一种ICR小鼠皮肤损伤的模型建立方法及应用

一种icr小鼠皮肤损伤的模型建立方法及应用
技术领域
1.本发明涉及一种icr小鼠皮肤损伤的模型建立方法及应用，属于微生物学和实验动物学技术领域。

背景技术：

2.蓖麻毒素（ricin toxin，rt）是一种广泛存在的植物毒素，属于ii型核糖体失活蛋白（rip），由a、b两条链构成，a链（rta）具有使核糖体失活的能力，是毒性链；b链（rtb）为结合链，是一种半乳糖凝集素（galectin）结合蛋白，可结合靶细胞并诱导细胞损伤。蓖麻毒素样蛋白基因存在于多种病原微生物中，在根孢囊霉（rhizophagus）、德氏根霉（rhizopus delemar）、链球菌属（streptomyces）、芽孢杆菌属（paenibacillus）等中发现的rlt蛋白存在同源性，且均具有生物学毒力。
3.申请人多年来对毛霉菌致病毒力的基因组学开展了较为深入的研究，同时发现mi上清液可导致huvecs损伤，提示mi可能分泌相关毒力因子损伤血管内皮。为明确mi外泌因子成分，申请人构建一种由毛霉毒素蛋白诱导icr小鼠皮肤损伤的模型，以开展毛霉病感染机制中与毛霉毒素蛋白相关的基础研究和临床应用。

技术实现要素：

4.针对上述存在的技术问题，本发明的目的是：提出了一种icr小鼠皮肤损伤的模型建立方法及应用。
5.本发明的技术解决方案是这样实现的：一种icr小鼠皮肤损伤的模型建立方法，包含以下步骤：
①
以6-8周龄的雄性icr小鼠为实验动物，在近尾部区域后背备皮后，在皮内注射25μg、1ml的毛霉毒素蛋白，形成局部的皮丘；
②
将经过步骤
①
处理后的小鼠饲养7天。
6.优选的，所述的毛霉毒素蛋白是由毛霉菌b50a分离纯化形成。
7.优选的，所述的毛霉毒素蛋白的氨基酸序列如下：mslyfirsqyngrvldvndgsledgaeiivwsqkgsddclnqlwriedgyivnaksakaldisggemepesaiiqyrqksieeaanqrwgidsegyiysearpdlvldiqgrededgtpiilynkregevasnqrwtleefqg。
8.优选的，所述的毛霉菌包含毛霉、少根根霉。
9.可以将上述构建的小鼠皮肤损伤模型应用在毛霉感染的研究中。
10.优选的，所述的毛霉感染包含由毛霉、少根根霉所引发的感染。
11.由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：本发明以icr小鼠为实验动物，在近尾部区域后背注射毛霉毒素蛋白，形成局部的皮丘，来形成皮肤损伤的模型；并可以将模型应用在毛霉感染的研究中，能快速方便地开展毛霉病中与毛霉毒素蛋白相关研究，为毛霉病感染和毛霉毒素蛋白相关的基础研究和临床应用提供了新的方式。
附图说明
12.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对本发明实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据本发明实施例的内容和这些附图获得其他的附图。
13.附图1为本发明所述的毛霉毒素蛋白诱导huvecs的损伤情况图；附图2为三组icr小鼠的大体改变情况图；附图3为毛霉毒素蛋白诱导icr小鼠皮肤损伤的模型；附图4为pbs皮下注射诱导icr小鼠阴性对照组；附图5为毛霉菌株cams-ccpm-d b50a皮下注射诱导icr小鼠阳性对照组。
具体实施方式
14.为使本发明解决的技术问题、采用的技术方案和达到的技术效果更加清楚，下面将结合附图对本发明实施例的技术方案作进一步的详细描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
15.本发明提出了一种icr小鼠皮肤损伤的模型建立方法，包含以下步骤：
①
以6-8周龄的雄性icr小鼠为实验动物，在近尾部区域后背备皮后，在皮内注射25μg、1ml的毛霉毒素蛋白，形成局部的皮丘；所述的毛霉毒素蛋白是由毛霉菌b50a分离纯化形成；毛霉毒素蛋白的氨基酸序列如下：mslyfirsqyngrvldvndgsledgaeiivwsqkgsddclnqlwriedgyivnaksakaldisggemepesaiiqyrqksieeaanqrwgidsegyiysearpdlvldiqgrededgtpiilynkregevasnqrwtleefqg。
16.所述的毛霉菌包括但不限于毛霉、少根根霉等。
17.②
将经过步骤
①
处理后的小鼠饲养7天。
18.模型建立后可以应用在毛霉感染的研究中，所述逇毛霉感染包括但不限于由毛霉、少根根霉等引发的感染。
19.主要过程为：首先通过体外实验初步证实毛霉毒素蛋白（50μg/ml）对huvecs细胞的损伤作用，该浓度可导致47.58%的细胞损伤。其次通过在小鼠背部皮肤进行皮内注射，分别给予阳性对照组小鼠注射1
×
106（
±
0.1
×
106）孢子量、阴性对照组小鼠注射毛霉毒素蛋白溶剂（0.1ml）、毒素蛋白模型组小鼠注射毛霉毒素蛋白（25μg，0.1ml），明确毛霉毒素蛋白诱导icr小鼠皮肤损伤的情况。同时观察感染小鼠的大体改变，一般炎症反应（he染）和炎细胞浸润情况（cd68和ly6g免疫组化染），证明毛霉毒素蛋白（25μg，0.1ml）可以诱导icr小鼠以中性粒细胞反应为主的皮肤损伤。
20.具体步骤如下：
①
以6-8周龄的雄性icr小鼠为实验动物，近尾部区域后背备皮后，皮内注射毛霉毒素蛋白（25μg，0.1ml）形成局部的皮丘，将处理后的小鼠饲养7天。
21.②
设置6-8周龄的雄性icr小鼠为阳性对照组，以相同方式注射毛霉菌株cams-ccpm-d b50a菌悬液（1
×
106孢子量，0.1ml）形成局部的皮丘，将处理后的小鼠饲养7天。
22.③
设置6-8周龄的雄性icr小鼠为阴性对照组，以相同方式注射蛋白溶剂形成局部
的皮丘，将处理后的小鼠饲养7天。
23.④
将饲养7天后的小鼠局部皮损取材后，4%多聚甲醛浸泡固定后行he染和炎症相关因子的组化染。
24.结果：一、血管内皮损伤的体外实验毛霉毒素蛋白诱导人脐静脉血管内皮细胞（huvecs）损伤后，cck8检测其损伤程度，经实验证明，50μg/ml浓度的毛霉毒素蛋白与huvecs共刺激8小时后，可诱导47.58%的细胞损伤（如图1所示），证明毛霉毒素蛋白可以诱导huvecs的体外损伤，同时指导使用浓度为50μg/ml。
25.二、组织损伤的小鼠实验参考附图2-5。
26.图2为icr小鼠大体改变情况，从左到右依次为：毛霉毒素蛋白诱导icr小鼠皮肤损伤的模型；pbs皮下注射诱导icr小鼠阴性对照组；毛霉菌株cams-ccpm-d b50a菌株皮下注射诱导icr小鼠阳性对照组、图3为毛霉毒素蛋白诱导icr小鼠皮肤损伤的模型，从左到右依次为：he染；cd68免疫组化染；ly6g免疫组化染。
×
100。
27.图4为pbs皮下注射诱导icr小鼠阴性对照组，从左到右依次为：he染；cd68免疫组化染；ly6g免疫组化染。
×
100。
28.图5为毛霉菌株cams-ccpm-d b50a皮下注射诱导icr小鼠阳性对照组，从左到右依次为：he染；cd68免疫组化染；ly6g免疫组化染。
×
100。
29.结论：1.毛霉毒素蛋白诱导icr小鼠皮肤损伤的模型，大体上见皮损局部皮下注射部位破溃，he染上见皮下炎细胞浸润，血管血栓形成，免疫组化染结果提示大量中性粒细胞聚集，少量巨噬细胞包绕。
30.2.pbs皮下注射诱导icr小鼠阴性对照组，大体上皮下注射部位未见明显皮损，he染及免疫组化染未见明显异常。
31.3.毛霉菌株cams-ccpm-d b50a皮下注射诱导icr小鼠阳性对照组，大体上见皮损局部皮下注射部位大小不一的囊肿形成，he染上见皮下炎细胞浸润，大量的孢子菌丝被炎细胞包绕，免疫组化染结果提示大量中性粒细胞聚集，少量巨噬细胞包绕。
32.本发明提出了上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

技术特征：

1.一种icr小鼠皮肤损伤的模型建立方法，其特征在于，包含以下步骤：
①
以6-8周龄的雄性icr小鼠为实验动物，在近尾部区域后背备皮后，在皮内注射25μg、1ml的毛霉毒素蛋白，形成局部的皮丘；
②
将经过步骤
①
处理后的小鼠饲养7天。2.根据权利要求1所述的icr小鼠皮肤损伤的模型建立方法，其特征在于：所述的毛霉毒素蛋白是由毛霉菌b50a分离纯化形成。3.根据权利要求2所述的icr小鼠皮肤损伤的模型建立方法，其特征在于：所述的毛霉毒素蛋白的氨基酸序列如下：mslyfirsqyngrvldvndgsledgaeiivwsqkgsddclnqlwriedgyivnaksakaldisggemepesaiiqyrqksieeaanqrwgidsegyiysearpdlvldiqgrededgtpiilynkregevasnqrwtleefqg。4.根据权利要求2所述的icr小鼠皮肤损伤的模型建立方法，其特征在于：所述的毛霉菌包含毛霉、少根根霉。5.如权利要求1所述的icr小鼠皮肤损伤的模型的应用，其特征在于：将构建的小鼠皮肤损伤模型应用在毛霉感染的研究中。6.根据权利要求5所述的icr小鼠皮肤损伤的模型建立方法的应用，其特征在于：所述的毛霉感染包含由毛霉、少根根霉所引发的感染。

技术总结

本发明提出了一种ICR小鼠皮肤损伤的模型建立方法及应用；以ICR小鼠为实验动物，在近尾部区域后背注射毛霉毒素蛋白，形成局部的皮丘，来形成皮肤损伤的模型；并可以将模型应用在毛霉感染的研究中，能快速方便地开展毛霉病中与毛霉毒素蛋白相关研究，为毛霉病感染和毛霉毒素蛋白相关的基础研究和临床应用提供了新的方式。新的方式。新的方式。