一株耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌及其选育方法和应用

本发明涉及工业微生物发酵工程的技术领域，尤其涉及一株耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌及其选育方法和应用。

丁二酸(Succinic acid)，又称琥珀酸(butanedioic acid)，是一种重要的C4平台化合物，广泛应用于化工、食品、医药等领域。作为一种重要的有机化工原料及中间体，可以转化为富马酸、1，4-丁二醇(BOD)、四氢呋喃(THF)等，同时也是合成聚丁二醇丁二酸酯(PBS)、聚乙二醇丁二酸酯(PES)、聚丙二醇丁二酸酯(PPS)及PBS与己二酸共聚的PBSA等可生物降解高分子材料的原料，具有广阔的应用前景。

目前生产丁二酸的方法主要有三种：化学法、生物转化法、发酵法。商品化的丁二酸主要以石油等资源为原料由化学法合成，但存在生产工艺复杂、污染严重等一系列问题，严重抑制了其发展的潜力。随着石油资源日益枯竭以及环境污染日益严重等问题出现，化学法合成受到限制。与化学合成法相比，微生物发酵法具有以下优点：(1)原料价格低廉、为可再生的生物质资源；(2)发酵过程中可吸收大量CO2，绿环保；(3)发酵条件温和。因此，微生物发酵法近年来备受瞩目，成为近年来国内外的研究热点。

在自然界中有多种厌氧菌和兼性厌氧菌可利用各种糖类物质发酵合成丁二酸，琥珀酸放线杆菌(A.succinogenes)具有将戊糖和己糖转化为丁二酸的天然能力，使其成为目前最具工业化潜力的丁二酸生产菌株之一。

目前已经投产或正在建设的生物基丁二酸工业化项目基本以玉米或大麦等粮食作为主要原料，过度依赖粮食会影响国家的粮食安全，丁二酸属于大宗化学品，在丁二酸发酵生产制备的过程中，原料成本占有极其重的比例，所以使用价格低廉的非粮原料进行丁二酸发酵是降低丁二酸生产成本及实现产业化的关键。非粮生物质资源包括非食用的淀粉类和糖类作物、不可食用的糖蜜和乳清、农林畜牧业废弃物以及生活和工业生产产生的有机废弃物。木质纤维素为世界最大的可再生资源，可以将其中的纤维素(由葡萄糖构成)和半纤维素(主要由木糖构成)转化为单糖，用作微生物发酵生产丁二酸的碳源。

虽然已有较多关于琥珀酸放线杆菌利用木质纤维素的报道，但主要集中在原料的预处理，脱毒和发酵工艺优化方面。由于木质纤维素结构的复杂性，必须经过一系列预处理以后才能够被微生物高效利用，预处理过程中会产生一定量的发酵抑制物(呋喃醛类、弱酸类、酚类等)。呋喃醛类抑制物主要指糠醛和5-羟甲基糠醛(HMF)，与其他抑制物相比，呋喃醛类抑制物含量较高、毒性较强，且能够与其他抑制物形成协同抑制作用，是近年来抑制物研究的热点。二者会影响细胞糖酵解及生物合成途径关键酶的活性，破坏细胞膜组分及通透性，严重影响微生物的生长和降低发酵过程中葡萄糖和木糖的转化率。

在实际应用中，虽然生物质水解液脱毒等措施能减缓五羟甲基糠醛对发酵微生物的抑制作用，但这些方法只能去除或降低其中部分的抑制剂，且操作繁琐，成本高，不利于其大规模工业化应用。另外，有些脱毒过程还会污染环境。因此，增加发酵微生物的抗逆性和在胁迫环境下的生产效率极为必要，对木质纤维高效转化丁二酸具有重要的意义。

本发明的目的在于提供一株耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌，用于在含有高浓度五羟甲基糠醛的培养基中生产丁二酸。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌，拉丁文为Actinobacillus succinogenes GXAS-137HFM，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年8月10日，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211004。

本发明还提供了一种耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌的选育方法，将初始菌株接种到含五羟甲基糠醛的发酵培养基中驯化得到。

优选的，所述初始菌株为产琥珀酸放线杆菌GXAS-137FM，拉丁文名称为Actinobacillus succinogenes GXAS-137FM，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年10月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020617。

优选的，所述发酵培养基包括如下质量体积比的组分：葡萄糖38～42g/L，木糖18～24g/L，酵母提取物8～12g/L，玉米浆8～12g/L，碳酸氢钠2～10g/L，磷酸二氢钾2～10g/L，氯化钙0.3～1.0g/L，氯化镁0.3～1.0g/L，碱式MgCO345～55g/L和余量的水。

优选的，所述初始菌株先用种子培养基活化，得到种子液；再将种子液接种到含五羟甲基糠醛的发酵培养基中驯化。

优选的，所述种子液的接种量为8～15v/v％。

优选的，所述驯化包括一级驯化培养、二级驯化培养、三级驯化培养、四级驯化培养和五级驯化培养；

所述一级驯化培养所用发酵培养基中五羟甲基糠醛的浓度为1.55～1.65g/L；所述二级驯化培养所用发酵培养基中五羟甲基糠醛的浓度为1.75～1.85g/L；所述三级驯化培养所用发酵培养基中五羟甲基糠醛的浓度为1.95～2.05g/L；所述四级驯化培养所用发酵培养基中五羟甲基糠醛的浓度为2.15～2.25g/L；所述五级驯化培养所用发酵培养基中五羟甲基糠醛的浓度为2.35～2.45g/L。

优选的，所述一级驯化培养、二级驯化培养、三级驯化培养、四级驯化培养和五级驯化培养的驯化转速独立的为100～200r/min，驯化温度独立的为30～38℃，驯化时间独立的为24～72h，驯化次数独立的为3～5次。

本发明还提供了耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌在生产丁二酸中的应用。

优选的，所述产琥珀酸放线杆菌对五羟甲基糠醛的耐受浓度为1.6～2.4g/L。

本发明提供了一株耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌GXAS-137HFM，该菌株对五羟甲基糠醛的耐受浓度为1.6～2.4g/L，相比于产琥珀酸放线杆菌GXAS-137大大提高了对五羟甲基糠醛的耐受性。因此，本发明提供了一株耐受五羟甲基糠醛的可用于生产丁二酸的新菌株，该新菌株有助于降低生产成本及对化石资源的依赖，解决了木质纤维素脱毒过程中产生的环境污染问题，提高了经济效益和社会效益。本发明通过增加发酵微生物的抗逆性和在胁迫环境下的生产效率，实现了在高浓度五羟甲基糠醛的条件下高效生产丁二酸的目的。相比于脱毒策略，本发明的技术思路是应对抑制物问题的更为理想的方法策略。

图1为不同五羟甲基糠醛浓度下GXAS-137HFM菌体的生物量；

图2为不同五羟甲基糠醛浓度下GXAS-137HFM菌体发酵产丁二酸的量；

图3为不同五羟甲基糠醛浓度下GXAS-137菌体的生物量；

图4为不同五羟甲基糠醛浓度下GXAS-137菌体发酵产丁二酸的量；

保藏说明

产琥珀酸放线杆菌GXAS-137HFM，拉丁文为Actinobacillus succinogenes GXAS-137HFM，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2021年8月10日，保藏编号为：CCTCC NO:M 20211004。

产琥珀酸放线杆菌GXAS-137FM，该菌株的拉丁文名称为Actinobacillussuccinogenes GXAS-137FM，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年10月21日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020617。

产琥珀酸放线杆菌GXAS-137，该菌株的拉丁文名称Actinobacillussuccinogenes GXAS-137，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉大学保藏中心，保藏日期为2011年11月18日，保藏编号为CCTCC NO：M2011399。

本发明提供了一株耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌及其选育方法。

本发明提供的一种耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌的选育方法，是将初始菌株接种到含五羟甲基糠醛的发酵培养基中驯化得到。

在本发明中，所述初始菌株为产琥珀酸放线杆菌GXAS-137FM，该菌株的拉丁文名称为Actinobacillus succinogenes GXAS-137FM，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年11月5日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020617。

在本发明中，所述发酵培养基优选包括如下质量体积比的组分：葡萄糖38～42g/L，木糖18～24g/L，酵母提取物8～12g/L，玉米浆8～12g/L，碳酸氢钠2～10g/L，磷酸二氢钾2～10g/L，氯化钙0.3～1.0g/L，氯化镁0.3～1.0g/L，碱式MgCO345～55g/L和余量的水；进一步优选包括如下质量体积比的组分：葡萄糖40g/L，木糖20g/L，酵母提取物10g/L，玉米浆10g/L，碳酸氢钠5g/L，磷酸二氢钾6g/L，氯化钙0.8g/L，氯化镁0.6g/L，碱式MgCO350g/L和余量的水。

在本发明中，所述发酵培养基的pH优选为6.5～7.0，进一步优选为6.8。

在本发明中，所述初始菌株先用种子培养基活化，得到种子液；再将种子液接种到含五羟甲基糠醛的发酵培养基中驯化。

在本发明中，所述种子培养基优选包括如下质量体积比的组分：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，玉米浆5g/L，NaHCO32g/L，NaH2PO49g/L，K2HPO415.5g/L和余量的水。

在本发明中，所述活化优选的在厌氧培养箱或普通培养箱中进行。

在本发明中，所述活化的温度优选为36～38℃，进一步优选为37℃。

在本发明中，所述活化的时间优选为16～20h，进一步优选为18h。

在本发明中，所述活化优选培养至菌数达到3亿以上，得到种子液。

得到种子液后，将种子液接种到含五羟甲基糠醛的发酵培养基中进行驯化。

在本发明中，所述种子液的接种到发酵培养基中的接种量优选为8～15v/v％，进一步优选为10v/v％。

在本发明中，所述驯化包括一级驯化培养、二级驯化培养、三级驯化培养、四级驯化培养和五级驯化培养。

在本发明中，所述一级驯化培养所用发酵培养基中五羟甲基糠醛的浓度优选为1.55～1.65g/L，进一步优选为1.6g/L；所述二级驯化培养所用发酵培养基中五羟甲基糠醛的浓度优选为1.75～1.85g/L，进一步优选为1.8g/L；所述三级驯化培养所用发酵培养基中五羟甲基糠醛的浓度优选为1.95～2.05g/L，进一步优选为2.0g/L；所述四级驯化培养所用发酵培养基中五羟甲基糠醛的浓度优选为2.15～2.25g/L，进一步优选为2.2g/L；所述五级驯化培养所用发酵培养基中五羟甲基糠醛的浓度优选为2.35～2.45g/L，进一步优选为2.4g/L。

在本发明中，优选在每一级驯化的菌株生长繁殖至稳定期时，即进行下一级的驯化。

在本发明中，所述一级驯化培养、二级驯化培养、三级驯化培养、四级驯化培养和五级驯化培养的驯化转速独立的优选为100～200r/min，进一步独立的优选为150r/min。

在本发明中，所述一级驯化培养、二级驯化培养、三级驯化培养、四级驯化培养和五级驯化培养的驯化温度独立的优选为30～38℃，进一步独立的优选为32～36℃，再进一步独立的优选为35℃。

在本发明中，所述一级驯化培养、二级驯化培养、三级驯化培养、四级驯化培养和五级驯化培养的驯化时间独立的优选为24～72h，进一步独立的优选为36～60h，再进一步独立的优选为48h。

在本发明中，所述一级驯化培养、二级驯化培养、三级驯化培养、四级驯化培养和五级驯化培养的驯化次数独立的优选为3～5次，进一步优选为4次。

本发明还提供了耐受五羟甲基糠醛的产琥珀酸放线杆菌在生产丁二酸中的应用。

在本发明中，所述产琥珀酸放线杆菌对五羟甲基糠醛的耐受浓度优选为1.6～2.4g/L，进一步优选为1.6g/L、1.8g/L、2.0g/L、2.2g/L、2.4g/L，再进一步优选为2.4g/L。

在本发明中，所述五羟甲基糠醛的耐受浓度是指在56～66g/L的混合糖(葡萄糖和木糖)发酵培养基中五羟甲基糠醛的浓度为1.6～2.4g/L，进一步优选所述五羟甲基糠醛的耐受浓度是指在60g/L的混合糖(葡萄糖和木糖)发酵培养基中五羟甲基糠醛的浓度为2.4g/L。

在本发明实施例2和对比例1中有机酸(丁二酸)的测定方法为：戴安Utimat3000，自动进样器，谱柱：Rezex ROA-Organic Acid H+(8％)300×7.8mm，流动相pH2.5，5mmol/LH2SO4，柱温50℃，进样量10μL，流速0.6mL/min，紫外检测器波长210nm；

生物量测定方法为：可见光/紫外分光光度计(DU800 UV/VISSpectrophotometer，Beckman，USA)波长660nm，样品先用0.2M HCl进行预处理，溶解所含的碱式碳酸镁，然后12000r/min离心10min，再用蒸馏水洗涤去除所含的素和杂质。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

挑取产琥珀酸放线杆菌GXAS-137FM单菌落接入种子培养基中活化，在厌氧培养箱中37℃培养18h，使菌数达3亿以上，得到种子液。按照8v/v％的接种量将种子液接种到含1.6g/L五羟甲基糠醛的发酵培养基中进行一级驯化培养，培养至稳定期后；按照8v/v％的接种量将一级驯化培养后的菌液接种到含1.8g/L五羟甲基糠醛的发酵培养基中进行二级驯化培养，培养至稳定期后；按照8v/v％的接种量将二级驯化培养后的菌液接种到含2.0g/L五羟甲基糠醛的发酵培养基中进行三级驯化培养，培养至稳定期后；按照8v/v％的接种量将三级驯化培养后的菌液接种到含2.2g/L五羟甲基糠醛的发酵培养基中进行四级驯化培养，培养至稳定期后；按照8v/v％的接种量将四级驯化培养后的菌液接种到含2.4g/L五羟甲基糠醛的发酵培养基中进行五级驯化培养，培养至稳定期后，收集五级驯化培养后的菌株。

在本实施例中，一级驯化培养、二级驯化培养、三级驯化培养、四级驯化培养、五级驯化培养的温度均控制为37℃，转速均控制为150r/min，每一级的驯化次数控制为4次。

其中，种子培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，玉米浆5g/L，NaHCO32g/L，NaH2PO49g/L，K2HPO415.5g/L和余量的水；

发酵培养基为：葡萄糖40g/L，木糖20g/L，酵母提取物10g/L，玉米浆10g/L，碳酸氢钠5g/L，磷酸二氢钾6g/L，氯化钙0.8g/L，氯化镁0.6g/L，碱式MgCO350g/L和余量的水，pH＝7.0。

实施例2

对实施例1驯化菌株的性能进行研究

将实施例1收集的菌株接入到种子培养基中活化，在厌氧培养箱中37℃下培养18h，测得菌数达到3亿以上，再按照5v/v％的接种量再次接种到种子培养基中进行二级扩繁培养，二级扩繁培养在厌氧培养箱中37℃下培养18h，菌数达到3亿以上后，即得到种子液。将种子液按照8v/v％的接种量接种到含有不同浓度(分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4g/L)的过滤除菌的五羟甲基糠醛的发酵培养基中，在150r/min，35℃下发酵60h。分别在培养的第12h、18h、24h、36h、48h、60h测定发酵产物(丁二酸)及生物量(OD600)，结果见图1和图2。

在本实施例中，种子培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，玉米浆5g/L，NaHCO32g/L，NaH2PO49g/L，K2HPO415.5g/L和余量的水。

发酵培养基为：葡萄糖40g/L，木糖20g/L，酵母提取物10g/L，玉米浆10g/L，碳酸氢钠5g/L，磷酸二氢钾6g/L，氯化钙0.8g/L，氯化镁0.6g/L，碱式MgCO350g/L和余量的水，pH＝7.0。

由图1可以看出，实施例1驯化的菌株在0～2.4g/L的五羟甲基糠醛浓度的发酵培养基中都可以生长，在含有2.4g/L五羟甲基糠醛的发酵培养基中，菌株生长出现迟缓现象，在24小时开始进入稳定期。从图2可以看出，在2.4g/L五羟甲基糠醛浓度下，发酵36h，丁二酸产量为25.00g/L，发酵60h(生长稳定期)丁二酸的产量达到37.16g/L，与对照组相比(五羟甲基糠醛浓度为0时)下降24.37％；在2.0g/L五羟甲基糠醛浓度下，发酵60h，菌体生长浓度OD600可达1.51，丁二酸的产量达到37.89g/L。

对比例1

将产琥珀酸放线菌GXAS-137单菌落接入到种子培养基中活化，在厌氧培养箱中37℃下培养18h，测得菌数达到3亿以上，再按照5v/v％的接种量再次接种到种子培养基中进行二级扩繁培养，二级扩繁培养在厌氧培养箱中37℃下培养18h，菌数达到3亿以上后，即得到种子液。将种子液按照8v/v％的接种量接种到含有不同浓度(分别为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0g/L)的过滤除菌的五羟甲基糠醛的发酵培养基中，在150r/min，35℃下发酵60h。分别在培养的第12h、18h、24h、36h、48h、60h测定发酵产物(丁二酸)及生物量(OD600)，结果见图3和图4。

在本实施例中，种子培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，玉米浆5g/L，NaHCO32g/L，NaH2PO49g/L，K2HPO415.5g/L和余量的水；

发酵培养基为：葡萄糖40g/L，木糖20g/L，酵母提取物10g/L，玉米浆10g/L，碳酸氢钠5g/L，磷酸二氢钾6g/L，氯化钙0.8g/L，氯化镁0.6g/L，碱式MgCO350g/L和余量的水，pH＝7.0。

由图3可以看出，当培养基中五羟甲基糠醛浓度达到0.8g/L时，GXAS-137菌体生长出现迟滞现象，24小时以后进入稳定生长期。由图4可以看出，在1.2g/L五羟甲基糠醛浓度下，发酵36小时，丁二酸产量为27.15g/L，与不添加五羟甲基糠醛的对照组相比，丁二酸下降19.58％；在1.6g/L和2.0g/L五羟甲基糠醛浓度下，菌株生长完全被抑制，菌株的OD600值趋近于0，发酵培养基中检测不到丁二酸，说明此时接种进去的菌体既不生长，也不产酸，停止了一切代谢活动。

由以上实施例可知，原始菌株GXAS-137在五羟甲基糠醛浓度到1.6g/L后停止了一切代谢活动，而本发明实施例1的驯化菌株，在五羟甲基糠醛浓度为1.6g/L的发酵培养基中，生长良好，甚至在2.4g/L五羟甲基糠醛浓度下也可以生长。原始菌株GXAS-137在能够生长的1.2g/L五羟甲基糠醛浓度下，发酵48h，丁二酸产量仅为32.08g/L。而本发明实施例1的驯化菌株在1.2g/L五羟甲基糠醛浓度下，发酵48h，丁二酸产量为37.76g/L，提高了17.7％。因此，本发明实施例1筛选得到的菌株具有较好的5羟甲基糠醛耐受性和较高的丁二酸生产能力，相比于原始菌株产琥珀酸放线杆菌GXAS-137大大提高了对五羟甲基糠醛的耐受性和生产丁二酸能力，本发明将该菌株命名为产琥珀酸放线杆菌GXAS-137HFM。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。