α-氨基酸酯水解酶突变体

α‑氨基酸酯水解酶突变体 

 技术领域：

 本发明与多肽有关，尤其与来源于大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a‑aeh的a‑氨基酸酯水解酶突变体有关。

背景技术：

α‑氨基酸酯水解酶（EC 3.1.1.43）相比青霉素酰化酶而言，具有诸多优点：不受苯甘氨酸的抑制；对D型苯甘氨酸甲酯有构象选择性，工业上可以直接使用消旋混合物，而不必先进行拆分；其最适反应pH比青霉素酰化酶低，也使反应体系中的底物和产物更稳定。长期以来，a‑氨基酸酯水解酶的研究受到生物学家和药学家的重视，有关a‑氨基酸酯水解酶产酶菌株的分离、酶基因的鉴定及其在生物转化中的应用也有一些报道。虽然a‑氨基酸酯水解酶具有一系列优点，但酶的某些性质还需进一步优化以适应工业化的需要。对于一种具有经济吸引力的酶法制备β‑内酰胺抗生素工艺来说，理想的是合成/水解比率（S/H比率）要高。优选地，S/H比率高，且同时酶活性也足够高。

发明内容：

本发明的目的是提供一种用于β‑内酰胺抗生素的合成，生产效率高，不对β‑内酰胺环有明显水解作用，合成/水解比率高，酶活性也适于合成生产过程的α‑氨基酸酯水解酶突变体。

本发明是这样实现的： 

本发明1、α‑氨基酸酯水解酶突变体，其特征在于大肠杆菌的a‑氨基酸酯水解酶脱氧核糖核酸的碱基序列见序列表中序列1，所编码的多肽的氨基酸序列见序列表中序列2，所述氨基酸序列中的175位上的氨基酸为丙氨酸，所述大肠杆菌BL21(DE3)/pET28‑aehY175A的分类命名：大肠埃希氏菌，拉丁文名Escherichia  coli，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No.4758。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

应用于β—内酰胺抗生素的合成，合成水解比率为1.9。 

其制备方法如下： 

（1）从大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a‑aeh中提取图1所示重组质粒pET28a‑aeh，大肠杆菌BL21(DE3)/pET28‑aeh的分类命名：大肠埃希氏菌，拉丁文名：Escherichia  coli，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No.4757,保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

大肠杆菌BL21(DE3)/pET28‑aeh的制备方法如下： 

a将黄单孢菌基因组用PCR方法扩增目的基因aeh，所用载体为pGEM‑T，aeh的酶切位点为EcoRI和XhoI，将EcoRI‑aeh‑XhoI片段与载体pGEM‑T连接，转化入宿主菌JM109，选择白菌落，得重组质粒pGEM‑T‑aeh，

b将重组质粒pGEM‑T‑aeh和载体pET28a双酶切，对线性化后的pET28a载体进行去磷酸化，用连接酶将aeh和载体pET28a连接，转化入宿主菌JM109，得重组质粒pET28a‑aeh，

c从宿主菌JM109中提取重组质粒pET28a‑aeh转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，

d培养转化细胞，使重组质粒pET28a‑aeh随大肠杆菌BL21（DE3）细胞一起大量扩增，

e从扩增的细胞中筛选出含有重组质粒的pET28a‑aeh细胞，即得大肠杆菌BL21(DE3)/pET28‑aeh。

（2）设计1种定点突变引物，其核苷酸序列如下： 

正向引物：GCATGATCGGTTCGTCCGCCGAGGGCTTCACCG

反向引物：CGGTGAAGCCCTCAGCGGACGAACCGATCATGC

向PCR薄壁反应管中添加如下组分：

组分 体积(ul)

模板质粒 1

10uM正向引物 1.5

10uM反向引物 1.5

10×缓冲液 5

2mM dNTPs 5

KOD 5U/ul 1

H ₂O 35

总体积 50

（3）在PCR仪中热循环扩增质粒DNA片断，详细过程如下：

热循环仪中发生以下步骤：

1.94℃         2分钟

2.94℃         30秒

3.58℃         30秒

4.68℃         7.4分钟

5.2‑4步       ×15次

6. 72℃         10分钟

（4）用限制性内切酶切割PCR产物，过程如下，向50ulPCR产物中加入2ul 10U/ul的DpnI，混匀，37℃孵育1h去除野生型质粒。

（5）用（4）得到的反应混合物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）， 

（6）将（5）的培养物制备无细胞裂解液，

（7）将无细胞裂解液用亲和柱纯化，即得电泳纯的突变体酶。

本发明不对β—内酰胺环有明显水解作用，合成/水解比率高，可达1.9，酶活性适于工业化生产抗生素。 

合成/水解比率（S/H比率）理解为：在所定义条件下，酶促酰化反应的合成产物与水解产物的摩尔比率。合成产物理解为由活化侧链和β‑内酰胺母核形成的β‑内酰胺抗生素。水解产物理解为相应于活化侧链的酸。除其他因素外，S/H比率是反应物浓度、温度、pH和酶的函数。因此指明在何种条件下测定S/H比率是很重要的。酶的添加量保持D‑PGM的水解初始速度介于0.2～0.3mM/min。实验例中对以上各参数作了规定。 

缩写列表 

7‑ADCA：7‑氨基去乙酰氧基头孢烷酸

PGM：D‑苯甘氨酸甲酯

PG：D‑苯甘氨酸

7‑ACCA：7‑氨基‑3氯‑头孢烷酸

 （1）α‑氨基酸酯水解酶突变体Y175A 与野生型酶的酶溶液合成头孢氨苄S/H比对照实验

步骤1：底物溶液的准备

以0.1M，pH7.5磷酸‑氨水缓冲液溶解7‑ADCA使终浓度为30mM，磁力搅拌下缓慢滴加1M 氨水调节pH直至7‑ADCA完全溶解，加入15mM量的PGM，磁力搅拌溶解完全后，立刻以0.1M盐酸调节至pH6.0。最后以0.1M pH6.2磷酸‑氨水缓冲液定容。

步骤2：酶反应过程 

反应在25ml的锥形瓶中进行，加入底物溶液和酶溶液，酶的添加量为2U/ml反应体系。在30℃的水浴摇床中保温振荡。反应进行15min时，取出反应液用蒸馏水稀释20倍终止反应，再以HPLC流动相稀释5倍。

步骤3：HPLC法检测生成的头孢氨苄浓度和水解得到的PG浓度 

分析参数

分析柱：C18柱，4×250mm，

进样量：20ul

HPLC流动相：甲醇︰0.04M pH2.1磷酸‑氨水缓冲液=3︰7

检测波长：254nm

  V _s/V _h(头孢氨苄)

WT 1.3

Y175A 3.6

（2）α氨基酸酯水解酶野生型及突变体酶的固定化

固定化在100ml的锥形瓶中进行。纯化后的酶配置成80U/ml的酶溶液，向锥形瓶中依次加入20ml酶溶液，7克环氧基支持介质小球体，7.2ml 2.5M pH7.0 乙酸钠缓冲液。20℃下200rpm孵育48小时。固定化过程结束后，真空过滤并用0.1M pH6.5 乙酸钠缓冲液洗涤固定化酶。固定化酶的活力为130U/ml。

（3）突变体Y175A与野生型a‑氨基酸酯水解酶固定化后合成头孢克洛S/H比的对照实验 

步骤1：头孢克洛底物溶液的制备

以0.1M，pH7.5磷酸‑氨水缓冲液溶解7‑氨基‑3氯‑头孢烷酸（7‑ACCA）使终浓度为30mM，磁力搅拌下缓慢滴加1M 氨水调节pH直至7‑ACCA完全溶解，加入15mM量的PGM，磁力搅拌溶解完全后，立刻以0.1M盐酸调节至pH6.0。最后以0.1M pH6.2磷酸‑氨水缓冲液定容。

步骤2：催化合成头孢克洛 

分别将固定化的野生型酶和突变体酶加入反应底物溶液中，固定化酶的加量控制在20U/（ml反应液体积）左右。30℃下孵育30min后。离心分离固定化酶，取出上清液用蒸馏水稀释20倍终止反应，再以HPLC流动相稀释5倍。同实施例3步骤3测定检测生成的头孢克洛浓度和水解得到的PG浓度。

  V _s/V _h (头孢克洛

WT 0.8

Y175A 1.9

附图说明：

图1为重组质粒pET28a‑aehY175A。

大肠杆菌BL21(DE3)/pET28‑aehY175A的拉丁文名Escherichia coli，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No.4758。 

具体实施方式：

实施例1突变α‑氨基酸酯水解酶

步骤1：重组质粒pET28a‑aeh的制备

采用TaKaRa质粒小量提取试剂盒从携带重组质粒pET28a‑aeh的宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a‑aeh中提取重组质粒pET28a‑aeh。大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a‑aeh的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No.4757。

步骤2：引物设计 

正向5’GCATGATCGGTTCGTCCGCCGAGGGCTTCACCG3’

反向5’CGGTGAAGCCCTCAGCGGACGAACCGATCATGC3’

步骤3：反向PCR法制备突变体

在PCR仪中热循环扩增质粒DNA片段。采用步骤2所述的两个引物，它们各与扩增模板质粒DNA的欲突变位点相邻区域反向互补。

PCR反应体系： 

组分 体积(ul)

模板质粒 50ng/ul 1

10uM正向引物 1.5

10uM反向引物 1.5

10×缓冲液 5

2mM dNTPs 5

KOD plus 5U/ul 1

H ₂O 35

总体积 50

热循环仪中发生以下步骤：

1.94℃         2分钟

2.94℃         30秒

3.58℃         30秒

4.68℃         7.4分钟

5.2‑4步       ×15次

6. 72℃         10分钟

步骤4：限制性内切酶DpnI切割PCR产物。

向50ulPCR产物中加入2ul 10U/ul的DpnI，混匀，37℃孵育1h去除野生型质粒。 

步骤5：取5ul反应混合物转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）。 

经测序证实，所得突变体包含目的核苷酸序列。 

质粒pET28a‑aeh示于图1。 

实施例2 α‑氨基酸酯水解酶突变体纯化方法 

步骤1：无细胞裂解液的制备

过夜培养物转接入装有100ml NZCYM培养基（含卡那霉素）的500ml摇瓶。37℃，150rpm培养4小时。加入100mM IPTG，使终浓度为1mM。20℃，150rpm诱导20小时，收集菌体，按照《分子克隆实验指南》第15章方案7制备无细胞裂解液。步骤如下：

1 每100ml细胞培养物的细胞沉淀悬于4mlpH7.8的缓冲液（20mM 磷酸钠，500mM NaCl），

2加入溶菌酶至终浓度1mg/ml,冰上放置30min，

3混合物于4℃摇床上孵育10min，

4加入TritonX‑100,DNase,RNase, 终浓度分别为1%，5ug/ml和5ug/ml，再于4℃摇床上孵育10min，

5 4℃3000g离心30min，去除不溶性细胞碎片。上清即为无细胞裂解液。

步骤2：电泳纯酶溶液的制备 

用BIO BASIC 5ml Ni‑NTA  Sefinose 亲和柱纯化步骤1所得无细胞裂解液。分别用含有10mM、50mM咪唑的300mM NaCl，50 mMNaH₂PO₄  缓冲液洗涤和洗脱目的蛋白。将NPI50洗脱缓冲液得到的洗脱液合并。通过凝胶层析柱一步去除洗脱液中的无机盐及其他蛋白杂质。

序列表 

<110>叶丽娟 王辂 李端华 李进军 赵晨

<120>a‑氨基酸酯水解酶突变体

<160>2

<170>Patent In Version 3.3

<210>1

<211>1917

<212>DNA 

<213>大肠杆菌BL21（DE3）/pET28‑aeh Y175A

<400>1

atgcgccgca tcgctccctg cctgcccgcc  gccgccgtcg ccctcgccac caccggcgcc     60

gcgttcgccc agaccgcgcc gatgacgccg  gacatcaccg gcaagccgtt cgtcgcgccg    120

accgcggcca acgactacgt caagcgcgag  gtgatgatcc cgatgcgcga cggggtcaag    180

ctgcacacgg tgatcgtgct gcccaagggc  gcgcacggcg cgccgatcct gttgacccgc    240

acgccctacg acgccagcgg ccgcgccagc  cgcctggcct cgccgcacat gcgcgatctg    300

ctgccgcagg gcgacgaggt gttcgtcgac  ggcggctaca tccgggtgtt ccaggacatc    360

cgcggcaagt acggctcgga gggcgactat  gtggtgaccc ggccgctgcg cgggccgctc    420

aacccgacca aggtcgacca cgccaccgac  gcctgggaca ccatcgactg gctggtcaag    480

cacgtgcccg aatccaacgg caaggtcggc  atgatcggtt cgtccgccga gggcttcacc    540

gtggtgatgg cgctggccga tccgcacccg  gcgctgaagg tggccgcgcc ggaaagcccg    600

atgatcgacg gctggatggg cgacgactgg ctcaactacg  gcgccttccg ccaggtcaac    660

ctggactact tcaccgggca gatgacccgg  cgcggcaagg gcgagggcat cccgcgccag    720

ggctacgacg actacagcaa tttcctgcgc  gccggctcgg ccggcgacta cgccaaggcc    780

gccgggctgg agcagttgcc gtggtggcac  aagctcaccg agcacccggc ctacgatgcg    840

ttctggcagg agcaggcgct ggacaaggtg  atggcgcgca ccccgctgaa ggtgccgacg    900

atgtggctgc aggggctgtg ggaccaggaa  gacatgtggg gcgcgatcca cagctacgag    960

gcgatggagc cgcgcgacac cggcaacgac  aagaactacc tggtgatggg gccgtggcgg   1020

catagccagg tcaactacga gggcgcctcg  ctgggcgcgc tgcagttcga cggcgacacc   1080

gcgctgcagt tccgccgcga cgtgctcaag  ccgttcttcg accagtacct ggtcgatggc   1140

gcgcccaagg ccgacacccc gccggtgctg  atctacgaca ccggcgccaa ccactgggac   1200

cgcctgcagc gctggccgct gagctgcgcg  cagggctgcc cggcgcagag caagccgctg   1260

tacctggagg ccggcggccg cgtctcgttc  gaggcgccca aggccgggca gggcgagtac   1320

accgagtacg tgtccgaccc ggccaagccg  gtgccgttcg tgccgcgccc ggtggtgttc   1380

ggcgaccgcg acatgtggac cacctggctg  gtgcacgacc agcgcttcgt cgacgggcgc   1440

ccggacgtgc tgaccttcgt cagcgagccg  ctgcaggcgc cgctgcgcat cgccggcgcg   1500

ccgcaggtgc acctgcaggc ctccaccagc  ggcagcgaca gcgattgggt ggtgaagctg   1560

atcgacgtgt acccggacca gatggcctcc  gcgccgaagc tgggcggcta cgagctgccg   1620

gtgtcgctgg cgatcttccg cggccgctac  cgcgagagct tcgagcatcc ggcgccgctg   1680

accccgaacc agccgctggc ctacagcttc  ggcctgccca ccgccaacca caccttcgag   1740

cgcggccacc gggtgatggt gcaggtgcag  tccagcctgt tcccgctgta cgaccgcaat   1800

ccgcagacct acgtgcccaa catctacttc  gccaagccgg gcgattacca gaaggcgacg   1860

cagcggatct ggcacacgcc gcagcaggcc  agtttcatca gtctgccggt acattga      1917

<210> 2

<211>638

<212> PRT 

<213>大肠杆菌BL21（DE3）/pET28‑aeh Y175A

<400>  2

Met Arg Arg Ile Ala Pro Cys Leu Pro  Ala Ala Ala Val Ala Leu Ala 

1                5                     10                    15      

Thr Thr Gly Ala Ala Phe Ala Gln Thr  Ala Pro Met Thr Pro Asp Ile 

              20                   25                    30          

Thr Gly Lys Pro Phe Val Ala Pro Thr  Ala Ala Asn Asp Tyr Val Lys 

          35                   40                    45              

Arg Glu Val Met Ile Pro Met Arg Asp  Gly Val Lys Leu His Thr Val 

    50                    55                    60                  

Ile Val Leu Pro Lys Gly Ala His Gly  Ala Pro Ile Leu Leu Thr Arg 

65                   70                    75                   80  

Thr Pro Tyr Asp Ala Ser Gly Arg Ala  Ser Arg Leu Ala Ser Pro His 

                  85                   90                    95      

Met Arg Asp Leu Leu Pro Gln Gly Asp  Glu Val Phe Val Asp Gly Gly 

              100                   105                   110         

Tyr Ile Arg Val Phe Gln Asp Ile Arg  Gly Lys Tyr Gly Ser Glu Gly 

         115                  120                  125             

Asp Tyr Val Val Thr Arg Pro Leu Arg  Gly Pro Leu Asn Pro Thr Lys 

     130                  135                   140                 

Val Asp His Ala Thr Asp Ala Trp Asp  Thr Ile Asp Trp Leu Val Lys 

145                  150                   155                  160 

His Val Pro Glu Ser Asn Gly Lys Val  Gly Met Ile Gly Ser Ser Ala

                 165                   170                  175     

Glu Gly Phe Thr Val Val Met Ala Leu  Ala Asp Pro His Pro Ala Leu 

             180                   185                   190         

Lys Val Ala Ala Pro Glu Ser Pro Met  Ile Asp Gly Trp Met Gly Asp 

         195                  200                   205             

Asp Trp Leu Asn Tyr Gly Ala Phe Arg  Gln Val Asn Leu Asp Tyr Phe 

      210                  215                   220                 

Thr Gly Gln Met Thr Arg Arg Gly Lys  Gly Glu Gly Ile Pro Arg Gln 

225                   230                   235                  240 

Gly Tyr Asp Asp Tyr Ser Asn Phe Leu  Arg Ala Gly Ser Ala Gly Asp 

                  245                   250                  255     

Tyr Ala Lys Ala Ala Gly Leu Glu Gln  Leu Pro Trp Trp His Lys Leu 

             260                   265                   270         

Thr Glu His Pro Ala Tyr Asp Ala Phe  Trp Gln Glu Gln Ala Leu Asp 

         275                   280                   285             

Lys Val Met Ala Arg Thr Pro Leu Lys  Val Pro Thr Met Trp Leu Gln 

     290                   295                  300                 

Gly Leu Trp Asp Gln Glu Asp Met Trp  Gly Ala Ile His Ser Tyr Glu 

305                   310                   315                  320 

Ala Met Glu Pro Arg Asp Thr Gly Asn  Asp Lys Asn Tyr Leu Val Met 

                  325                   330                    335     

Gly Pro Trp Arg His Ser Gln Val Asn  Tyr Glu Gly Ala Ser Leu Gly 

             340                   345                   350         

Ala Leu Gln Phe Asp Gly Asp Thr Ala  Leu Gln Phe Arg Arg Asp Val 

          355                   360                   365             

Leu Lys Pro Phe Phe Asp Gln Tyr Leu  Val Asp Gly Ala Pro Lys Ala 

     370                    375                   380                 

Asp Thr Pro Pro Val Leu Ile Tyr Asp  Thr Gly Ala Asn His Trp Asp 

385                  390                   395                   400 

Arg Leu Gln Arg Trp Pro Leu Ser Cys  Ala Gln Gly Cys Pro Ala Gln 

                  405                   410                   415     

Ser Lys Pro Leu Tyr Leu Glu Ala Gly  Gly Arg Val Ser Phe Glu Ala 

             420                   425                  430         

Pro Lys Ala Gly Gln Gly Glu Tyr Thr  Glu Tyr Val Ser Asp Pro Ala 

         435                   440                  445             

Lys Pro Val Pro Phe Val Pro Arg Pro  Val Val Phe Gly Asp Arg Asp 

     450                  455                  460                 

Met Trp Thr Thr Trp Leu Val His Asp  Gln Arg Phe Val Asp Gly Arg 

465                   470                   475                  480 

Pro Asp Val Leu Thr Phe Val Ser Glu  Pro Leu Gln Ala Pro Leu Arg 

                  485                  490                   495     

Ile Ala Gly Ala Pro Gln Val His Leu  Gln Ala Ser Thr Ser Gly Ser 

            500                   505                  510         

Asp Ser Asp Trp Val Val Lys Leu Ile  Asp Val Tyr Pro Asp Gln Met 

         515                   520                  525             

Ala Ser Ala Pro Lys Leu Gly Gly Tyr  Glu Leu Pro Val Ser Leu Ala 

     530                   535                   540                 

Ile Phe Arg Gly Arg Tyr Arg Glu Ser  Phe Glu His Pro Ala Pro Leu 

545                  550                   555                  560 

Thr Pro Asn Gln Pro Leu Ala Tyr Ser  Phe Gly Leu Pro Thr Ala Asn 

                  565                  570                   575     

His Thr Phe Glu Arg Gly His Arg Val  Met Val Gln Val Gln Ser Ser 

              580                  585                   590         

Leu Phe Pro Leu Tyr Asp Arg Asn Pro  Gln Thr Tyr Val Pro Asn Ile 

         595                   600                   605             

Tyr Phe Ala Lys Pro Gly Asp Tyr Gln  Lys Ala Thr Gln Arg Ile Trp 

     610                   615                   620                 

His Thr Pro Gln Gln Ala Ser Phe Ile  Ser Leu Pro Val His 

625                  630                  635