一株贝莱斯芽孢杆菌及其菌剂与应用

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其菌剂与应用。

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

烟叶烘烤过程中常常发生烤坏烟，其中由米根霉(Rhizopus oryzae Went etGeerl.)引起的烟叶霉烂病(tobacco leaf mildew and rot)在各烟区日益严重，造成严重的经济损失。米根霉具有嗜高温的特性，烟叶上烤后24h之内(变黄排湿前期)叶柄开始发霉，烟叶变黄前期和中期是霉变期，烟叶叶柄和叶片上发生大量霉层。

烟草赤星病是烟叶成熟期为害最为严重的病害之一。烟叶烘烤前期，尤其是定期，高温高湿的环境，有利于赤星病菌的继续侵染，导致病斑不断扩大。赤星病菌的侵染会影响烟叶的化学成分，使总氮的含量升高，总糖、还原糖、淀粉含量降低，从而影响烟叶品质，降低烟叶使用价值。

目前，防治烟叶烘烤期间霉烂病的发生和病斑的扩大方法主要是喷施化学药剂，但极易造成农药残留超标，因此需要更安全环保的生物防治剂代替这些化学药剂。芽孢杆菌作为重要的生防菌株，对多种病原菌具有拮抗作用，已经得到广泛使用，尤其是芽孢杆菌具有很强的抗逆性，可在高温条件下正常存活生长，因此寻适宜的芽孢杆菌菌株用于烟叶霉烂病和烟草赤星病等植物病害的防治具有重要意义。

针对现有技术存在的不足，本发明提供一株贝莱斯芽孢杆菌及其菌剂与应用。本发明从健康烟草的根际土中筛选出一株对烟草赤星病等多种病原菌具有拮抗作用的生防菌——贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GY1，实验表明该菌可以有效防治烟叶霉烂病的发生并抑制叶斑在烘烤期间的进一步扩展。基于上述研究结果，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)GY1，该菌株已于2020年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.20537。

所述贝莱斯芽孢杆菌GY1的发酵物和代谢物也属于本发明的保护范围。

本发明的第二个方面，提供一种微生物菌剂，其含有如下任一种或多种：

1)贝莱斯芽孢杆菌GY1；

2)贝莱斯芽孢杆菌GY1的发酵物；

3)贝莱斯芽孢杆菌GY1的代谢物。

上述微生物菌剂具体可以是病原菌抑制剂或病害抑制剂。

本发明的第三个方面，上述贝莱斯芽孢杆菌GY1、贝莱斯芽孢杆菌GY1的发酵物和/或贝莱斯芽孢杆菌GY1的代谢物在如下1)-4)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：

1)在抑制病原菌中的应用；

2)在制备病原菌抑制剂中的应用；

3)在制备病害抑制剂中的应用；

4)在抑制病害中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种控制烘烤期烟叶霉烂病发生的方法，所述方法包括向烟叶喷施上述贝莱斯芽孢杆菌GY1、贝莱斯芽孢杆菌GY1的发酵物、贝莱斯芽孢杆菌GY1的代谢物、上述微生物菌剂、上述病原菌抑制剂和/或上述病害抑制剂。

本发明的第五个方面，提供一种控制烘烤期烟草赤星病病斑扩展的方法，所述方法包括向烟叶喷施上述贝莱斯芽孢杆菌GY1、贝莱斯芽孢杆菌GY1的发酵物、贝莱斯芽孢杆菌GY1的代谢物、上述微生物菌剂、上述病原菌抑制剂和/或上述病害抑制剂。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次筛选获得的贝莱斯芽孢杆菌GY1对农业生产发生严重的多种植物病原菌具有显著的拮抗作用，抑菌谱广，同时经试验证明，其能够有效控制烘烤期烟叶霉烂病发生及烟草赤星病病斑扩展，从而提升烟叶品质，提高烟叶使用价值，表明该菌株在植物病害的生物防治领域具有广阔的应用前景及良好的实际应用之价值。

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中菌株GY1对8种病原菌的拮抗作用平板图。

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

本发明的一个具体实施方式中，提供一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)GY1，该菌株已于2020年8月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCCNo.20537。

所述贝莱斯芽孢杆菌GY1的发酵物和代谢物也属于本发明的保护范围。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，其含有如下任一种或多种：

1)贝莱斯芽孢杆菌GY1；

2)贝莱斯芽孢杆菌GY1的发酵物；

3)贝莱斯芽孢杆菌GY1的代谢物。

本发明所述的代谢物包括菌体胞内代谢物和/或胞外代谢物。

术语“发酵物”用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养贝莱斯芽孢杆菌GY1的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液；液体可以含有细菌(菌体)，但并不必然需要含有细菌。液体优选的含有由本发明的贝莱斯芽孢杆菌GY1产生的代谢物。

本发明中，发酵培养选用的发酵培养基不做具体限定，在本发明的一个具体实施方式中，选用的发酵培养基为NB培养基。

所述NB培养基配方为(g/L)为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min。

以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为“上清液”，并且在本发明中，上清液内含有贝莱斯芽孢杆菌GY1的胞外代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该上清液。

以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离获取菌体，菌体可进行破碎获取菌体破碎物，破碎方式可以为超声(比如冰浴超声破碎细胞)或者本领域已知的其他手段，或者，更进一步的，对该菌体破碎物离心收集上清液，该上清液记为无细胞提取物，并且在本发明中，该菌体破碎物或无细胞提取物内含有贝莱斯芽孢杆菌GY1的胞内代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该菌体破碎物或无细胞提取物。

本发明的又一具体实施方式中，上述微生物菌剂具体可以是病原菌抑制剂或病害抑制剂。

本发明的又一具体实施方式中，上述病原菌抑制剂的活性成分可以是贝莱斯芽孢杆菌GY1、贝莱斯芽孢杆菌GY1的发酵物和/或贝莱斯芽孢杆菌GY1的代谢物。上述病原菌抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述病原菌抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病原菌的抑制效果确定。

本发明的又一具体实施方式中，上述病害抑制剂的活性成分可以是贝莱斯芽孢杆菌GY1、贝莱斯芽孢杆菌GY1的发酵物和/或贝莱斯芽孢杆菌GY1的代谢物，上述病害抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述病害抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。

本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。

本发明的又一具体实施方式中，所述载体可为固体载体或液体载体；

本发明的又一具体实施方式中，所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇或/和聚二醇；

本发明的又一具体实施方式中，所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷或/和十二烷。

本发明的又一具体实施方式中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

本发明的又一具体实施方式中，根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

本发明的又一具体实施方式中，上述贝莱斯芽孢杆菌GY1、贝莱斯芽孢杆菌GY1的发酵物和/或贝莱斯芽孢杆菌GY1的代谢物在如下1)-4)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：

1)在抑制病原菌中的应用；

2)在制备病原菌抑制剂中的应用；

3)在制备病害抑制剂中的应用；

4)在抑制病害中的应用。

上文中，所述病原菌可以为下述全部或部分病原菌：棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani Kuhn)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen)、花生镰刀病菌(Fusarium roseum Link)、葡萄病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)、番茄晚疫病菌(Phytophthora infestans(Mont.)De Bary)、烟草赤星病菌(Alterariaalternata)、烟叶霉烂病菌(Rhizopus oryzae Went et Geerl.)、小麦赤霉病菌(FusaHumgraminearum Sehw)和马铃薯枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schl.)。

上文中，所述病害可以为下述全部或部分病害：棉花立枯病、黄瓜枯萎病、花生镰刀病、葡萄病、番茄晚疫病、烟草赤星病、烟叶霉烂病、小麦赤霉病和马铃薯枯萎病。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种控制烘烤期烟叶霉烂病发生的方法，所述方法包括向烟叶喷施上述贝莱斯芽孢杆菌GY1、贝莱斯芽孢杆菌GY1的发酵物、贝莱斯芽孢杆菌GY1的代谢物、上述微生物菌剂、上述病原菌抑制剂和/或上述病害抑制剂。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种控制烘烤期烟草赤星病病斑扩展的方法，所述方法包括向烟叶喷施上述贝莱斯芽孢杆菌GY1、贝莱斯芽孢杆菌GY1的发酵物、贝莱斯芽孢杆菌GY1的代谢物、上述微生物菌剂、上述病原菌抑制剂和/或上述病害抑制剂。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

1材料与方法

1.1材料

供试生防菌：贝莱斯芽孢杆菌GY1；

供试病原菌：棉花立枯病、黄瓜枯萎病、花生镰刀病、葡萄病、番茄晚疫病、烟草赤星病、小麦赤霉病、马铃薯枯萎病病菌等8种病原菌；

烤烟品种：红花大金元；

烘烤方式：挂竿密集烘烤。

实验共设置3个处理，各处理如下：

处理1(菌株发酵液)：将菌株GY1接种于NB液体培养基中，置于28℃，180r/min恒温振荡培养箱中培养过夜。按1/100接种于NB发酵培养中，置于180r/min的恒温震荡培养箱中培养24h。

处理2(无菌发酵液)：上述所得发酵液在8000r/min的离心机中离心25min后收集上清，在无菌条件下使用0.22μm细菌过滤器过滤上清液除菌。

处理3(菌株悬液)：上述离心后沉淀用无菌水重悬至OD600＝1.0。

1.2方法

1.2.1拮抗试验

从-80℃冰箱中取出生防菌GY1，在不含抗生素的NA培养基上活化培养。28℃恒温培养箱静置培养至长出单菌落后，分别用无菌牙签挑取单菌落转移至NB液体培养基中，150r/min、28℃振荡培养，获得菌株GY1培养液。培养液4000×g离心5min收集菌体，弃上清。用无菌水进行重悬，调节OD600为0.1。

将棉花立枯病、黄瓜枯萎病、花生镰刀病、葡萄病、番茄晚疫病、烟草赤星病、小麦赤霉病、马铃薯枯萎病病菌等8种病原菌分别接种于PDA 平板中心，在距离平板中心2.5cm处均匀打4个孔，分别加OD600为0.1的GY1菌悬液和无菌水50μL，将平板转移至28℃恒温箱培养4d左右，观察抑菌效果。

1.2.2烟叶霉烂病防治试验

(1)将成熟的烟叶采摘后编在烟杆上，各处理试剂稀释15倍后，使用喷雾器对叶柄端部、叶背和叶面均匀喷洒，喷施量以叶片滴水为止，每个处理3杆烟，对照组喷施清水。

(2)将喷施后的烤烟在室外通风遮阴处晾制1-2个小时左右，散失多余的水分，避免人为增加烟叶水分。将处理好的烟叶放入烤房中，按照正常烘烤工艺进行烘烤。

(3)烘烤结束后，根据分级标准计算病情指数和防治效果。试验数据采用Excel、SAS软件进行统计和分析。

烟叶霉烂病分级标准：

0级，正常烟叶；

1级，叶柄发霉小于1cm，叶片不发病；

2级，叶柄发霉大于1cm，叶片不发病；

3级，叶柄发霉且叶片发霉面积在1％～25％；

4级，叶柄发霉且叶片发霉面积在26％～50％；

5级，叶柄发霉且叶片发霉面积在50％以上

1.2.3烟草赤星病防治试验

(1)用马克笔圈出烟叶上的赤星病病斑，每杆随机标记100个病斑。

(2)各处理试剂稀释15倍，使用喷雾器对叶柄端部、叶背和叶面均匀喷洒，喷施量以叶片滴水为止，每个处理喷施3杆烟，对照组喷施清水。

(3)将喷施后的烤烟在室外通风遮阴处晾制1-2个小时左右，散失多余的水分，避免人为增加烟叶水分。将处理好的烟叶放入烤房中，按照正常烘烤工艺进行烘烤。

(4)烘烤结束后，观察病斑大小变化并记录具体数目，计算防治效果，试验数据采用Excel、SAS软件进行统计和分析。

2结果

2.1拮抗试验

如图1所示，GY1对棉花立枯病、黄瓜枯萎病、花生镰刀病、葡萄病、番茄晚疫病、烟草赤星病、小麦赤霉病、马铃薯枯萎病等多种真菌病害的病原菌都有一定的抑制作用。

2.1烟叶霉烂病防治试验

表1不同处理对烟叶霉烂病的防治效果

注：同列数据后不同小写字母表示不同处理间在0.01水平有差异显著

试验结果表明，三种处理都能有效防治烘烤期烟叶霉烂病，明显降低病害的严重程度。菌株发酵液防治效果高达85.3％，优于无菌发酵液和菌株悬液。

2.2烟草赤星病防治试验

表2不同处理对烟草赤星病的防治效果

注：同列数据后不同小写字母表示不同处理间在0.01水平有差异显著

试验结果表明，三种处理都可以显著抑制烟草赤星病病斑在烘烤期间的进一步扩大，其中菌株发酵液的防治效果最好，防效为79.4％。无菌发酵液的防治效果也能达到69.8％。

3结论

贝莱斯芽孢杆菌GY1对多种病原菌表现出良好的拮抗作用，其发酵液、分泌物(无菌发酵液)和菌悬液都可以在一定程度上抑制烟叶霉烂病的发生和赤星病斑的扩展。其中，贝莱斯芽孢杆菌GY1发酵液对两者的防治效果最好，分别达到85.3％和79.4％。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。