.图1为实施例2中利用本发明提供的分子标记引物m4对软枣猕猴桃的雌雄鉴定的电泳图。
具体实施方式
16.本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业或公开的渠道。
17.实施例1：用于软枣猕猴桃性别鉴定的分子标记引物的获得
18.申请人收集了不同地理来源的88份软枣猕猴桃种质资源作为实验材料，其中雄株40个，雌株48个。利用改良的ctab法对收集到的种质提取基因组dna，然后利用illumina测序技术平台进行全基因组重测序。将测序得到的二代短序列数据过滤后比对到软枣猕猴桃的参考基因组进行单核苷酸多态性(snp)检测和筛选并与性别进行全基因组关联分析，得到了可能的性别关联区域。根据雌雄体在性别关联区域的二代数据覆盖深度差异，对位于性别关联区域内的差异区域的基因设计大片段引物，开发雌雄性别鉴定的特异性标记。最终得到软枣猕猴桃雄性特异性分子标记引物对m4可准确鉴定出软枣猕猴桃雄性和雌性植株。
19.用于pcr扩增分子标记的引物对m4的正向引物序列为:5'-taaacggatcacagatcacgaa-3'，如序列表中seq id no.1所示；反向引物序列为:5'-aatgaacccaaaaaagcaaagc-3'，如序列表中seq id no.2所示。扩增出的特异性分子标记的序列如seq id no.3所示，长度656bp。
20.实施例2：分子标记引物对m4在软枣猕猴桃早期性别鉴定中的应用
21.(1)按照改良的ctab法提取48个软枣猕猴桃植株的dna，48个样品中雄株24个、雌株24个，用1.2％琼脂糖凝胶电泳和nanodrop分光光度计检测dna质量和浓度，将dna浓度稀释为25ng/μl备用；
22.(2)pcr反应体系按20μl计为：
23.dna模板(25ng/μl)2μl引物f(10μm)1μl引物r(10μm)1μl2×
taq pcr mix预混液10μl无菌水6μl
24.pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min，10℃保存。得到的pcr产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳分离。
25.利用引物对m4扩增软枣猕猴桃雄性和雌性样本的pcr产物的电泳结果如图1所示。雄性样本中含有特异性分子标记，在656bp出现dna条带，雌性样本中在656bp未出现条带。
26.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：

1.分子标记在软枣猕猴桃性别鉴定中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.3所示，雄性软枣猕猴桃中含有所述的分子标记，雌性软枣猕猴桃中不含有所述的分子标记。2.一种用于软枣猕猴桃性别鉴定的试剂盒，其特征在于，含有用于扩增权利要求1所述分子标记的引物对。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，引物对序列如seq id no.1-2所示。4.引物对在软枣猕猴桃性别鉴定中的应用，其特征在于，所述引物对是用于扩增权利要求1所述分子标记。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，引物对序列如seq id no.1-2所示，利用所述的引物在雄性软枣猕猴桃中扩增出dna条带，在雌性软枣猕猴桃中无法扩增出dna条带。

技术总结

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，公开了一种用于软枣猕猴桃性别鉴定的分子标记及特异性引物对M4的应用，引物序列如SEQ ID NO.1和2所示，分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。雌雄异株的软枣猕猴桃由于幼苗期冗长，需要5~7年时间才能开花从而确定性别。利用本发明提供的特异性分子标记及引物对可对软枣猕猴桃的性别进行快速准确地鉴定，避免实生后代中大量的雄株在育种和生产中造成人力物力的浪费。在分子标记的基础上，本发明建立了一种软枣猕猴桃性别鉴定的试剂盒和幼苗期的性别鉴定方法，操作简单，价格低廉，稳定性好，具有较高的应用潜力和经济价值。具有较高的应用潜力和经济价值。