女性早发性卵巢功能不全易感基因检测模型及检测试剂盒

本申请涉及女性早发性卵巢功能不全检测领域，特别是涉及一种女性早发性卵巢功能不全易感基因检测模型及检测试剂盒。

早发性卵巢功能不全(Premature Ovarian Insufficiency，POI)既往成为卵巢早衰，是指女性在40岁之前卵巢储备耗竭，特点是原发或继发性闭经，伴随血促性腺激素的升高和雌激素水平的降低，并出现一系列低雌激素症状。目前，POI在全球发病率约1-3％，在我国累及约500万育龄女性。POI在隐匿期无临床表现，但生育力已开始下降，一旦出现月经紊乱，生育力几乎丧失。在上，目前以激素替代为主，卵巢移植、基因、干细胞等方法现仍处于研究阶段，极个别应用于临床，但方法尚不成熟，最终完成生育任务通常只能依靠供卵辅助生殖技术。POI严重影响女性的生理、心理及生殖健康，极大的威胁家庭的和谐稳定。

已知POI的病因包括：遗传、免疫、代谢、医源性及环境等。遗传因素是POI的重要致病原因，占20～25％，其中，染体数目及结构异常占10～13％，其余更多发生在单基因水平。探索POI发生的遗传学病因，可为POI的早期诊断及干预提供科学理论依据及靶点，具有重要的临床意义。近年来随着分子生物学和遗传学的不断发展，对POI致病基因的研究日渐深入，国内外已经研究发现了一些与POI相关的基因和基因突变，但由于POI遗传学病因的高度异质性，目前所知的POI易感基因远远不足以筛查出所有的POI患者，对POI的易感致病基因的挖掘探索工作量仍巨大。现有的为数不多的POI致病基因诊断包远远不足以筛查所有的POI患者，需不断进行更新及拓展。

本申请的目的是提供一种新的特别针对中国女性的早发性卵巢功能不全易感基因检测模型及检测试剂盒。

本申请采用了以下技术方案：

本发明一方面公开了中国汉族女性POI易感基因模型，由SCUBE1、GPSM1、CNN2和PSPH的9个SNP位点组成。

需要说明的是，本发明的基因检测模型是针对现有中国汉族女性POI研究对象而研发的，特别适用于中国女性的POI检测的基因模型；通过对本发明基因模型的4个基因的9个SNP位点进行检测，可以筛查出中国汉族女性中发生POI的高风险人，用于中国女性POI的前期诊断筛选。

本发明另一面公开了本发明的中国女性POI易感基因检测模型在制备POI检测试剂中的应用。

可以理解，本发明的基因模型可以用于中国汉族女性的POI检测和判断，因此，在发明基因模型的基础上，可以研发检测4个基因的9个SNP位点的引物或探针；因此，本发明创造性地提出了本发明的基因模型在制备早发性卵巢功能不全检测试剂中的应用。

本发明再一方面公开了一种用于检测中国汉族女性POI的试剂，该试剂包括扩增本发明的中国女性POI易感基因检测模型中的9个SNP位点的引物组。

优选的，因为由Seq ID No.1至Seq ID No.8所示序列的引物构成，其中，Seq IDNo.1和Seq ID No.2所示序列为第一组引物，用于对SCUBE1的SNP位点进行扩增，Seq IDNo.3和Seq ID No.4所示序列为第二组引物，用于GPSM1的SNP位点进行扩增，Seq ID No.5和Seq ID No.6所示序列为第三组引物，用于CNN2的6个SNP位点进行扩增，Seq ID No.7和Seq ID No.8所示序列为第四组引物，用于PSPH的SNP位点进行扩增。

可以理解，Seq ID No.1至Seq ID No.8所示序列的引物只是本发明一种实现方式中具体采用的引物，不排除还可以采用其他引物用于对4个基因的9个SNP位点进行PCR扩增。当然，在本发明引物组的基础上，在不影响SNP位点扩增的情况下，可以在本申请引物的基础上进行若干碱基的增加或删减。

本发明再一面公开了一种含有本发明的试剂的中国女性POI易感基因检测试剂盒。

优选的，本发明的试剂盒中还含有用于进行DNA抽提、PCR扩增、限制性内切酶酶切和琼脂糖凝胶电泳中的至少一种操作试剂。

可以理解，为了方便使用，完全可以将本发明的试剂与现有的其他试剂，例如DNA抽提试剂、PCR扩增试剂、限制性内切酶酶切试剂和琼脂糖凝胶电泳试剂等，组合在一起，作为一个试剂盒使用；当然，试剂盒中还可以包含其他便于4个基因的9个SNP位点检测的试剂，在此不作具体限定。

本申请的有益效果在于：

本发明首创性的建立了特别针对中国女性POI的基因检测模型和检测试剂盒，具有种族特异性，是对现有POI诊断试剂盒的基因突变检测位点的更新和拓展，欲筛查出更多的POI患病高危人，在发病之前或发病早期即进行干预，保障女性的生殖健康。本发明基于发明人前期对早POI致病基因的筛查工作，创造性地建立了针对中国汉族女性POI的4个易感基因SCUBE1、GPSM1、CNN2和PSPH的9个SNP位点的检测模型，根据该基因模型研发的检测试剂和试剂盒，能够对中国女性的POI进行准确、灵敏和特异的检测；为中国女性POI的检测提供了一种新途径和方案。

图1是本申请实施例中部分PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图。

本发明是一种中国汉族女性早发性卵巢功能不全易感基因检测模型及检测试剂盒，该检测模型由SCUBE1、GPSM1、CNN2和PSPH 4个基因的9个SNP位点组成，根据基因检测模型研发的检测试剂和试剂盒，能够对早发性卵巢功能不全进行准确、灵敏和特异的检测，为中国汉族女性早发性卵巢功能不全检测提供一种新途径和方案。

下面通过具体实施例对本申请进行详细说明。以下实施例仅用于对本申请进行说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例一以下实施例仅用于对本申请进行说明，不应理解为对本申请的限制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象

(1)早发性卵巢功能不全病例组：取样自2014年至2019年期间南方医科大学珠江医院妇科门诊的192例早发性卵巢功能不全患者。

(2)正常对照组：同期来自南方医科大学珠江医院的192名健康志愿者。入选标准：本人及三代以内直系亲属中无早发性卵巢功能不全史、无卵巢癌等与卵巢相关的疾病。

以上两组均采样自中国汉族女性，且相互间无亲缘关系。

1.1.2主要试剂

1.1.2.1 DNA提取试剂

基因组DNA提取采用购自QIAGEN的血液基因组DNA提取试剂盒。

1.1.2.2 PCR反应试剂

(1)TaKaRa Ex Taq Hot Start Version：购自宝生物工程(大连)有限公司，内含TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、10×Ex Taq缓冲液(含Mg2+)、dNTP混合液(dATP、dTTP、dGTP和dCTP各2.5mM)，-20℃保存。

(2)金牌Taq酶：购自美国应用生物系统公司，内含金牌Taq酶，10×金牌Taq酶HS缓冲液，Mg2+(50mmol/L)。

(3)Q-solution：购自吉泰生物科技有限公司，-20℃保存。

1.1.2.3琼脂糖凝胶电泳试剂

(1)10×TBE缓冲液：1L缓冲液中含Tris碱108克、硼酸55克、0.5×MDTA 40mL(pH8.0)，室温保存。

(2)电泳上样缓冲液：6×Loading Buffer和10×Loading Buffer均购自宝生物工程(大连)有限公司，室温保存。

(3)10mg/mL溴化乙锭：终浓度为0.5μg/mL，室温保存。

(4)Marker：购自天根生化科技(北京)有限公司，4℃保存。

1.1.2.4限制性内切酶

(1)BstUI和NEBuffer2缓冲液：购自New England BioLabs Inc.。

(2)BsaAI和NEBuffer3缓冲液：购自New England BioLabs Inc.。

(3)AluI和NEBuffer 4缓冲液：购自New England BioLabs Inc.。

(4)BsmFI和NEBuffer4+BSA缓冲液体系：购自New England BioLabsInc.。

(5)BfuI和NEBuffer4缓冲液：购自New England BioLabs Inc.。

(6)AlwnI和NEBuffer4缓冲液：购自New England BioLabs Inc.。

(7)NcoI和10×Buffer TangoTM缓冲液：购自MBI Fermentas公司。

(8)BseⅪ和10×Buffer BseXI缓冲液：购自MBI Fermentas公司。

(9)Tru9I和NEBuffer4+BSA缓冲液体系：购自New England BioLabsInc.。

(10)XmnI和NEBuffer2+BSA缓冲液体系：购自New England BioLabsInc.。

(11)Eco81I和10×Buffer TangoTM缓冲液：购自MBI Fermentas公司。

(12)Sau96I和NEBuffer 4缓冲液：购自New England BioLabs Inc.。

(13)RsaI和NEBuffer 1缓冲液：购自New England BioLabs Inc.。

(14)MnlI和10×BufferG+10×Buffer TangoTM体系：购自MBIFermentas。

1.1.3主要仪器

(1)TP600型梯度PCR仪(日本TaKaRa公司)。

(2)4-15型大容量离心机(德国SIGMA公司)。

(3)TGL-16G型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

(4)FR-980型生物电泳图像分析系统(上海复日科技有限公司)。

(5)UV-254型暗箱式紫外透射仪(北京鼎国生物技术有限责任公司)。

(6)PowerBC 3002SI型数控电泳仪(上海申能生物科技有限公司)。

(7)DYCP-32A型琼脂糖水平电泳槽(北京市六一仪器厂)。

(8)HE-90水平槽制胶器(上海天能科技有限公司)。

(9)DK-8D型电热恒温水槽(上海精宏试验设备有限公司)。

(10)P7021TP-6型格兰仕微波炉(佛山顺德区格兰仕微波炉电器有限公司)。

(11)JT10001型电子天平(上海精天电子仪器有限公司)。

(12)QL-901型涡旋器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

(13)手动可调式移液器(大龙医疗设备有限公司)。

1.2方法

1.2.1样本采集和DNA提取

1)根据知情同意原则，采集患者和健康志愿者的外周血，EDTA抗凝，-80℃保存备用。

2)使用血液基因组DNA提取试剂盒进行DNA抽提。全程佩戴一次性手套和口罩，避免交叉污染。所用一次性物品，如头、离屯、管等均需同压灭菌。

3)在1.5mL离心管中依次加入20mL蛋白酶K和200mL抗凝血，祸旋震荡，充分混匀，短暂离心。

4)加入200mL无水乙醇，充分振荡混匀，短暂离心后转移到纯化柱中，13200rpm离心1min，弃过滤液和收集管。

5)漂洗液Buffer AW1、Buffer AW2使用前加入无水乙醇，配置成工作液。将纯化柱放置到一个新的收集管中，加入500mL的Buffer AW1，13200rpm离心1min，弃过滤液。

6)将纯化柱放回收集管中，加入500mL的Buffer AW2，13200rpm离心3min，弃过滤液和收集管。

7)将纯化柱放入新收集管中，13200rpm离心1min，弃过滤液和收集管

8)将纯化柱置入新1.5mL离心管中，室温放置15ming，使吸附膜中残余的漂洗液尽量蒸发干净。

9)向纯化柱中加入200mL的Buffer AE(68℃预热)，室温放置5-10min，13200rpm离心2min，所得滤液即为基因组DNA。

所有DNA样品纯度均符合以下标准：A260/A280在1.7-2.0之间；A260/A230大于1.5；琼脂糖凝胶电泳检测主带大于20K，且无明显降解。DNA样品浓度不低于50ng/mL，每个样品总DNA量不小于6mg。基因组DNA置-20℃保存。

1.2.2 SNP位点的选择及引物的设计与合成

本例针对SCUBE1、GPSM1、CNN2和PSPH基因的9个SNP位点设计了特异性扩增引物。SNP位点信息如表1所示，设计的特异性扩增引物如表2所示。引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1待测SNP位点信息

表2 SNP位点特异性扩增引物

表2中，“Seq ID No.”中有两个编号依序为F端引物和R端引物的序列编号，例如“1、2”即SCUBE1的F端引物为Seq ID No.1，R端引物为Seq ID No.2，其余的“Seq ID No.”编号以此类推。

1.2.3 PCR扩增

本例采用HotStart PCR

(1)HotStart PCR反应体系：反应总体积为10μL，内含

(2)HotStart PCR扩增反应条件：

95℃5min

然后进入40个循环：95℃30s、退火温度45s、72℃1min

循环结束后72℃10min

4℃待机

其中，退火温度本例采用的是每对引物的Tm值-5℃的温度。

1.2.4 PCR产物检测

PCR扩增反应结束后，取PCR产物5μL与1μL电泳上样缓冲液混匀后在2.0％(w/v)的琼脂糖凝胶上电泳，琼脂糖凝胶在制备过程中已加入终浓度为0.5μg/mL的溴化乙锭，按5V/cm的电压在0.5×TBE缓冲液中电泳；电泳结束后在FR-980型生物电泳图像分析系统上进行凝胶拍照，分析PCR扩增情况(如图1所示)。

1.2.5限制性片段长度多态性分析

酶切反应体系：反应体系体积为10μL，内含：PCR产物5μL、10×Buffer缓冲体系1μL、限制性内切酶0.5U、ddH2O补足至总体积10μL。其中，对于BamHI、EcoRI和HindII三种限制性内切酶，还需要添加100×BSA 0.1μL。三种内切酶的识别序列如表3所示。

表3内切酶及其识别序列

内切酶 识别序列 BamHI G↓GATCC EcoRI C↓AATTC HindII GTY↓RAC

酶切反应条件：酶切反应温度按照所采用的限制性内切酶的最佳反应温度，反应时间均为16小时。

1.2.6酶切产物检测

取每管酶切产物5μL与1μL电泳上样缓冲液混匀后在4.0％(w/v)的琼脂糖凝胶上电泳，琼脂糖凝胶在制备过程中已加入终浓度为0.5μg/mL的溴化乙锭，按2V/cm的电压在0.5×TBE缓冲液中电泳；电泳结束后在FR-980型生物电泳图像分析系统上进行凝胶拍照，记录结果，显示PCR扩增产物的酶切结果也与预期的相符。。

1.2.7统计学分析

1.2.7.1基因型频率和等位基因频率计算

(1)基因型频率的计算：A，a分别代表两种等位基因，N代表例数

AA频率＝NAA/(NAA+NAa+Naa)

Aa频率＝NAa/(NAA+NAa+Naa)

aa频率＝Naa/(NAA+NAa+Naa)

(2)等位基因频率的计算：A，a分别代表两种等位基因，N代表例数

A频率＝(NAA+1/2NAa)/(NAA+NAa+Naa)

a频率＝(Naa+1/2NAa)/(NAA+NAa+Naa)

1.2.7.2 Hardy-Weinberg平衡吻合度检验

根据Hardy-Weinberg平衡定律计算各SNP位点在早发性卵巢功能不全组和对照组中的预期基因型频率，应用SPSS11.0统计软件进行卡方检验比较观察到的基因型频率与预期基因型频率间的差异，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。确定选取的早发性卵巢功能不全组与对照组在所研究的各个SNP位点均处于遗传平衡状态，具有体代表性。

1.2.7.3分布差异统计学分析

基因型、等位基因和基因型组合的分布差异统计学分析应用SPSS11.0统计软件进行卡方检验以分析各SNP位点在早发性卵巢功能不全组与对照组间的基因型、等位基因和基因型组合频率差异，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。若某SNP位点的基因型及等位基因频率在组间具有统计学差异，说明该多态位点与早发性卵巢功能不全具有相关性，反之则与早发性卵巢功能不全无相关性。

1.2.7.4多个SNP位点的高阶交互作用分析

应用MDR 2.0beta软件进行多个SNP位点的高阶交互作用分析，建立早发性卵巢功能不全检测模型。MDR软件程序包是基于Java程序编写的源代码开放的免费软件，可在http://www.epistasis.org/mdr.html免费下载，在多种操作系统下均可进行MDR分析。先安装Java 2 Runtime Environment，可在http://www.java/免费下载，Windows操作系统下直接点击mdr.jar文件运行程序。

实施例二

本例说明了实施例一构建的中国女性早发性卵巢功能不全易感基因检测模型进行临床应用的方案。具体的，采用南方医科大学珠江医院采集的中国女性病例和对照各192例作为研究对象，就4个基因的9个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点进行基因分型，采用研究多个SNP位点相互关联关系的主流统计学方法，即多因子降维法(multifactor dimensionality reduction，MDR)进行统计分析，初步建立了由SCUBE1、GPSM1、CNN2和PSPH 4个基因的SNP位点组成的中国女性早发性卵巢功能不全易感基因检测模型，其具有良好的早发性卵巢功能不全检测效能，OR＝345.3478，P值＜0.0001，准确度92.97％，灵敏度97.92％，特异度88.02％。中国女性早发性卵巢功能不全易感基因检测模型的建立在国内尚属首次，具有创新性；与国外类似研究相比较，具有种族特异性。MDR所创建的是区分高危、低危个体的理想的判别分类模型，该模型显示9个SNP位点形成的所有基因型组合的早发性卵巢功能不全易感性分类，包括易感型和非易感型。检测模型的确立，将有助于判别早发性卵巢功能不全，及早进行干预，防患于未然，对有效降低早发性卵巢功能不全患病率具有积极意义。现将中国女性早发性卵巢功能不全易感基因检测模型的临床应用简介如下：

1、针对所构建的中国女性早发性卵巢功能不全易感基因检测模型，开发4个基因检测的试剂盒。该试剂盒由4个盒组成，每小盒分别对应9个SNP位点模型中的一个SNP位点进行基因分型。每小盒内装DNA抽提、PCR扩增、限制性内切酶酶切以及琼脂糖凝胶电泳四步骤的相关试剂。

2、该检测试剂盒的适用对象为散布在社区的潜在早发性卵巢功能不全患者，即那些具有个人或家族过敏史，但尚无早发性卵巢功能不全者，这些潜在患者在一定条件下就可能发为早发性卵巢功能不全。国外提出早发性卵巢功能不全三级预防的概念，其中一级预防就是在疾病尚未发生时就采取积极有为的措施，如改变高危人的生活环境、饮食习惯等，防止早发性卵巢功能不全的发生。我们可以采用中国女性早发性卵巢功能不全易感基因检测试剂盒对那些潜在患者进行早期筛查，确定早发性卵巢功能不全高危人，对其有针对性地采取诸如避免过敏原等措施，防患于未然，有效降低早发性卵巢功能不全患病率，节约大量资源。

3、检测步骤：(1)采集被检者的外周血；(2)提取外周血基因组DNA；(3)对特异性DNA片段进行PCR扩增；(4)采用琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物；(5)对PCR产物进行限制性内切酶酶切反应；(6)采用琼脂糖凝胶电泳方法检测酶切反应产物，确定基因型；(7)获得9个SNP位点的基因型；(8)根据9个位点的基因型结果，判别早发性卵巢功能不全易感性分类，即确定该被检者是早发性卵巢功能不全高危还是低危；(9)对早发性卵巢功能不全高危者及其家庭进行早发性卵巢功能不全教育和管理。

以上内容是结合具体实施方式对本申请所作的详细说明，不能认定本申请的实现方式只局限于这些说明。对于本申请技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请基本发明构思的前提下，还可以进行若干简单推演或替换。

序列表

<110> 王雪峰

<120> 女性早发性卵巢功能不全易感基因检测模型及检测试剂盒

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcagccata ccccaacagc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcttccagat gtggacgagt 20

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgcgaatca cccacagc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtccacccgc tgctcgtc 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctccacccct ccttcctctc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcgggcata gaaaccacaa 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgctcttgg gaggatgtgc 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggggcagta aggcatgtta 20