用于合成脂肪醇的构建体，载体，蓝细菌，以 及在蓝细菌中生产脂肪醇的方法

本公开涉及可再生能源领域和生物质能源领域。具体而言，本公开涉及用于在蓝细菌中合成脂肪醇的构建体，包含所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中生产脂肪醇的方法。

当前，能源问题和环境问题正逐步凸显成为制约我国经济社会可持续发展的重要因素。可再生生物燃料的应用被认为是解决这两大问题的有效方式。制备生物乙醇的技术路线相对成熟，是相对容易实现产业化的一种生物燃料；但是乙醇作为燃料，存在着一些缺陷：(1)能量密度低；(2)容易挥发；(3)其易溶于水所导致的一些问题，如发酵过程中对微生物毒性的增加、蒸馏分离过程中除去水相的成本过高以及运输过程中对管道的腐蚀。而理想的生物燃料应具备高能量密度、低吸湿性、低挥发性等特点，并且具有能与现存发动机设备和运输设施相兼容等的性能。最近，长链脂肪醇、长链生物烃等优质脂肪酸类生物燃料，引起了学术界与企业界越来越多的重视。著名合成生物学家Jay D Keasling教授的针对这类生物燃料的研究现状及前景撰写过综述(Lee，S.K.等人，2008)；而且近期Nature杂志报道了JayD Keasling教授及其合作者的最新研究成果：通过代谢工程手段成功实现了在大肠杆菌中合成脂肪醇和蜡脂等脂肪酸类生物燃料(Steen，E.J.等人，2010)。美国著名的生物燃料公司LS9也致力于通过基因工程 改造在大肠杆菌与酿酒酵母等微生物中生产这类新一代的生物燃料(Keasling，J.D.等人，2007)。因此，开展脂肪酸类生物燃料分子的生物合成与代谢调控研究，对于提高生物燃料的品质和产量、推动生物燃料的应用以及应对能源和环境问题日益突出的现状具有重要意义。

目前用于生物燃料研究的微生物体系主要是以大肠杆菌和酿酒酵母为代表的异养微生物。蓝细菌，作为新一代能源微生物系统正受到越来越多的关注(Angermayr，S.A.等人，2009)。在2009年中，国内外几个研究小组相继在利用蓝细菌生产生物燃料方面取得突破：中国石油大学的傅鹏程教授将来源于运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因在集胞藻PCC6803中共表达，实现了太阳能到生物乙醇的转化(产量为5.2mmol/OD730/L/d)(Dexter J.和Fu，P.，2009)；美国加州大学伯克利分校AnastasiosMelis教授的研究小组通过在集胞藻PCC6803中外源表达山葛(Pueraria montana)的异戊二烯合成酶基因，实现了在蓝细菌中生产异戊二烯(产量为50mg/g/d)(Lindberg，P.等人，2009)；加州大学洛杉矶分校James C Liao教授也发表了他们最新的研究成果：通过基因工程手段实现了在聚球藻PCC7942中高效生产异丁醛(最高产量为6,230μg/L/h)(Atsumi，S.等人，2009)，这项成果发表在NatureBiotechnology杂志上。2010年3月29日，PNAS杂志报道了美国亚历桑那州立大学的一项最新的研究成果，即在集胞藻PCC6803中生产和分泌游离脂肪酸(Liu，X.等人，2010)。蓝细菌(也称为蓝藻)是一类能够进行植物型产氧光合作用的原核微生物，它作为新一代能源微生物系统具有如下优势：(1)蓝细菌能够吸收太阳能、固定二氧化碳作为碳源进行自养生长，培养成本低；(2)蓝细菌是一类古老的微生物，已在地球上存在了几十亿年，它们对环境适应能力强，生长迅速；(3)蓝细菌遗传操作方便，遗传背景清晰，许多种类的基因组测序工作也已经陆续完成，这使得利用基因工程手段改造蓝细菌非常方便。其中，集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803是单细胞蓝细菌的代表物 种，其全基因组测序于1996年完成，是最早完成全基因组测序的光合生物，也是目前研究最多的蓝细菌之一，被认为是生物燃料合成方面研究的理想的模式物种之一(Angermayr，S.A.等人，2009)。所以，以集胞藻PCC6803为研究对象开展蓝细菌合成脂肪酸类生物燃料方面的基础研究，对于开发蓝细菌作为新一代能源微生物系统和加快推进生物燃料应用具有重要意义。

本发明人首次成功地在蓝细菌中生产出了脂肪醇。

相关术语

蓝细菌(也称为蓝藻)是一类光合自养的原核微生物，其能够利用太阳能，固定二氧化碳。

脂肪酰辅酶A还原酶(Fatty acyl-CoA reductase)是能够催化由脂肪酰辅酶A转化为脂肪醇的反应的酶。

1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase，Rubisco)催化光合作用中卡尔文循环的第一个反应。它由大小两个亚基组成；在集胞藻PCC6803基因组中，编码这两个亚基的基因位于同一个操纵子。在本发明的实施方案中，将它们的启动子(本发明的实施方案中表示为Prbc)克隆用于驱动脂肪酰辅酶A羧化酶基因在蓝细菌中的表达，其具体序列见SEQ ID NO：3。

质体蓝素(Plastocyanin，PC)是光合作用中将电子由细胞素b6/f复合体传递到光系统I的电子载体，其编码基因为petE。在本发明的实施方案中，将它的启动子(本发明的实施方案中表示为PpetE)克隆用于驱动脂肪酰辅酶A羧化酶基因在蓝细菌中的表达，其具体序列为见SEQ ID NO：5。

slr0168基因是集胞藻PCC6803基因组中编码一个未知功能蛋白的基因。前人的研究证明该基因的缺失对于细胞的生理活动没有影响， 所以该基因所在的位置被认为是集胞藻PCC6803基因组中的一个中性位点(netural site)。本发明的实施方案就是通过在该位点通过同源重组来整合包括启动子以及脂肪酰辅酶A还原酶基因，从而实现在集胞藻PCC6803中表达外源脂肪酰辅酶A还原酶。

在本发明的实施方案中，载体(vector)是指能够将DNA片段(目的基因)转移到受者细胞中的一种自我复制的DNA分子。

“杂交”表示这样一个过程：在该过程中，于合适的条件下，两条核酸序列以稳定且特异的氢键相互结合以致形成双链。这些氢键在互补碱基腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)(或尿嘧啶(U))之间(则这称为A-T键)或在互补碱基鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)之间(则这称为G-C键)形成。两条核酸序列的杂交可以是全部的(则称为互补序列)，即在该杂交过程中获得的双链仅包含A-T键和C-G键。这种杂交可以是部分的(则称为足够互补的序列)，即获得的双链包含允许形成双链的A-T键和C-G键，但还包含未与互补碱基结合的碱基。两条互补序列或足够互补的序列之间的杂交取决于所使用的操作条件，并且特别是严紧性。严紧性特别是根据两条核酸序列的碱基组成来定义，以及通过这两条核酸序列之间的错配程度来定义。严紧性还可以取决于反应参数，例如存在于杂交溶液中的离子种类的浓度和类型，变性剂的性质和浓度，和/或杂交温度。所有这些数据是所熟知的，并且合适的条件可以由本领域技术人员来确定。

如本领域已知的，核酸序列彼此杂交的条件可以被描述为从低到高严紧性的范围。在此处提及低严紧杂交条件时，包括至少大约0％到至少大约15％v/v甲酰胺，以及用于杂交的至少大约1M到至少大约2M的盐，和用于洗涤条件的至少大约1M到至少大约2M的盐。一般地，低严紧杂交条件的温度为大约25-30℃到大约42℃。在此处提及中等严紧杂交条件时，包括至少大约16％v/v到至少大约30％v/v的甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.5M到至少大约0.9M的盐。在此处提及高严紧杂交条件时，包括至少大约31％v/v到至少大约50％v/v的 甲酰胺，以及用于杂交的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐，和用于洗涤条件的至少大约0.01M到至少大约0.15M的盐。一般地，洗涤在下列条件下进行：Tm＝69.3+0.41(G+C)％(Marmur和Doty，J.Mol.Biol.5：109，1962)。但是，每增加1％的错配碱基对数目，双链体DNA的Tm下降1℃(Bonner和Laskey，Eur.J.Biochem.46：83，1974)。在这些杂交条件中甲酰胺是可选的。因此，特别优选的严紧杂交条件如下确定：低严紧杂交条件是6xSSC缓冲液，1.0％w/vSDS，在25-42℃下；中等严紧杂交条件是2xSSC缓冲液，1.0％w/vSDS，在20℃至65℃的温度下；高严紧杂交条件是0.1xSSC缓冲液，0.1％w/v SDS，在至少65℃的温度下。关于核酸的杂交的详尽指导可见于Tijssen，(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第1部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人，编辑(1995)CurrentProtocols in Molecular Biology，第2章(Greene Publishing andWiley-Interscience，New York)。还可参见Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Plainview，New York)。

“同一性”或“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分比是由这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性百分数＝相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)×100)。例如，“同一性百分比”通过下列方式来计算：在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苷酸碱基或相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目(即，窗的大小)，并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行：例如，Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2：482，1970)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：443，1970)的 同源性比对算法；Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施(例如，Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)；或手工比对和目测检查(参见，例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。

本发明的实施方案所涉及的同一性百分比包括至少大约60％，或至少大约65％，或至少大约70％，或至少大约75％，或至少大约80％，或至少大约85％，或至少大约90％，或更高，例如大约95％，或大约96％，或大约97％，或大约98％，或大约99％，例如至少大约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。

本发明的详细描述

本发明的实施方案的一个目的就是要在蓝细菌体内构建一条合成脂肪醇的途径，实现脂肪醇在微生物体内的合成。

本发明的实施方案是利用在蓝细菌中具有活性的启动子驱动脂肪酰辅酶A还原酶在蓝细菌中表达，利用蓝细菌光合生物的特点，吸收太阳能固定二氧化碳，合成脂肪醇作为生物燃料。

本发明的实施方案的一个优点是在光合微生物蓝细菌体内利用太阳能固定二氧化碳合成脂肪醇，合成脂肪醇的能量来自于太阳能，碳源来自于二氧化碳。因此，利用这一技术制备的生物燃料不会受到原料不足的制约，使用这种生物燃料不会增加碳排放，是真正的零排放生物燃料。

在一个方面，本发明的实施方案涉及用于在蓝细菌中合成脂肪醇的构建体，其可以包含有在蓝细菌中具有活性的启动子，以及处于该 启动子控制之下的脂肪酰辅酶A还原酶基因。

进一步地，所述构建体还可以包含有处于所述在蓝细菌中具有活性的启动子上游的用于筛选蓝细菌转化体的标记基因。

进一步地，所述构建体还可以在两端具有集胞藻PCC6803的slr0168基因的N-末端序列和C-末端序列，以用于同源重组。

在优选的实施方案中，所述在蓝细菌中具有活性的启动子可以选自Prbc启动子和PpetE启动子。

在进一步优选的实施方案中，所述脂肪酰辅酶A还原酶基因可以为选自下列的基因：来源于荷荷芭的far基因，其例如显示在SEQ IDNO：1中；和来源于拟南芥的at3g11980基因，其例如显示在SEQ IDNO：2中。所述脂肪酰辅酶A还原酶基因还可以为来源于小鼠的向r1基因(例如参见NCBI ID：BC007178)；密码子经过优化的来源于小鼠的far1基因；来源于小鼠的far2基因(例如参见NCBI ID：BC055759)；或来源于拟南芥的at3g56700基因。其他合适的脂肪酰辅酶A还原酶基因还包括：来自弗兰克氏菌(Frankia sp.)CcI3的Francci3_2276(例如参见NC_007777)；来自嗜根库克菌(Kocuriarhizophila)DC2201的KRH_18580(例如参见NC_010617)；来自海洋放线细菌(Actinobacterium)PHSC20C1的A20C1_04336(例如参见NZ_AAOB01000003)；来自Hahella chejuensis KCTC 2396的HCH_05075(例如参见NC_007645)；来自水油海杆菌(Marinobacteraquaeolei)VT8的Maqu_2220(例如参见NC_008740)；和来自海洋杆菌(Oceanobacter sp.)RED65的RED65_09889(例如参见NZ_AAQH01000001)。另外，在本发明的实施方案中还可以使用与上面所列基因具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更加优选地至少95％同一性，最优选地至少99％同一性，并且编码具有脂肪酰辅酶A还原酶活性的蛋白质的基因；或者与上面所列基因在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下杂交，并且编码具有脂肪酰辅酶A还原酶活性的蛋白质的基因。

在进一步优选的实施方案中，所述标记基因为壮观霉素抗性基因 Omega片段，其例如显示在SEQ ID NO：8中。

在进一步优选的实施方案中，所述蓝细菌为集胞藻PCC6803。

在另一个方面，本发明的实施方案可以涉及载体，其包含上面所定义的构建体。优选地，所述载体选自下列质粒：质粒pXT14，其于2010年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，保藏号为CGMCC 3948，以在大肠杆菌中的形式(Eco-XT14)，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；质粒pXT34，其于2010年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 3950，以在大肠杆菌中的形式(Eco-XT34)，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)；和质粒pXT51，其于2010年6月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 3949，以在大肠杆菌中的形式(Eco-XT51)，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

在另外一个方面，本发明的实施方案可以涉及包含上面所定义的构建体的蓝细菌，或者用上面所定义的载体转化的蓝细菌。优选地，所述蓝细菌选自：于2010年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的集胞藻Syn-XT14，其保藏号为CGMCC3894，分类命名为集胞藻(Synechocystis sp.)；于2010年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的集胞藻Syn-XT34，其保藏号为CGMCC 3895，分类命名为集胞藻(Synechocystis sp.)；和于2010年6月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的集胞藻Syn-XT51，其保藏号为CGMCC 3896，分类命名为集胞藻(Synechocystis sp.)。

在另外一个方面，本发明的实施方案可以涉及在蓝细菌中生产脂肪醇的方法，所述方法包括：在适合于合成脂肪醇的条件下培养权利要求10-12中任一项的蓝细菌；和从所获得的培养物中提取所需的脂肪醇。

通过本发明的实施方案，成功地在蓝细菌中产生了脂肪醇，更确切地说为长链脂肪醇，例如1-十六烷醇和1-十八烷醇。

图1为质粒pFQ9R的基本结构。在集胞藻PCC6803的slr0168基因上下游片段之间有壮观霉素抗性基因Omega片段、Prbc启动子和终止子Trbc；启动子和终止子之间有XbaI和SmaI两个酶切位点。

图2为质粒pXT14的基本结构。其是通过将来源于荷荷芭(Simmondsia chinensis)的far基因(far _jojoba)(SEQ ID NO：1)克隆到质粒pFQ9R中而获得的。

图3为质粒pXT37a的基本结构。在集胞藻PCC6803的slr0168基因上下游片段之间有壮观霉素抗性基因Omega片段、PpetE启动子和lacZ基因；在lacZ基因两端有NdeI和EcoRI两个酶切位点。

图4为质粒pXT37b的基本结构。pXT37b与pXT37a类似，只是由Omega片段、PpetE启动子和lacZ基因组成的片段的插入方向与pXT37a相反。

图5为质粒pXT34的基本结构。其是通过将来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的at3g11980基因(SEQ ID NO：2)克隆到质粒pXT37a中而获得的，其中所述at3g11980基因位于PpetE启动子的下游。

图6为质粒pXT51的基本结构。其是通过将来源于荷荷芭的far基因(far_jojoba)(SEQ ID NO：1)克隆到质粒pXT37b中而获得的，其中所述far基因位于PpetE启动子的下游。

图7为质粒pLY2的基本结构。其是通过在集胞藻PCC6803的slr0168基因上下游片段之间插入壮观霉素抗性基因Omega片段，并将整个构建物克隆到pUC9载体上而获得的。

图8为基因工程藻株Syn-LY2在培养8天后，其细胞中脂肪醇的生产情况(气质联用检测结果)。其中，C15-OH表示1-十五烷醇(用作内标)；C16-OH表示1-十六烷醇；C18-OH表示1-十八烷醇。

图9为基因工程藻株Syn-XT14在培养8天后，其细胞中脂肪醇的生产情况(气质联用检测结果)。其中，C15-OH表示1-十五烷醇(用作内标)；C16-OH表示1-十六烷醇；C18-OH表示1-十八烷醇。

图10为基因工程藻株Syn-XT34在培养8天后，其细胞中脂肪醇 的生产情况(气质联用检测结果)。其中，C15-OH表示1-十五烷醇(用作内标)；C16-OH表示1-十六烷醇；C18-OH表示1-十八烷醇。

图11为基因工程藻株Syn-XT51在培养8天后，其细胞中脂肪醇的生产情况(气质联用检测结果)。其中，C15-OH表示1-十五烷醇(用作内标)；C16-OH表示1-十六烷醇；C18-OH表示1-十八烷醇。

图12为柱式光反应器培养基因工程藻株的实物照片。序列表信息：

SEQ ID NO：1：来源于荷荷芭(Simmondsia chinensis)的脂肪酰辅酶A还原酶基因序列(人工合成基因)。

SEQ ID NO：2：根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)的at3g11980基因序列人工合成的序列。

SEQ ID NO：3：来源于集胞藻PCC6803的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因rbcL上游的启动子片段Prbc的序列(NCBI ID：NC_000911)。

SEQ ID NO：4：来源于集胞藻PCC6803的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶操纵子下游的终止子片段Trbc的序列(NCBI ID：NC_000911)。

SEQ ID NO：5：来源于集胞藻PCC6803的质体蓝素基因petE基因上游的启动子片段PpetE的序列(NCBI ID：NC_000911)。

SEQ ID NO：6：来源于集胞藻PCC6803的slr0168基因的N-末端序列(也包括一部分基因上游序列)(NCBI ID：NC_000911)。

SEQ ID NO：7：来源于集胞藻PCC6803的slr0168基因的C-末端序列(也包括一部分基因下游序列)(NCBI ID：NC_000911)。

SEQ ID NO：8：质粒pRL57上克隆的Omega片段序列(NCBI ID：L05082)。

SEQ ID NO：9：质粒pHB1567上克隆的lacZ基因序列(NCBI ID：AP009048)。

SEQ ID NO：10：引物alr1524-1的序列。

SEQ ID NO：11：引物alr1524-2的序列。

SEQ ID NO：12：引物P1的序列。

SEQ ID NO：13：引物P2的序列。

SEQ ID NO：14：引物P3的序列。

SEQ ID NO：15：引物P4的序列。

SEQ ID NO：16：引物XP-1的序列。

SEQ ID NO：17：引物XP-2的序列。

SEQ ID NO：18：引物XP-3的序列。

SEQ ID NO：19：引物XP-4的序列。

SEQ ID NO：20：引物lacZ-m1的序列。

SEQ ID NO：21：引物lacZ-m2的序列。

SEQ ID NO：22：引物lacZ-m3的序列。

SEQ ID NO：23：引物M13-Rev的序列。

SEQ ID NO：24：引物far-1的序列。

SEQ ID NO：25：引物far-2的序列。

实施例1：构建用于转化蓝细菌的载体

1、质粒pFQ9R的构建

以alr1524-1(5’-ACCTCCAGCCATTAGCGAAAC-3’)和alr1524-2(5’-CTCTCACAATTGCCCTACCT-3’)为引物对，以鱼腥藻PCC7120基因组为模板进行PCR，并将PCR产物克隆到pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D101A)中，从而得到质粒pQL1。用DraI(Takara，Catalog No.：D1037A)酶切质粒pRL57(Cai Y.等人，1990)，回收约1.9kb的Omega片段。将质粒pQL1经PstI(Takara，CatalogNo.：D1073A)酶切，T4 DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0061)补平。将两片段相连得到质粒pQL4。以P1(5’- GCGTCGACTCACCATTTGGACAAAACATCAGG-3’)和P2(5’-GCTCTAGACATCTAGGTCAGTCCTCCATAAACATTG-3’)为引物对，以集胞藻PCC6803基因组为模板进行PCR，将PCR片段克隆到pMD18-T载体中，得到质粒pFQ1；以P3(5’-CCCCCGGGGTTACAGTTTTGGCAATTACT -3’)和P4(5’-CGAGCTCTTCCCCACTTAGATAAAAAATCCG-3’)为引物对，以集胞藻PCC6803基因组为模板进行PCR，将PCR产物克隆到pMD18-T载体中，得到质粒pFQ2。以SalI(Takara，Catalog No.：D1080A)和XbaI(Takara，Catalog No.：D1093A)从质粒pFQ1上切下Prbc片段；以XmaI(New England BioLabs，Catalog No.：R0180S)和SacI(Takara，Catalog No.：D1078A)从质粒pFQ2上切下Trbc片段；将Prbc和Trbc插入到质粒pQL4的相应位点，得到质粒pFQ6。质粒pKW1188(Williams J.G.K.，1988)经EcoRI酶切自连，再经XmaI酶切补平，再自连得到质粒pKW1188SL。以HindIII(Takara，Catalog No.：D1060A)和EcoRI(Takara，Catalog No.：D1040A)酶切质粒pFQ6，回收Omega+Prbc+Trbc片段；以EcoRI酶切质粒pKW1188SL；将两个片段连接得到质粒pFQ9R。

2、质粒pXT37a和pXT37b的构建

质粒pHB1567(高宏等人，2007)经XbaI酶切，回收5.4kb片段，自连得到质粒pXT24。质粒pXT24经NdeI(Takara，Catalog No.：D1161A)酶切，T4 DNA聚合酶补平，自连；再经EcoRI酶切，T4 DNA聚合酶补平，自连得到质粒pXT24a。以质粒pHB1536(高宏等人，2007)为模板，分别以XP-1(5’-AGTGGTTCGCATCCTCGG-3’)和XP-2(5’-ATGAATCCTTAATCGGTACCAAATAAAAAAGGGGACCTCTAGG-3’)以及XP-3(5’-CCCTTTTTTATTTGGTACCGATTAAGGATTCATAGCGGTTGCC-3’)和XP-4(5′-CCAGTGAATCCGTAATCATGGT-3′)为引物对进行PCR，PCR产物回收后，经变性、退火和延伸；再以其为模板，以XP-1和XP-4为引物对进行PCR，将PCR产物克隆到pMD18-T载体中，得到质粒pQL17。 质粒pQL17经BglII(Takara，Catalog No.：D1021S)和SphI(Takara，Catalog No.：D1180A)酶切，回收片段与经相同酶切的pHB1536相连接，得到质粒pQL18。质粒pQL18经XbaI酶切，回收Omega+PpetE+lacZ片段，插入到质粒pXT24a的相同位点，得到质粒pXT36a。以质粒pHB1567为模板，分别以lacZ-m1(5’-ATGGTCAGGTCATGGATGAGCA-3’)和lacZ-m2(5’-AATCCCCATGTGGAAACCGT-3’)以及lacZ-m3(5’-ACGGTTTCCACATGGGGATT-3’)和M13-Rev(5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’)为引物对进行PCR，PCR产物回收后，经变性、退火和延伸；再以其为模板，以lacZ-m1和M13-Rev为引物对进行PCR，PCR产物克隆到pMD18-T载体中，得到质粒pXT30。质粒pXT30经EcoRI和EcoRV酶切，回收片段与经相同酶切的pXT36a相连，得到质粒pXT37b。质粒pXT37b经XbaI酶切，两片段回收后，自连筛选得到与pXT37b插入方向相反的质粒pXT37a。

3、质粒pLY2的构建

质粒pRL57经DraI酶切，回收Omega片段；质粒pKW1188SL经EcoRI酶切后，补平，回收片段；两片段连接得到质粒pLY2。该质粒用作对照质粒。

4、质粒pXT14的构建

以质粒pXL66(Standford大学Chaitan Khosla教授馈赠)为模板，以far-1(5’-GGGTCTAGAATGGAAGAGATGGGC AGCATC-3’)和far-2(5’-AAACCCGGGATCAATTCAGGACATGTTCCACGA-3’)为引物对进行PCR，PCR产物回收后经XbaI和SmaI酶切，克隆到质粒pFQ9R的相同位点，从而得到质粒pXT14。

5、质粒pXT51的构建

质粒pXL66经NdeI和XhoI酶切，回收荷荷芭的far基因片段，插入到质粒pXT37b的相同位点，得到质粒pXT51。

6、质粒pXT34的构建

按照SEQ ID No：2的序列，合成拟南芥的at3g11980基因，并克隆在质粒pUC57上(合成由上海生工生物工程有限公司完成)，得到质粒pXT31。质粒pHB1567经过EcoRI和XhoI酶切，回收5.4kb的片段；质粒pHB1536经过XhoI和NdeI酶切，回收2.4kb的片段；质粒pXT31经过NdeI+EcoRI酶切，回收at3g11980片段；以上三片段连接，得到质粒pXT34。

实施例2：蓝细菌的转化以及转化体的筛选

1、取处于对数生长期(OD730约为0.5～1.0)的藻细胞10mL，离心收集细胞；并用新鲜的BG11培养基洗涤细胞两次，再将细胞重悬于1mL BG11培养基(1.5g L-1NaNO3，40mg L-1K2HPO4·3H2O，36mg L-1 CaCl2·2H2O，6mg L-1柠檬酸，6mg L-1柠檬酸铁铵，1mg L-1EDTA二钠盐，20mg L-1 NaCO3，2.9mg L-1 H3BO3，1.8mg L-1MnCl2·4H2O，0.22mg L-1 ZnSO4·7H2O，0.39mg L-1 NaMoO4·2H2O，0.079mg L-1 CuSO4·5H2O和0.01mg L-1 CoCl2·6H2O)中。

2、取0.2mL细胞悬液于新的EP管中，加入2～3μg表1中所列的表达质粒，混匀，并置于30℃、30μE m-2s-1光照条件下温育5小时。

3、将藻细胞与DNA的混合物涂布于铺在BG11平板(未加抗生素)上的硝酸纤维素膜上，并置于30℃、30μE m-2s-1光照条件下培养24小时。然后，将硝酸纤维素膜转移到含有10μgmL-1壮观霉素的BG11平板上，并在30℃、30μE m-2s-1的条件下继续培养。

4、大约5～7天，将转化子从平板上挑出，在新鲜的BG11平板(补加20μg mL-1壮观霉素)划线；待细胞富集后，再将它们接入到液体BG11(含20μg mL-1壮观霉素)培养基中培养。

5、细胞在液体培养基中转接两次后，就可以用于检测脂肪醇的产量。

实施例3：用经基因工程改造的蓝细菌生产脂肪醇

1、实验步骤：

(1)培养方式一：摇瓶培养。普通500毫升三角烧瓶，装300mL液体BG11培养基(含20μg mL-1壮观霉素)，初始接种浓度OD730 为0.05，在30℃、30μE m-2s-1光照条件下，通空气培养7～8天。

培养方式二：柱式光反应器培养。普通玻璃管，柱高575mm，直径50mm，装液量500mL(可装约1L)。初始接种浓度OD730为0.5，在30℃、100μE m-2s-1光照条件下，通含5％CO2的空气进行培养。

(2)取200mL培养液，离心收集藻细胞，用10mL TE(pH8.0)缓冲液重悬细胞，超声破碎细胞；

(3)向细胞破碎液中，加入40μg十五烷醇作为内标，加入等体积的氯仿：甲醇溶液(v/v 2∶1)，混匀，室温静置半小时；

(4)3,000g低速离心5分钟，回收有机相，于55℃氮气吹干；

(5)加入1mL正己烷溶解沉淀物，用0.45μm滤膜过滤后即可进行GC-MS分析。

2、实验结果：

我们分别在三株基因工程蓝细菌Syn-XT14、Syn-XT34和Syn-XT51中检测到了十六烷醇和十八烷醇。通过参照内标(十五烷醇)，计算得到在普通摇瓶培养条件下细胞内脂肪醇的总产量如表2所示。在柱式光反应器培养条件的结果也验证了这3株基因工程蓝细菌的脂肪醇合成能力。

这一结果显示，通过基因工程改造的蓝细菌Syn-XT14、Syn-XT34和Syn-XT51能产生脂肪醇，而且这种生产脂肪醇的过程能够小规模放大。

本领域技术人员将会意识到，可以对如具体实施方案中所示的本发明进行众多改变和/或修饰，而不背离如广泛描述的本发明的精神或范围。因此，这些实施方案在所有方面被视为举例说明性的而非限制性的。

生物材料样品保藏信息

菌株 保藏号 保藏时间

蓝细菌Syn-XT14 CGMCC 3894 2010年6月10日

蓝细菌Syn-XT34 CGMCC 3895 2010年6月10日

蓝细菌Syn-XT51 CGMCC 3896 2010年6月10日

大肠杆菌Eco-XT14，其包含质粒pXT14 CGMCC 3948 2010年6月28日

大肠杆菌Eco-XT34，其包含质粒pXT34 CGMCC 3950 2010年6月28日

大肠杆菌Eco-XT51，其包含质粒pXT51 CGMCC 3949 2010年6月28日

上述菌株均保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)

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