一种检测GNRH结合蛋白生物学活性的方法及试剂盒

本发明属于生物药物的生物学活性检测领域，具体而言，涉及一种检测GNRH结合蛋白的生物学活性方法。

促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone, GNRH）由下丘脑分泌，刺激或抑制垂体促性腺激素的分泌，对脊椎动物生殖的调控起重要作用，有相当的活性潜能，GNRHR（Gonadotropin-releasing hormone Receptor）是其受体。

生物学活性检测的方法多采用基于细胞的生物学活性测定方法，主要包括细胞增殖抑制法、细胞毒性法、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性法、补体依赖的细胞毒性法、细胞竞争ELISA法和报告基因法。报告基因法的生物学活性检测方法是构建表达荧光素酶报告基因的转基因细胞系，通过检测荧光素酶化学发光信号来反映单克隆抗体类药物活性。报告基因法相对于细胞增殖抑制法具有实验周期短、变异小的特点，适用于短时间内对多个样品进行生物学活性评价，是近年来发展迅速的检测方法。

目前，针对GNRH结合蛋白的生物学活性的测定，本领域仍然存在新型的测定方法的需要，也未见采用报告基因法检测GNRH结合蛋白的生物学活性的相关报道。

目前，针对GNRH结合蛋白的生物学活性的测定，本发明提供了一种检测GNRH结合蛋白药物生物学活性的方法及试剂盒。

技术方案：

第一方面，本发明提供了一种检测GNRH结合蛋白的生物学活性的方法，该方法先构建共表达GNRHR和带有免疫相关信号通路反应元件的报告基因的效应细胞，然后孵育包含GNRH结合蛋白、效应细胞的混合物，孵育后加入酶反应底物，根据测定的信号值拟合四参数曲线确定GNRH结合蛋白的生物学活性。

在一些技术方案中，所述GNRH结合蛋白是GNRH激动剂或抑制剂。

在一些技术方案中，带有免疫相关信号通路反应元件的报告基因是CRE-荧光素酶、NFAT-荧光素酶、SRE-荧光素酶、NFAT-CRE-荧光素酶，最优选NFAT-荧光素酶。

在一些技术方案中，所述效应细胞是CHO-K1细胞、Expi293细胞、293T细胞，最优选CHO-K1细胞。

在一些技术方案中，所述效应细胞为共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT，2022年7月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2022163。

在一些技术方案中，所述GNRH结合蛋白为GNRH激动剂，检测GNRH激动剂的生物学活性的方法步骤如下：

（1）构建、筛选得到共表达GNRHR和带有免疫相关信号通路反应元件的报告基因的效应细胞；

（2）将GNRH激动剂进行梯度稀释，并将梯度稀释后的GNRH激动剂分别与步骤（1）中所述效应细胞一起孵育；

（3）加入荧光素酶反应底物，根据测定的信号值拟合四参数曲线确定GNRH激动剂的生物学活性。

在一些技术方案中，所述GNRH激动剂为GNRH。

在一些技术方案中，所述GNRH结合蛋白为GNRH抑制剂，检测GNRH抑制剂的生物学活性方法步骤如下：

（1）构建、筛选得到共表达GNRHR和带有免疫相关信号通路反应元件的报告基因的效应细胞；

（2）将GNRH抑制剂进行梯度稀释，并将梯度稀释后的GNRH抑制剂分别与GNRH激动剂、步骤（1）中所述的效应细胞一起孵育；

（3）加入荧光素酶反应底物，根据测定的信号值拟合四参数曲线确定GNRH抑制剂的生物学活性。

在一些技术方案中，所述GNRH抑制剂为醋酸加尼瑞克注射液。

在一些技术方案中，检测GNRH抑制剂的生物学活性方法中所述GNRH激动剂的浓度是0.005~0.05nM。在一些技术方案中，检测GNRH抑制剂的生物学活性方法中所述GNRH激动剂的浓度优选自0.007~0.04nM。在一些技术方案中，检测GNRH抑制剂的生物学活性方法中所述GNRH激动剂的浓度更优选自0.008~0.03nM，更优选自0.008nM、0.009nM、0.01nM、0.02nM、0.03nM，最优选自0.01nM。在一些技术方案中，检测GNRH抑制剂的生物学活性方法中所述GNRH激动剂的浓度是0.01nM。

在一些技术方案中，所述检测GNRH结合蛋白时用于孵育的效应细胞的细胞密度是3×106~5×106 cell/mL，优选自3.3×106 ~5×106 cell/mL，更优选自3.3×106 ~4.7×106 cell/mL，更优选自3.5×106 cell/mL、3.6×106 cell/mL、3.7×106 cell/mL、3.8×106 cell/mL、3.9×106 cell/mL、4×106 cell/mL、4.1×106 cell/mL、4.2×106 cell/mL、4.3×106 cell/mL、4.4×106 cell/mL、4.5×106 cell/mL、4.6×106 cell/mL、4.7×106 cell/mL，最优选自4×106 cell/mL。在一些技术方案中，所述检测GNRH结合蛋白时用于孵育的效应细胞密度是4×106 cell/mL。在一些技术方案中，所述检测GNRH结合蛋白时用于孵育的效应细胞是共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT，所述细胞的细胞密度是4×106 cell/mL。在一些技术方案中，所述检测GNRH结合蛋白时用于孵育的效应细胞是共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT，于2022年7月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2022163的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT，所述保藏细胞的细胞密度是4×106 cell/mL。

在一些技术方案中，所述检测GNRH结合蛋白时的孵育条件是：35~38℃、7~10％CO2的条件震荡孵育5~7小时。在一些技术方案中，所述检测GNRH结合蛋白时的孵育条件是：优选自36~37℃、7~9％CO2的条件震荡孵育5.5~7小时。在一些技术方案中，所述检测GNRH结合蛋白时的孵育条件是：更优选自36.5~37℃、7~9％CO2的条件震荡孵育5.5~6.5小时。在一些技术方案中，所述检测GNRH结合蛋白时的孵育条件是：最优选自36.5℃、8%CO2的条件震荡孵育6小时。

在一些技术方案中，孵育后，加入的酶反应底物与孵育混合物的体积为1:1~1.5，优选自1:1~1.3，更优选自1:1~1.2，最优选自1:1。

第二方面，本发明提供了一种测定GNRH结合蛋白的生物活性的组合物，包括以下组分：1）一种共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT，2022年7月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2022163；2）荧光素酶反应底物。

第三方面，本发明提供了一种用于测定GNRH结合蛋白的生物活性的试剂盒，所述试剂盒包括如第二方面所述的组合物。

第四方面，本发明提供了一种共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT，2022年7月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2022163。

有益效果：

（1）首次采用报告基因法检测了GNRH激动剂和抑制剂的生物学活性；

（2）成功构建并筛选得到共表达GNRH和NFAT-荧光素酶的CHO-K1细胞，并将其送至中国典型培养物保藏中心保藏；

（3）对检测方法的步骤条件等进行了改进优化，更有助于得到准确的实验结果。

定义：

本发明使用的术语“NFAT”、“CRE”、“SRE”均是响应元件，即指基因启动子区域的一段短的DNA序列，能与特异的转录因子结合，调控基因的转录。

本发明使用的术语“CHO-K1细胞”、“Expi293细胞”、“293T细胞”均是指快速、规模可调的悬浮培养系统中使用的细胞系。

本发明使用的术语“中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT”即为保藏证明上的保藏细胞的名称，其代表的是能够稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶的中国仓鼠卵巢细胞。

图1是最适用于检测GNRH结合蛋白的生物学活性方法的CHO-K1细胞密度的柱状图；

图2是GNRH激动剂刺激稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶的CHO-K1细胞的四参数曲线图；

图3是GNRH抑制剂抑制稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶的CHO-K1细胞的四参数曲线图；

图4是稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶的CHO-K1单克隆细胞的信噪比柱状图；

图5是GNRH激动剂刺激筛选后稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶的CHO-K1单克隆细胞4的四参数曲线图；

图6是GNRH抑制剂抑制筛选后稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶的CHO-K1单克隆细胞4的四参数曲线图；

图7是方法学验证中得到的四参数曲线图。

为详细说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合具体实验对本发明进行详细、清晰的阐述。

实验材料

未转染的CHO-K1细胞：来源于ATCC，Cat.NO.：CCL-61；PURO：嘌呤霉素：来源于碧云天，货号为ST551；NeoR：遗传霉素：来源于碧云天，货号为ST081；培养基1：来源于奥浦迈，货号为C602502；GNRH激动剂：GnRH，来源于Genscript公司，Cat.NO.：C837YGJ110-1/PE8571；GNRH抑制剂：醋酸加尼瑞克注射液：来源于MERCK&Co.,Inc，Cat.NO.：0001297375；荧光素酶反应底物：来自荧光素酶报告基因检测试剂盒，试剂盒来源于诺唯赞公司，货号为DD1201；酶标仪：来源于BioTek；二氧化碳高速震荡培养箱：来源于SEELEY；酶标板：来源于上海晶安，货号为J09602；深孔板：来源于无锡耐思，货号503062；离心机：来源于中科中佳，货号为KDC-30；无内毒素质粒提取试剂盒：来源于Sigma，Cat.NO.：A33073。

实施例1

1.1、构建质粒

采用全基因合成技术合成NFAT基因，并在其5 '端添加SpeI酶切位点，3 '端添加BstBI酶切位点，然后将合成好的NFAT基因通过上游SpeI酶切位点和下游BstBI酶切位点构建到载体PGL-luc-NeoR(载体是由反向PCR获取)，并使用无内毒素质粒提取试剂盒进行无内毒素质粒的小提制备，得PGL-luc-NFAT-NeoR质粒。

采用全基因合成技术合成Human GNRHR基因，并在其5 '端添加HindIII单酶切位点，然后将合成好的Human GNRHR基因通过上游HindIII单酶切位点构建到载体PB-PurOR载体(含PuroR筛选标记)，并使用无内毒素质粒提取试剂盒进行无内毒素质粒的小提制备，得PCD004-PURO-Human GNRHR质粒。

1.2、CHO-K1细胞的转染

采用电转的方法将PCD004-PURO-Human GNRHR和PGL-luc-NFAT-NeoR质粒均导入CHO-K1细胞内。转染使用125mL摇瓶，细胞密度大于1×106cell/mL，培养基1体积为10mL，质粒用量为20μg。电转电压300V，脉冲时间20ms/次。电转后48小时后换液加压培养，筛选压力为PURO 10μg/mL和NeoR 300μg/mL。传代3-5次后进行检测。

1.3、CHO-K1细胞密度筛选

将作为空白对照的未转染的CHO-K1细胞与稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT 取样计数，离心后用15.6mL分析培养基(99% DMEM + 1% FBS )重悬并稀释到如表1中所述的细胞密度；使用分析培养基 ( 99%DMEM + 1% FBS )将GNRH激动剂稀释到0.01nM。按表1体系进行深孔板铺板，使两类CHO-K1细胞分别与GNRH激动剂混合：

将上述盛有混合物的深孔板放在二氧化碳高速震荡培养箱中，以36.5℃、8％CO2的条件培养6小时后，取出深孔板，室温放置30 min。从深孔板的每个孔中取出100μL混合物加入酶标板中，以混合物与荧光素酶反应底物为1：1的比例向酶标板中加入荧光素酶反应底物，即每孔加入荧光素酶反应底物100μL；室温放置至少3 min，用酶标仪进行发光检测，后使用Graphpad8 .0软件进行数据处理形成柱状图（图1）。最终选择将共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT的细胞密度设置为4×106cell/mL，备用。

1.4、CHO-K1细胞检测GNRH激动剂

以未转染的CHO-K1细胞做空白对照，将稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT与未转染的CHO-K1细胞分别稀释到密度为4×106cell/mL，并均以每孔390μL的体积分开铺至深孔板；将GNRH激动剂的浓度分别稀释到1nM、0.1nM、0.01nM、1×10-3nM、1×10-4nM、1×10-5nM、1×10-6nM、0nM，并以每孔10μL的体积将各梯度浓度的GNRH激动剂加入到深孔板中，使上述两种CHO-K1细胞分别与GNRH激动剂混合；将上述盛有混合物的深孔板放在二氧化碳高速震荡培养箱中以36.5℃、8％CO2的条件培养6小时后，从深孔板的每个孔中取100μL混合物加入酶标板，按混合物与荧光素酶反应底物为1：1的比例向酶标板中加入荧光素酶反应底物，即加入荧光素酶反应底物100μL；室温放置至少3 min，用酶标仪进行发光检测，使用Graphpad8 .0进行数据处理拟合倒S型四参数曲线（图2）。

1.5、CHO-K1细胞检测GNRH抑制剂药物

以未转染的CHO-K1细胞做空白对照，将稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT与未转染的CHO-K1细胞的细胞密度分别稀释到4×106cell/mL，并均以每孔370μL的体积分开铺至深孔板；将GNRH抑制剂的浓度分别稀释到1×104nM、1×103nM、100M、10nM、1nM、0.1nM、0nM，并以每孔20μL的体积将各梯度浓度的GNRH抑制剂分开加入到深孔板中；将GNRH激动剂的浓度稀释到0.01nM，以每孔10μL的体积加入到深孔板中，使上述两种CHO-K1细胞、各梯度浓度的GNRH抑制剂及GNRH激动剂混合；将盛有上述混合物的深孔板放在二氧化碳高速震荡培养箱中以36.5℃、8％CO2的条件培养6小时后，从深孔板的每个孔中取100μL混合物加入酶标板，按混合物与荧光素酶反应底物为1：1的比例向酶标板中加入荧光素酶反应底物，即加入荧光素酶反应底物100μL；室温放置至少3 min，用酶标仪进行发光检测，使用Graphpad8 .0进行数据处理拟合倒S型四参数曲线（图3）。

1.6、实验结果

结果显示，构建的稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT对GNRH激动剂的刺激作用和GNRH抑制剂的抑制作用都有较好的荧光素酶表达反应性(图2-3)，因此，通过本发明所述的方法构建得到的稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT可作为实验用细胞。

实施例2

2.1、CHO-K1细胞的单克隆筛选

待稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT的细胞密度和活力恢复后，通过有限稀释法，按照0.5个/孔的密度，铺深孔板以筛选单克隆。在细胞生长期间，观察并标记哪些孔是单克隆，当单克隆孔内细胞汇合度达到50％以上时，转移细胞并扩大培养，标记克隆序号1-6。将每株稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT单克隆细胞的密度均稀释到4×106cell/mL。

以实施例1中稳定过表达GNRHR和NFAT-荧光素酶的仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT为对照，与6株筛选到的单克隆细胞均以每孔390μL的体积分开铺至深孔板；将GNRH激动剂的浓度稀释至0.01nM，以每孔10μL的体积加入到深孔板中，使两类CHO-K1细胞分别与GNRH激动剂混合；将上述盛有混合物的深孔板放在二氧化碳高速震荡培养箱中，以36.5℃、8％CO2的条件培养6小时后，取出深孔板，室温放置30 min。从深孔板的每个孔中取100μL混合物加入酶标板，按检测试剂与荧光素酶反应底物为1：1的比例向酶标板中加入荧光素酶反应底物，即每孔加入荧光素酶反应底物100μL；室温放置至少3 min，用酶标仪进行发光检测，使用Graphpad8 .0进行数据处理拟合倒S型四参数曲线（图4）。

其中，稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT单克隆细胞4信噪比最高，选用该单克隆细胞4进行细胞保藏，2022年7月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2022163。

2.2、中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT单克隆细胞4的GNRH激动剂检测

以未转染的CHO-K1细胞做空白对照，将中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT单克隆细胞4和未转染的CHO-K1细胞的细胞密度分别稀释到密度为4×106cell/mL，并均以每孔390μL的体积分开铺至深孔板；将GNRH激动剂的浓度分别稀释到1nM、0.1nM、0.01nM、1×10-3nM、1×10-4nM、1×10-5nM、1×10-6nM、0nM，以每孔10μL的体积将各梯度浓度的GNRH激动剂分别加至深孔板各孔中，使上述两种CHO-K1细胞分别与GNRH激动剂混合；将上述盛有混合物的深孔板放在二氧化碳高速震荡培养箱中以36.5℃、8％CO2的培养箱内培养6小时后，从深孔板的每个孔中取100μL混合物加入酶标板，按混合物与荧光素酶反应底物为1：1的比例向酶标板中加入荧光素酶反应底物，即加入荧光素酶反应底物100μL；室温放置至少3 min，用酶标仪进行发光检测，使用Graphpad8 .0进行数据处理拟合倒S型四参数曲线（图5）。

2.3、中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT单克隆细胞4的GNRH抑制剂检测

以未转染的CHO-K1细胞做空白对照，将中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT单克隆细胞4和未转染的CHO-K1细胞的细胞密度分别稀释到密度为4×106cell/mL，并均以370μL每孔的体积分开铺至深孔板；将GNRH抑制剂的浓度分别稀释到1×104nM、1×103nM、100M、10nM、1nM、0.1nM、0nM，并以每孔20μL的体积将各梯度浓度的GNRH抑制剂分别加至深孔板各孔中；将GNRH激动剂的浓度稀释到0.01nM，以每孔10μL的体积铺至深孔板，使上述两种CHO-K1细胞、各梯度浓度的GNRH抑制剂及GNRH激动剂混合；将盛有上述混合物的深孔板放在二氧化碳高速震荡培养箱中以36.5℃、8％CO2的培养箱内培养6小时后，从深孔板的每个孔中取100μL混合物加入酶标板，按混合物与荧光素酶反应底物为1：1的比例向酶标板中加入荧光素酶反应底物，即加入荧光素酶反应底物100μL；室温放置至少3 min，用酶标仪进行发光检测，使用Graphpad8 .0进行数据处理拟合倒S型四参数曲线（图6）。

2.4、实验结果

结果显示，经过筛选得到的稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT单克隆细胞4对GNRH激动剂的刺激作用和GNRH抑制剂的抑制作用都有较好荧光素酶表达反应性(图5-6)，因此，通过本发明所述的方法筛选得到的稳定共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT单克隆细胞4可用于检测GNRH激动剂和抑制剂生物活性。

实施例3 方法学验证

使用分析培养基( 99% DMEM + 1% FBS )稀释表2中显示的样品和标准品，并将样品和标准品的终浓度记录在表3中：

制备如表4所示的体系：

以上体系铺至深孔板中，使上述中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT单克隆细胞4、各梯度浓度的GNRH抑制剂（标准品或样品）及GNRH激动剂混合。

上述盛有待混合物的深孔板放在二氧化碳高速震荡培养箱中以36.5℃、8％CO2的条件培养6小时后，取出盛有混合物的深孔板，室温放置30 min。从深孔板的每个孔中取100μL混合物加入酶标板中，以每孔按混合物与荧光素酶反应底物为1：1的比例向酶标板中加入荧光素酶反应底物，即加入荧光素酶反应底物100μL；室温放置至少3 min，用酶标仪进行发光检测，后使用Graphpad8 .0软件进行数据处理拟合倒S型四参数曲线（图7），并得出样品和标准品的IC50和R2的值，见表5。从而得出报告基因法验证检测GNRH结合蛋白生物学活性的方法是满足可接受标准的，可使用该方法进行检测GNRH结合蛋白的生物学活性。

实施例4

一种用于测定GNRH结合蛋白的生物活性的试剂盒，该试剂盒中包括荧光素酶反应底物和实施例2中保藏的共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT。荧光素酶反应底物不仅限来源于诺唯赞公司货号为DD1201的荧光素酶报告基因检测产品；保藏的共表达GNRHR和NFAT-荧光素酶报告基因的中国仓鼠卵巢细胞CHOK1/GnRHR/NFAT于2022年7月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2022163。

该试剂盒使用的方法参照实施例2中2.2、2.3的实验步骤。