南极来源的产低温几丁质酶菌株及其发酵方法

本发明属于微生物学、生物化学、发酵工程等领域，更具体地，本发明涉及一种假单胞菌属的南极海洋细菌，特别是一种产低温几丁质酶的菌株及其发酵方法研究。该发明的菌株生产的低温几丁质酶主要应用于发酵、医药、食品、农业等行业。

几丁质，又称甲壳素，是由N-乙酰葡萄糖胺单体以β-1,4糖苷键连接而成的直链多糖，广泛存在于甲壳动物外骨骼、昆虫体表、真菌细胞壁、藻类等生物体中，自然界中几丁质的存在量仅次于纤维素，是第二大可再生资源。几丁质根据其分子长链的排列方式可分为α型几丁质、β型几丁质和γ型几丁质。α型几丁质是主要的存在形式，由N-乙酰葡萄糖胺以反向平行的方式线性排列而成，β型几丁质是由两条同向平行链排列形成的，而γ型几丁质则是由3条链组成，两条同向，一条反向。

几丁质酶是一大类可水解几丁质的糖苷水解酶的统称。广泛存在于生物体中，如细菌、真菌、酵母、植物、放线菌、节肢动物和人类等。根据几丁质酶作用时的切割位点不同，可将几丁质酶分为内切几丁质酶和外切几丁质酶两大类。内切几丁质酶在几丁质内部随机切割，外切几丁质酶可催化几丁质从非还原性末端释放二乙酰壳二糖，以及可以分解内切几丁质酶产生的低聚物。

几丁质酶降解几丁质后得到的产物壳寡糖具有抗菌、调节凝血等功能，临床上可用于止血敷料。几丁质酶还具有抗真菌活性，在真菌性疾病时，可增加抗真菌药物的抗性或者作为杀虫剂和抗真菌剂应用于农业上。此外，几丁质酶还可用作食品防腐剂延长食品的保质期。

当几丁质酶被用于抑制病原微生物或昆虫时，由于微生物细胞壁或昆虫体表中存在的几丁质构型不同，往往需要具有不同底物特异性的几丁质酶来切割不同构型的几丁质。

不同几丁质酶生产菌株对于人工培养、发酵的适应性和要求不同，且产生的几丁质酶产物在性能上一般不相同，从而能够酶切的底物常常也存在不同。本领域的实践应用中，有的菌株产生的含酶产物尽管测定时有理论酶活但其却在实际应用方面不够理想，例如抑菌效果并不理想；也有的菌株产生的含酶产物当利用常规人工底物(通常链较短)测酶活时效果优异，但是当分解天然几丁质或胶体几丁质(通常为长链)时酶活则非常低。因此，本领域亟待筛选和开发高效生产几丁质酶、且所产生的含酶产物具有实际应用价值的菌株，确保其在更广泛的领域或更大的规模下被应用。

本发明的目的在于提供一种能生产低温几丁质酶的新菌种，并提供该菌种的分离培养和发酵方法。

在本发明的第一方面，提供一种经分离的几丁质酶生产菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2019207。

在一个优选例中，所述菌株为假单胞菌属(Pseudomonas sp)的菌株。

在另一优选例中，该菌株的16S rDNA全基因碱基序列如SEQ ID NO:1。

在另一优选例中，所述的几丁质酶是低温几丁质酶。

在另一优选例中，所述菌株为适应低盐环境或淡水环境的菌株。

在另一优选例中，所述的低盐为含盐量0～2％，较佳地低于1.5％，更佳地低于1％或低于0.5％。

在本发明的另一方面，提供所述的几丁质酶生产菌株的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其具有选自下组的特性：(a)含有几丁质酶；(b)水解几丁质；(c)具有抑制病原微生物或杀虫能力。

在本发明的另一方面，提供所述的几丁质酶生产菌株的应用，用于：(1)生产几丁质酶；或(2)制备细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其具有选自下组的特性：(a)含有几丁质酶；(b)水解几丁质；和/或(c)具有抑制病原微生物或杀虫能力。

在本发明的另一方面，提供所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的应用，用于抑制病原微生物或杀虫，或用于制备具有抑制病原微生物或杀虫能力的组合物。

在本发明的另一方面，提供一种组合物，其包含选自下组的成分：前面所述的几丁质酶生产菌株；或所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物。

在另一优选例中，所述的组合物包括但不限于：医药组合物、保健品组合物、食品组合物、农药学组合物、饲料组合物等。

在另一优选例中，所述的组合物还包含：工业学上可接受的载体，或微生物学上可接受的载体。

在本发明的另一方面，提供一种应用所述的几丁质酶生产菌株生产几丁质酶的方法，包括：在以下条件培养所述几丁质酶生产菌株：

在低盐或淡水中培养；

以葡萄糖、甘露糖或核糖作为碳源，较佳地以葡萄糖作为碳源；

以蛋白胨作为氮源；

添加5～20g/L几丁质；

添加0.2～5mM镁离子；

温度10～40℃、较佳地15～25℃、更佳地15～22℃；

pH6.2～7.5、较佳地pH6.5～7.3、更佳地pH6.5～7.2；

转速50～300rpm、较佳地100～250rpm、更佳地100～150rpm；

培养时间4～7天、较佳地5～6.5天。

在另一优选例中，所述的方法中，碳源葡萄糖的浓度为15±5g/L、较佳地15±2g/L；蛋白胨的浓度为1±0.5g/L、较佳地1±0.2g/L；几丁质的浓度为15±5g/L、较佳地15±2g/L；镁离子的浓度为1±0.5mM、较佳地1±0.2mM。

在本发明的另一方面，提供一种抑制病原微生物或杀虫的方法，所述方法包括：以所述的几丁质酶生产菌株的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物对需要抑制病原微生物或杀虫的对象进行处理。

在另一优选例中，所述的病原微生物包括(但不限于)：真菌；较佳地所述真菌包括(但不限于)：Verticillium dahlia CICC 2534，Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinumCICC 2532，Aspergillus niger CICC 2039，Penicillium macrosclerotiorum CICC40649。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

图1、Pseudomonas sp.GWSMS-1产酶时间曲线。

图2、Pseudomonas sp.GWSMS-1产几丁质酶的各种优化。

(a)氮源的优化考察；

(b)碳源的优化考察；

(c)氮源浓度的优化考察；

(d)碳源浓度的优化考察；

(e)几丁质浓度的优化考察；

(f)发酵pH的优化考察；

(g)发酵温度的优化考察；

(h)摇床转速的优化考察。

图3、几丁质酶粗酶性质。

(a)最适反应温度试验；

(b)温度稳定性试验；

(c)最适pH试验；

(d)pH稳定性试验。

图4、抗真菌实验结果图。

本发明人通过大规模筛选，获得了一株生产几丁质酶的菌株，称为Pseudomonassp.GWSMS-1(简称GWSMS-1)，保藏号为CCTCC NO:M2019207。本发明的菌株生产的几丁质酶，可在低温下生存，具有良好的低温活性。本发明人还通过进一步优化提高了该菌株的几丁质酶产量。本发明的GWSMS-1菌株及其培养物、代谢产物、培养上清或裂解产物具有很好的工业应用前景。

术语

如本文所用，术语“几丁质酶生产菌株”，“Pseudomonas sp.GWSMS-1”、“GWSMS-1”可互换使用，都指保藏号为CCTCC NO:M2019207的假单胞菌属的菌株。

如本文所用，术语“病原微生物”是指所述的有害微生物，所述有害微生物包括各种菌如细菌、真菌或放线菌等。

如本文所用，术语“杀虫”为杀/抑制有害昆虫或植食性昆虫，包括但不限于：甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、烟蚜、棉铃虫等。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

如本文所用，“工业学上可接受的载体”或“微生物学上可接受的载体”是用于将本发明的几丁质酶生产菌株或细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物传送给需要处理的对象的，在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害的溶剂、悬浮剂或赋形剂。所述载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持几丁质酶生产菌株或细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的活性的载体。

GWSMS-1菌株

本发明所述的GWSMS-1菌株分离自南极乔治王岛菲尔德斯半岛附近的海洋表层沉积物中，是本发明人经过广泛筛选后获得的。

本发明对所述GWSMS-1菌株进行鉴定：其16S rDNA全基因碱基序列如SEQ ID NO:1(1417bp)所示。该16S rDNA分析表明，因此该菌株是一种假单胞菌属的南极海洋细菌。

另一方面，当比较16S rDNA测序的结果时，本发明的菌株显示与其它假单胞菌属的菌株存在显著的共同点，但是也存在一些不同。基于所述不同，可以筛选鉴定出本发明菌株。同时，这种不同也可证明该菌株具有其自己的特异特征。

本发明人的研究结果显示，本发明的菌株产生的几丁质酶是低温几丁质酶，具有良好的低温下反应能力。

本发明的菌株是活体细胞，一旦获得了本发明的菌株，就可以用接种传代、再生等手段来大批量地获得本发明的菌株。这通常是将其接种到固体平板培养基或液体培养基中进行菌株的扩大培养而获得本发明的活体细胞。而获得的活体细胞可进一步进行实验室驯化、遗传育种和分子遗传操作等来获得突变体和转化子。此外，也可利用本发明的菌株作为异源表达的生物工程宿主细胞。

进一步地，本发明的高产几丁质酶的GWSMS-1菌株可作为出发菌株，通过实验室驯化、遗传育种、分子遗传操作等手段进行进一步改良而获得产量更高或酶系更为优化的衍生菌株。以本发明的GWSMS-1菌株作为出发菌株，通过这些人工操作手段进一步筛选优化获得的菌株，也应被包含在本发明的整体范围内。

本领域的技术人员熟知的方法能用于诱变本发明的活体菌株，而造成活体细胞的基因编码改变、酶活特性和形态学上的改变。这些方法包括利用射线、粒子、激光、紫外光等物理方法，利用烷化剂、碱基类似物(base analog)、羟胺(hydroxylamine)、吖啶素等化学诱变方法。诱变可是以上一种方法或多种方法的多代诱变，且不限于这些方法。基于本发明提供的菌株，可以进一步进行物理化学等方式进行育种，也可以导入新的几丁质酶基因和相关调控基因，获得的突变体和转化子产酶性能可获得进一步提高，所述的育种方法为上述的一种或一种以上相结合。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建表达构建物(载体)和进一步改造本发明菌株。例如，对于菌株中已发现或新发现的与几丁质酶生产相关的信号途径、信号通路及其中涉及的蛋白进行进一步的改良(例如增加有益因子的表达，减少有害因子的表达)。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。所用的步骤在本领域众所周知。

现有技术中不少来自于海洋的菌株，均需要在高盐的培养环境下(如海水环境)生长，这就限制了其应用。高盐发酵液往往腐蚀性强，使得发酵罐被腐蚀而难以长期应用。而本发明的菌株尽管来自于海洋表层沉积物，却能够适应低盐或淡水环境，这出乎本发明人的意料；同时由于这一特性，本发明的菌株能够适应于发酵罐规模或工业规模的生产。

细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物

在获得了所述的GWSMS-1菌株的基础上，本发明还提供了所述的几丁质酶生产菌株的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，其具有选自下组的特性：含有几丁质酶，水解几丁质和/或具有抑制病原微生物或杀虫能力。

在获得了本发明的菌株后，本领域技术人员可以方便地获得其培养培养物，例如可参考本发明具体实施例中提供的一些培养基或培养工艺、或利用与本发明的实施例中存在适当改变但也能获得培养物的培养基或培养工艺，从而获得细胞培养物。所述的细胞培养物中含有活性菌株，从而产生几丁质酶、水解几丁质酶或直接发挥抑制病原微生物或杀虫的作用。

所述的细胞代谢产物，是本发明的菌株在培养过程中产生或分泌的一类物质，其可以是由细胞直接分泌到培养基中，或者经过一定处理后被与细胞分离。所述的细胞产物可被分离、纯化或浓缩。

所述的细胞培养上清，是在培养本发明的菌株的过程或培养结束后，去除细胞以及固体杂质后，剩余的培养液，其可以是未经浓缩或浓缩的。通常，细胞以及固体杂质可以通过诸如离心、过滤等方式被排除。

所述的细胞裂解产物，是在培养本发明的菌株的过程或培养结束后，利用裂解细胞的试剂来裂解细胞，从而构成的混合物。所述的细胞裂解产物可以是在裂解后去除了固体杂质后的产物。根据需要，其可以是经纯化的或经浓缩的产物。

应用及生产工艺

本发明还提供了所述的几丁质酶生产菌株的应用，用于：生产几丁质酶，或用于制备所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，后者可用于抑制病原微生物或杀虫，或用于制备具有抑制病原微生物或杀虫能力的组合物。

为了更好地应用所述的几丁质酶生产菌株GWSMS-1菌株生产几丁质酶，本发明还优化了生产工艺，考虑的范围包括各种培养条件、培养基的各种组分等。最终确定了一些对于该菌株的培养以及产酶量具有较大影响的因素。

多种碳源可以被应用于培养本发明的菌株，但是本发明人发现，碳源的选择对于GWSMS-1菌株的产酶量/几丁质酶酶活具有影响。因此，作为本发明的优选方式，以葡萄糖、甘露糖或核糖作为碳源，较佳地以葡萄糖作为碳源。在进一步优选的方式中，碳源葡萄糖的浓度为15±5g/L，较佳地15±2g/L。

多种氮源可以被应用于培养本发明的菌株，但本发明人也发现，不同的氮源对于GWSMS-1菌株的产酶量/几丁质酶酶活具有影响，其中蛋白胨具有显著性的优势。因此，作为本发明的优选方式，以蛋白胨作为氮源。在进一步优选的方式中，蛋白胨的浓度为1±0.5g/L、较佳地1±0.2g/L。

除了碳源和氮源，本发明人也优化了其它的培养基组分，发现几丁质和镁离子的适当用量有利于提高产酶量/酶活性。因此在本发明的优选方式中，添加5～20g/L几丁质，较佳地15±5g/L，更佳地15±2g/L；添加0.2～5mM镁离子1±0.5mM，较佳地1±0.2mM。

本发明人发现，菌株的培养时间并非越长越好，而是存在着波动。在本发明的优选方式中，培养时间4～7天、较佳地5～6.5天。

作为本发明的优选方式，培养所述的菌株的温度10～40℃、较佳地15～25℃、更佳地15～22℃。培养所述的菌株的pH6.2～7.5、较佳地pH6.5～7.3、更佳地pH6.5～7.2。培养所述的菌株的转速50～300rpm、较佳地100～250rpm、更佳地100～150rpm。

本发明的GWSMS-1菌株可以实现长期生长和稳定传代。应用于培养本发明的GWSMS-1菌株的培养基和培养方法并不限于以上公布的那些，其它常规应用于培养假单胞菌的培养基和培养方法也可以应用于本发明中。可以理解的是，上述各种培养基组分可能可被功能类似的其它组分替换，在不同的情形下也可根据特定菌株的特性适当添加其它组分或去除其中的部分组分或改变其中部分组分的含量。

本发明所述的培养体系或发酵体系可以进行体系放大以进行工业生产，根据体系的大小不同，本领域技术人员根据所掌握的一般知识可以进行适当的调整以有利于菌株的生长或生产。

本发明也提供了一种抑制病原微生物或杀虫的方法，包括以所述的几丁质酶生产菌株的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物对需要抑制病原微生物或杀虫的对象进行处理。

本发明获得高产菌株，几丁质酶的活性得到了显著提升，在提高几丁质酶制剂的水解效率方面有着十分明显的作用，将大大降低其生产成本，有着更为广泛的工业应用潜力。

组合物

本发明还提供了一种组合物，其包含本发明所述的几丁质酶生产菌株。或者，所述组合物包括所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物。所述的组合物包括但不限于：医药组合物、保健品组合物、食品组合物、农药学组合物、饲料组合物等。

除了本发明的几丁质酶生产菌株或所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物，所述的组合物中还可包括：工业学上可接受的载体，或微生物学上可接受的载体。

通常，所用的几丁质酶生产菌株或所述的细胞培养物、细胞代谢产物、细胞培养上清或细胞裂解产物的有效剂量可随施用的模式或待处理对象的情况而变化。在本发明中，“有效量”是指可对需要处理的对象产生功能或活性的且可被需要处理的对象所接受的量，一般为在毒性、副作用方面可控的、环境友好或对人畜无害的量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、菌株的分离及鉴定

本发明人经过长期筛选及反复研究，获得一株新型菌株，为低温几丁质酶生产菌株，该菌株分离自南极乔治王岛菲尔德斯半岛附近的海洋表层沉积物中。

经16S rDNA分析表明，该菌株属于假单胞菌属，命名为Pseudomonas sp.GWSMS-1(简称为GWSMS-1)，本发明人将之保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2019207。

所述生产低温几丁质酶菌株GWSMS-1菌株的16S rDNA全基因碱基序列如下所示(SEQ ID NO:1；1417bp)：

TGCAAGTCGAGCGGTAGAGAGAAGCTTGCTTCCTCTTGAGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTAGTGGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCCATTAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTAGTAACTTAATACGTTGCTACTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGTAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGCTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTAGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTACCTGGACTGGTACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGGAGTCTTGAACTCTTAGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCTAGAGATAGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGTAGTGGGTTGCACCAGTAAGTAGCTAAGTCTAAACCCTCGGGAGGACGGTACCACGGTG

实施例2、GWSMS-1菌株的培养基及培养条件的初步优化

本实施例中，本发明人针对GWSMS-1菌株，优化其培养方法，以促进该菌稳定及发酵生产低温几丁质酶。

1、材料与方法

(1)基础培养基

蛋白胨2g/L，葡萄糖1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，KH2PO40.3g/L，K2HPO4·7H2O 0.917g/L，胶体几丁质5g/L，用超纯水(Millipore纯水机制备)定容至1L。

培养方法：培养基500mL，以1％的接种量将实施例1的菌株加入到培养基中，发酵温度为25℃，pH值为7.0，转速为200rpm。

(2)几丁质酶活性测定

1)β-N-乙酰葡萄糖胺标准曲线绘制

a.称取0.5g铁溶于0.5M Na2CO3溶液后于棕瓶中避光保存，即为铁试剂。

b.称取β-N-乙酰葡萄糖胺溶于蒸馏水中，分别配置成浓度为0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.40mmol/L的标准溶液。

c.分别取0.05mLβ-N-乙酰葡萄糖胺标准溶液，加入0.45mL蒸馏水和1mL铁试剂，混匀封口后立即于100℃水浴15min；冷却至室温后，测量其在波长420nm处的吸光值，以蒸馏水作为空白对照。最后以吸光度值为纵坐标，以β-N-乙酰葡萄糖胺的浓度为横坐标，绘制β-N-乙酰葡萄糖胺标准曲线。

2)酶活性测定方法

a.1mL发酵液，于4℃，10000g离心5min，收集上清即为粗酶液。

b.取0.1mL粗酶液加入1mL胶体几丁质底物溶液(pH 6.0，50mM磷酸缓冲液中含1％的胶体几丁质)，混匀后于30℃反应2h，反应液于100℃水浴处理5min失活几丁质酶，酶和底物混合后直接于100℃水浴5min作为空白对照。

c.反应液于10000g离心5min，取上清液0.05mL，加入0.45mL蒸馏水和1mL铁试剂，混匀封口后于100℃水浴15min；冷却至室温后测量其在420nm处的吸光值，根据β-N-乙酰葡萄糖胺标准曲线计算生成的β-N-乙酰葡萄糖胺的量并换算成酶活，所有试验设置3组重复。

d.几丁质酶活力单位定义为，在30℃条件下，pH 6.0的50mM磷酸盐缓冲液体系中，催化几丁质反应每分钟生成1μmol N-乙酰-D-葡萄糖胺所需的酶量定义为1U。

2、原料及培养条件优化

本发明人经过对培养原料以及培养条件的综合考虑，将优化的原料及条件聚集于包括以下的方面：培养基的碳源、氮源、碳源浓度、氮源浓度、胶体几丁质浓度以及发酵时间、初始pH、温度和摇床转速(表1)。所有试验设置三次重复。

表1

2、结果

(1)产酶时间的优化考察

以本实施例材料和方法第(1)项中所述的方法进行培养，在不同的时间点上，考察GWSMS-1菌株产生的几丁质酶的酶活性。考察的时间点为发酵起始后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。

结果见图1，GWSMS-1发酵培养24小时之后能够检测到几丁质酶活性，在培养起始后的第4～7天酶活性相对较高，当培养时间为第6天时，几丁质酶活性达到最高，约为15.00U/L。

(2)氮源的优化考察

以本实施例材料和方法第(1)项中所述的方法进行培养，不同点在于对其中的氮源进行替换，考察应用不同的氮源时，发酵结果的变化。

分别以KNO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、CH3COONH4、蛋白胨为氮源进行发酵培养实验。

结果见图2(a)，结果显示，与对照组(CK)(不添加氮源相比，运用蛋白胨能够显著提高几丁质酶活性，因此蛋白胨为相对优选的氮源。

(3)碳源的优化考察

以本实施例材料和方法第(1)项中所述的方法进行培养，不同点在于对其中的碳源进行替换，考察应用不同的碳源时，发酵结果的变化。

分别以核糖、蔗糖、果糖、淀粉、麦芽糖、葡萄糖、甘油、甘露糖为碳源进行发酵培养实验。

结果见图2(b)，结果显示，与对照组(CK)(不添加其他碳源，仅以基础培养基中的胶体几丁质为唯一碳源)相比，运用葡萄糖、甘露糖、核糖均能够显著提高几丁质酶活性(即提高产酶量)，而其中以葡萄糖为相对更优选的碳源。

(4)氮源浓度的优化考察

以本实施例材料和方法第(1)项中所述的方法进行培养，并以蛋白胨作为氮源，对其中的蛋白胨浓度进行调整，考察在不同的蛋白胨浓度下，几丁质酶活性的变化。其中，蛋白胨浓度分别设置为0、1、2、3、4、5或10g/L。

结果见图2c，与对照组(CK)(不添加蛋白胨，葡萄糖浓度设置为10g/L)相比，在1～10g/L的浓度范围内，蛋白胨的添加均能显著地提高几丁质酶活性，其中当培养基中蛋白胨浓度为2g/L时，酶活性高(即产酶量高)。因此，兼顾成本，蛋白胨浓度为1～2g/L是相对优选的。

(5)碳源浓度的优化考察

以本实施例材料和方法第(1)项中所述的方法进行培养，并以葡萄糖作为碳源，对其中的葡萄糖浓度进行调整，考察在不同的葡萄糖浓度下，几丁质酶活性的变化。其中，葡萄糖浓度分别设置为0、5、10、15或20g/L。

结果见图2d，与对照组(CK)(不添加葡萄糖)相比，在5～15g/L的浓度范围内，葡萄糖的添加均能显著地提高几丁质酶活性，其中当培养基中葡萄糖浓度为10g/L时，酶活性高(即产酶量高)。

(6)几丁质浓度的优化考察

以本实施例材料和方法第(1)项中所述的方法进行培养，对其中的几丁质浓度进行调整，考察在不同的几丁质浓度下，几丁质酶活性的变化。其中，几丁质浓度分别设置为0、5、10、15或20g/L。

结果见图2e，与对照组(CK)(不添加胶体几丁质)相比，在5～20g/L的浓度范围内，几丁质的添加均能显著地提高几丁质酶活性，其中当培养基中几丁质浓度为10～20g/L时，酶活性高(即产酶量高)。

(7)发酵pH的优化考察

以本实施例材料和方法第(1)项中所述的方法进行培养，对培养基初始pH值进行调整，考察在不同pH下，几丁质酶活性的变化。其中，初始pH分别设置为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0或9.0。

结果见图2f，在初始pH6.5～7.5的范围内，几丁质酶具有一定的活性，其中培养基初始pH为7.0时，酶活性相对最高(即产酶量相对最高)。

(8)发酵温度的优化考察

以本实施例材料和方法第(1)项中所述的方法进行培养，对培养过程中的发酵温度进行调整，考察在不同温度下，几丁质酶活性的变化。其中，温度分别设置为15、20、25、30、35或40℃。

结果见图2g，在温度15～40℃进行培养，几丁质酶具有一定的活性，其中温度为15～20℃时，特别是20℃时，酶活性相对理想(即产酶量相对理想)。

(9)摇床转速的优化考察

以本实施例材料和方法第(1)项中所述的方法进行培养，对培养过程中的转速进行调整，考察在不同转速下，几丁质酶活性的变化。其中，转速分别设置为100、150、200、250rpm。

结果见图2h，在转速100～250rpm进行培养，几丁质酶具有一定的活性，其中转速为100～150rpm时，特别是150rpm时，酶活性相对理想(即产酶量相对理想)。

实施例3、GWSMS-1菌株的培养基培养条件的进一步优化

本实施例中，本发明人针对GWSMS-1菌株，进一步优化其培养方法，以进一步促进该菌稳定发酵及生产低温几丁质酶。

1、材料与方法

根据实施例2的研究结果，对培养基成分作进一步优化。

(1)基础培养基

基础培养基：葡萄糖5-15g/L，蛋白胨1-3g/L，胶体几丁质5-15g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4·7H2O 0.917g/L，MgSO4·7H2O 1-10mM，用超纯水(Millipore纯水机制备)定容至1L。

培养方法：培养基500mL，以1％的接种量将实施例1的菌株加入到培养基中，发酵温度为20℃，pH值为7.0，转速为150rpm，培养时间为6天。

几丁质酶的酶活测定方法同前述实施例2。

综合考虑前述研究结果，本发明人将优化的原料聚集于包括以下的方面：葡萄糖、蛋白胨、胶体几丁质、镁离子。实验设计如表2。

表2

2、结果

实验结果如表3。

表3

结果表明，蛋白胨和胶体几丁质的浓度对几丁质酶活性影响较大，当葡萄糖、蛋白胨、胶体几丁质和镁离子浓度分别为15g/L、1g/L、15g/L和1mM时酶产量最高，发酵液中几丁质酶活力为95.41U/L，比未优化的酶活提高了约6.4倍。

实施例4、几丁质酶性质

本实施例中，测定由本发明的GWSMS-1菌株产生的几丁质酶的性质。

发酵培养基：葡萄糖15g/L，蛋白胨1g/L，胶体几丁质15g/L，KH2PO4 0.3g/L，K2HPO4·7H2O 0.917g/L，MgSO4·7H2O 1mM，用超纯水(Millipore纯水机制备)定容至1L。

培养条件：培养基500mL，以1％的接种量将实施例1的菌株加入到发酵培养基中，发酵温度为20℃，pH值为7.0，转速为150rpm，培养时间为6天。

粗酶液的制备：发酵液于8000g离心10min收集上清，经0.22μm滤器过滤除菌后用于酶学性质的测定。

1、最适反应温度

在0～80℃范围内，每间隔5℃测定粗酶液的几丁质酶活性。

Pseudomonas sp.GWSMS-1的几丁质酶粗酶的最适反应温度为35℃，在0℃时的活性仍保持在其最适温度条件下活性的50％以上，显示出了良好的低温活性。

2、温度稳定性

在0～80℃范围内，将粗酶液置于间隔5℃条件下温浴30分钟后，于35℃测定其几丁质酶活性。

温度稳定性实验也表明，该酶是一个典型的低温酶，即该酶仅在低温下稳定，随着温度升高活性逐渐降低。

3、最适pH和pH稳定性

测试最适pH：在pH 2.5～11范围内，每间隔0.5个pH单位测定粗酶液的几丁质酶活性。

测试pH稳定性：在pH 2.5～11范围内，将粗酶液置于间隔0.5个pH单位条件下于4℃处理30分钟后，于35℃测定其几丁质酶活性。

该酶的最适反应pH和pH稳定性结果表明，该酶是一个酸性酶，其最适反应pH为4.5且仅在pH 4.0～5.0范围内稳定，如图3。

实施例5、抗真菌实验

1、材料与方法

(1)发酵培养基

同实施例4

(2)粗酶液的制备

发酵液于8000g离心10min收集上清，使用10kDa的超滤管浓缩，500mL发酵液浓缩之后得到5mL发酵液，经0.22μm的滤器过滤除菌后用于后续实验。

(3)抗真菌实验

将直径为6mm的滤纸片浸泡于浓缩粗酶液中5min，用直径为0.5cm的打孔器打取菌盘，接种到新的具有PDA培养基的培养皿的中央位置；然后在菌盘中央处放1片浸泡好的滤纸片，在20℃培养后观察抑制情况，培养期间，每间隔2个小时在滤纸片上滴加一次实验溶液。

(4)真菌供试菌株

Verticillium dahlia CICC 2534(大丽花轮枝孢)；Alternaria brassicicolaCICC 2646(芸薹生链格孢)；Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum CICC2532(尖孢镰孢黄瓜专化型)；Aspergillus niger CICC 2039(黑曲霉)；Penicillium macrosclerotiorumCICC 40649(大核青霉)。

2、结果

如图4，该几丁质酶可以显著抑制植物病原真菌Verticillium dahlia CICC2534、Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum CICC 2532，对Aspergillus niger CICC 2039和Penicillium macrosclerotiorum CICC 40649也有一定抑制作用，而对于Alternariabrassicicola CICC 2646没有表现出抑制作用。

Verticillium dahlia CICC 2534和Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinumCICC 2532分别可以引起棉花黄萎病和黄瓜枯萎病，这表明本发明的菌株(Pseudomonassp.GWSMS-1)及其发酵的粗酶液有应用于上述两种植物病害的生物防治的潜力。

生物材料的保藏

本发明的菌株(Pseudomonas sp.GWSMS-1)已在中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)保藏，保藏日期：2019年3月27日，其保藏编号为CCTCC NO:M2019207。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国极地研究中心(中国极地研究所)

<120> 南极来源的产低温几丁质酶菌株及其发酵方法

<130> 194842

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1417

<212> DNA

<213> 假单胞菌属(Pseudomonas sp)

<400> 1

tgcaagtcga gcggtagaga gaagcttgct tcctcttgag agcggcggac gggtgagtaa 60

tgcctaggaa tctgcctagt ggtgggggat aacgttcgga aacggacgct aataccgcat 120

acgtcctacg ggagaaagcg ggggaccttc gggcctcgcg ccattagatg agcctaggtc 180

ggattagcta gttggtgagg taatggctca ccaaggctac gatccgtaac tggtctgaga 240

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tcgaagcaac gcgaagaacc ttacctggcc ttgacatgct gagaactttc tagagataga 960

ttggtgcctt cgggaactca gacacaggtg ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga 1020

gatgttgggt taagtcccgt aacgagcgca acccttgtcc ttagttacca gcacgtaatg 1080

gtgggaactc taaggagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt 1140

catcatggcc cttacggcca gggctacaca cgtgctacaa tggtcggtac aaagggttgc 1200

caagccgcga ggtggagcta atcccataaa accgatcgta gtccggatcg cagtctgcaa 1260

ctcgactgcg tgaagtcgga atcgctagta atcgtgaatc agaatgtcac ggtgaatacg 1320

ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggta gtgggttgca ccagtaagta 1380

gctaagtcta aaccctcggg aggacggtac cacggtg 1417